《HPGT 基因在毕赤酵母中的表达研究.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HPGT 基因在毕赤酵母中的表达研究.doc（8页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、精品论文HPGT 基因在毕赤酵母中的表达研究徐婧，王宗瑞，赵广荣（天津大学化工学院制药工程系，系统生物工程教育部重点实验室，天津300072）5摘要：D-对羟基苯甘氨酸是 -内酰胺类抗生素药物重要的侧链，D-羟基苯甘氨酸转氨酶（HPGT）是 D-对羟基苯甘氨酸全生物合成途径中最为关键的构型决定酶。本实验构建了大 肠杆菌-毕赤酵母穿梭载体 pPIC9K-HPGT，将其整合至毕赤酵母染色体，进行了发酵实验，测定转化率和酶的活性。结果表明，毕赤酵母实现了 HPGT 的有活性分泌表达,能将底物转10化为 D-对羟基苯甘氨酸,为进一步在酵母中全合成的改造奠定了基础。关键词：合成生物学；D-对羟基苯甘氨酸
2、；HPGT；毕赤酵母；分泌表达；中图分类号：Q74Expression of the HPGT gene in Pichia15XU Jing, WANG Zongrui, ZHAO Guangrong(Key Laboratory of System Bioengineering, Ministry of Education,Department of PharmaceuticalEngineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin300072)Abstract: -La
3、ctam is one of the most widely used antibiotics. D-hydroxyphenylglycine is an20important side chain of -Lactam and it has a vital influence to the drug effect and survivability.The key in biosythesis of D-hydroxyphenylglycine is the configuration decision enzyme-the Hydroxyphenylglycine transaminase
4、 (HPGT). This experiment constructed the shuttle vector pPIC9K-HPGT of E. coli and Pichia. After that, we integrated the shuttle vector pPIC9K-HPGT into the Pichia chromosome so as to realize its secretory expression. Finally we conducted25fermentation of the Pichia which has been integrated with th
5、e pPIC9K-HPGT and assayed the enzyme activity and conversion rate. Statistics shows that the Pichia realized the active secretory expression of HPGT, which lay the foundation for the further research of HPGT.Key words: Synthetic Biology；D-Hydroxyphenylglycine；HPGT；Pichia；Secretory expression300引言D-对
6、羟基苯甘氨酸转氨酶 HPGT1-4是催化对羟基苯乙醛酸转化为 D-对羟基苯甘氨酸5-9 或苯乙醛酸转化为 D-苯甘氨酸途径中的一个构型决定酶，表达状况的好坏和酶活性的高低， 直接决定着最终产品合成的质量和产量，而自然界中对羟基苯甘氨酸多以 L 个构型存在， 因此 HPGT 对 D 构型10产物的合成有重要的意义。HPGT 基因长 1326bp，编码 442 个氨基35酸，研究证实 SDS-PAGE 验证纯化后的编码蛋白约 47kd。目前实验研究中所用 HPGT 基因 多取自恶臭假单胞杆菌 LW-411，利用分子生物学手段克隆至克隆载体或表达载体，进行进 一步的优化和表达。巴斯德毕赤酵母是目前广
7、泛使用的最优秀的基因表达系统之一，它具有表达率高、遗传 稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟以及蛋白加工、折叠、翻译后修饰等高等真核表达系统的40优点，并且操作和大肠杆菌、酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其他 真核表达系统更简单快捷，并且表达水平更高。毕赤酵母表达宿主菌12于 80 年代初开发获 得，大多应用的宿主菌是通过对野生型石油酵母 Y11430 进行突变改造而来。在组氨酸脱氢基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20090032110015)作者简介：徐婧（1989-），女，研究生，主要研究方向是生物制药工程通信联系人：赵广荣（1964-），男，教授，主要研究方向：合成
8、生物学与天然产物制药工程. E-mail:- 5 -酶基因（his）处有一突变，用于转化后重组菌株。其他的一些营养缺陷型宿主菌或者生物合成基因也可作为筛选标记。目前最主要的毕赤酵母表达宿主菌有 3 种。他们的区别在于45AOX 一个或者两个基因的缺失造成对甲醇利用能力高低的变化。最常用的宿主菌为 GS115（his4）13，它含有 AOX1 和 AOX2 基因，在含有甲醇的培养基上以野生型速率生长。目 前使用最广泛的是由 Cregg 1985 年建立的 GS11514。本实验采用合成生物学原理，通过密码子优化全合成 HPGT 基因，构建 HPGT 大肠杆 菌和毕赤酵母表达载体，转化毕赤酵母，进
9、行分泌表达优化，在蛋白水平研究 HPGT 基因50的表达和功能。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种与质粒L21（DE3）、pPic9k 和 Puc18 为本实验室保存， Pichia GS115、pPic9k-HPGT 和 Pichia55GS115-HPGT 为本实验构建保存，pUC18-HPGT 为奥科公司合成。1.1.2主要试剂TaqDNA 聚合酶、pfuDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker、凝胶纯化试剂盒、 PCR&酶切纯化试剂盒均购自全式金生物技术有限公司；dNTP mixture 购自润泰生物科技有 限公司；限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；去磷酸
10、化酶由 Ferments 公司购入；60卡纳霉素和氨苄青霉素均购自鼎国生物技术有限公司。1.1.3溶液与缓冲液10YNB(13.4%)，500B(0.02%生物素)，100H(0.4%组氨酸)，10D(20%葡萄糖)，10M(5%甲醇)，10GY(10%甘油)。TE 缓冲液，TAE 电泳缓冲液，裂解液，裂解液，裂解液，磷酸钾缓冲液，山梨65醇缓冲液。1.1.4培养基本实验使用了 LB 液体培养基，LB 固体培养基，YPD 固体培养基，MDH 固体培养基，MD 固体培养基，BMMY 液体培养基，BMGY 液体培养基和 MM 固体培养基。1.2 方法701.2.1pPic9K-HPGT 的构建根据
11、密码子偏好性，对恶臭芽孢杆菌 LW-4 中 HPGT 基因进行优化，送至奥克公司进行 全合成，并克隆在 pUC18 质粒上。以 pUC18-HPGT 为模板进行 PCR 扩增反应，以获得 HPGT 片段。用碱裂解法提取质粒，用内切酶 EcoR对质粒分别进行酶切，再用去磷酸化酶对 pPIC9K 酶切产物进行去磷酸化 10min，凝胶纯化回收。将 HPGT 片段与 pPIC9K 酶切片段75连接转化至大肠杆菌 BL21(DE3)。为了较快验证阳性转化子，挑取适量菌落进行菌落 PCR验证（PCR 体系如表 1）。80表 1：菌落 PCR 扩增体系PCR 体系反应条件5buffer10L模板 pUC1
12、8-HPGT1L95 5 min上游引物1L95 30s下游引物1L56 30sdNTP5L72 1minddH2O29.5L72 10minPfu 酶2.5LTable1: Colony PCR Amplification System for pUC-HPGT30 循环1.2.2毕赤酵母 GS115-pPic9k-HPGT 的构建按照毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒说明中的方法制备毕赤酵母 GS11514感受态细胞。85将毕赤酵母感受态细胞与用 Sac线性化的 pPic9k-HPGT（溶于 5-10ulTE）混合，转入预冷 的 0.2cm 电转杯中，在 1500V 下进行电击，电击时间约 4m
13、s，立即加入 1ml 预冷的 1M 山梨 醇，涂布 MD 平板。为了较快筛选出阳性克隆 GS115-HPGT，挑取适量的电转长出来的菌落进 行菌落 PCR 验证（PCR 体系如表 2）。表 2：毕赤酵母菌落 PCR 体系15PCR 体系PCR 条件10taq buffer：2.0LdNTP：2.0L95 5 min模版 DNA:2.0L95 30 s上游引物：0.2 L56 30s下游引物0.2 L72 2minddH2O:13.4L72 10mintaq 酶:0.2L90Table2:Colony PCR Amplification System for Pichia30 循环951001.
14、2.3毕赤酵母 GS115-pPic9K-HPGT 分泌表达挑取构建成功的毕赤酵母 GS115-HPGT 单克隆，接种至 BMGY 培养基中培养至OD600=2-6(约 16-18 小时)，再将菌液移至 BMMY 培养基中进行诱导表达，每隔 24 小时，取1ml 菌液样品，加甲醇至终浓度 0.5%，直至达到最佳诱导时间。由于毕赤酵母外源表达 HPGT，因此将菌液样品离心，保留上清。将上清中加入 5蛋白电泳上样缓冲液，于 95。C 加热 5min，进行 12% SDS-PAGE。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色。分别向对照菌和有 HPGT 分泌表达菌株的发酵瓶中加入一定量的反应物 D-对羟基苯甘 氨
15、酸、-酮戊二酸和辅酶磷酸吡哆醛，30培养反应 10h，在反应起始和结束分别取样 200l， 与甲醇混合，13000rpm 离心除去蛋白，用 0.22m 滤膜过滤，制备色谱样品，进行 HPLC 测 定。105110115120125HPLC 条件16如下：色谱柱：Agela Venusil C18(5m，4.6250mm);流动相：50mmol/L 醋酸钠缓冲液（pH4.2）甲醇（体积比 90:10）； 检测波长：254nm；流速：1ml/min;柱温：室温；2结果2.1 pPic9k-HPGT 质粒构建将合成优化后的 HPGT 基因连在 Puc18 克隆质粒上，构建 pUC18-HPGT 质粒
16、；再设计 合成引物，引物的上下游加入 EcoR 酶切位点（下划线标注部分）和保护碱基 CG，扩增 HPGT 基因。PIC9K 上游引物：CGGAATTCATGAGCATTTACAGCGAPIC9K 下游引物：CGGAATTCTACCCACTTATTAGCCC再分别对 HPGT 和 pPic9k 进行 EcoR 酶切去磷酸化，转接至大肠杆菌 BL21(DE3),涂 布具有 Amp 和 kna 抗性的 LB 固体培养基，隔夜培养。挑取菌落进行菌落 PCR，经 PCR 结 果（如图 1）和测序验证，筛选出 HPGT 与 pPIC9K 正确连接的菌株。M:Marker图 1 菌落 PCR 验证Fig.
17、1 Colony PCR confirmation2.2 毕赤酵母 GS115-pPic9k-HPGT 的构建用 Sac线性化的 pPIC9K-HPGT 电转入毕赤酵母 GS115 感受态中，涂布 MD 固体培养 基。孵育 3-5 天，在 MD 培养基上约长出 80 个菌落。挑取 40 个菌落，进行酵母菌落 PCR。 所用引物为：5AOX1：GACTGGTTCCAATTGACAAGC3AOX1：GGCAAATGGCATTCTGACATCCT130135140145150由于 pPIC9K 上，5AOX1 引物位于第 855-875 个碱基，3AOX1 引物位于第 1327-1347个碱基，两引
18、物之间约 400bp，当插入 HPGT 基因后，PCR 克隆的基因全长约为 1700bp； 由毕赤酵母使用手册可知，HPGT 基因未成功插入的 PCR 产物长约 2200bp；PCR 结果如图 2：M: Marker; 0: 对照菌； 1-5：重组菌M: Maker; 0: Control Colony; 1-5: Recombination Colony图 2 菌落 PCR 产物胶图Fig.2 Result of the Colony PCR for Pichia由图可看出，0 号原始 GS115 菌株条带为 2200bp，3、4、5 号条带约为 1700bp，说明HPGT 基因已经成功整合
19、进入酵母染色体。 其他菌落采用同样方法，共筛选出 6 个阳性菌落。2.3 毕赤酵母 GS115-pPic9k-HPGT 分泌表达将筛选出的 6 个阳性菌落进行摇瓶发酵，将样品进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，直至发酵 结束。目标蛋白 HPGT 的大小约为 47KD。SDS-PAGE 胶图如图 3：M：Marker;0:对照; 11：目标条带; M: Maker ; 0: Control; 11: the target band;图 3 HPGT 的分泌表达鉴定结果Fig.3 HPGT Secretion Express Results由图 3 可知，只有 11 号菌株在 47kd 处有条带，表
20、明其进行了分泌表达，而其它菌株均未进行分泌表达。在发酵第四天时，分泌蛋白量达到最大，随后蛋白逐渐被降解，蛋白量减少。- 8 -1551601651702.4 HPLC 测定 HPGT 酶活性将 0 和 11 号菌进行摇瓶发酵，纯 D-对羟基苯甘氨酸作为标准品 A，纯 -酮戊二酸为 标准品 B。图 4 为标准品和 11 号菌反应前后的 HPLC 图：A：D-对羟基苯甘氨酸标准品B： -酮戊二酸标准品C：11 号菌株发酵前样品D：11 号菌株发酵后样品A: D-hydroxyphenylglycine Standard； B： -ketoglutarate Standard;C: the 11th
21、 Sample before fermentation; D: the 11th Sample after fermentation;图 4 重组毕赤酵母 GS115-pPIC9K-HPGT 发酵液 HPLC 分析Fig.4the HPLC Analysis of Pichia GS115-pPIC9K-HPGT由图 4 可看出，标准品 A 在 3.023min 处，标准品 B 在 2.94min 处；对照图 C 和图 D，可知反应后 3.0min 处的峰有了明显的减小，且在约 10.5min 处有一个明显吸收峰，此峰推 测为反应产物对羟基苯乙醛酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醇（因
22、对羟基苯 乙醛酸不稳定，易分解为对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醇，故峰较大）。由此可知，GS115-pPIC9K-HPGT 菌株分泌表达了有活性的 D-对羟基苯甘氨酸转氨酶（HPGT），实现 HPGT 基因在毕赤酵母菌的高活性可溶性表达，并确定其功能，为进一步 酶活力的突变研究奠定基础。1751801851901952002052102152203结论截至目前，自然界还没有发现直接利用生物途径合成天然 D-对羟基苯甘氨酸的途径。 在生物合成 D-对羟基苯甘氨酸途径中涉及三个关键酶：对羟基扁桃酸合酶 HmaS，羟基扁桃 酸氧化酶 Hmo 和 D-对羟基苯甘氨酸转氨酶 HPGT，其中以 D
23、-对羟基苯甘氨酸转氨酶（HPGT） 最为重要。目前已有研究表明，假单胞菌的基因组中存在 DL-对羟基苯甘氨酸转氨酶基因。自然界 的放线菌可将 4-对羟基苯丙酮酸经过羟基扁桃酸合酶 HmaS，羟基扁桃酸氧化酶 Hmo 和 L- 对羟基苯甘氨酸转氨酶转化为 L-对羟基苯甘氨酸。在生物合成途径中，部分 L-对羟基苯甘 氨酸合成途径产物需与 D- 对羟基苯甘氨酸转氨酶（Hydroxyphenylglycine transaminase HPGT）结合，以合成 D-对羟基苯甘氨酸。在恶臭芽孢杆菌 LW-4 和斯氏假单胞菌中均发现 有 D-对羟基苯甘氨酸转氨酶。由于 HPGT 在 大 肠 杆 菌 以 包
24、涵 体 形 式 存 在 ， 不 利 于 表 达 。 于 是 构 建 穿 梭 载 体 pPIC9K-HPGT，将 HPGT 基因整合至毕赤酵母染色体上，使其在毕赤酵母中分泌表达。最 终选定毕赤酵母 GS115 为原始菌株，构建菌株 GS115- pPIC9K-HPGT，通过多种筛选方式得 到 6 株重组菌株 GS115-pPIC9K-HPGT。通过摇瓶发酵得到一株可以分泌表达 HPGT 的菌株， 并在多种条件下测定蛋白分泌情况，选出最适分泌条件。后期的发酵试验数据表明，分泌表 达的 HPGT 蛋白可以有效的转化 D-对羟基苯甘氨酸生成对羟基苯乙醛酸。这充分证明分泌 表达的蛋白是活性的，实现了 H
25、PGT 基因的有活性分泌表达。数据表明，毕赤酵母能有效 分泌 HPGT，并保持其原有活性。但目前，毕赤酵母分泌表达量还不高，并且实验中发现，一些目标蛋白不能有效分泌出 胞外，仍然需要进一步研究影响毕赤酵母分泌表达的因素，改善并优化，使其蛋白表达量有 较明显提高，为未来投入工业生产奠定基础。参考文献 (References)1 Hongo C, Tohyaea M, Yoshioka, et al. Asymmetric transformation of DL-p-hydroxyphenylglycine by a combination of preferential crystalliza
26、tion and simultaneous racemization of the o-toluenesulfonater J. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1985, 58(2):433-436.2 Oh KH, Nam SH, Kim HS. Directed evolution of N-carbamyl-D-amino acid amidohydrolase for simultaneous improvement of oxidative and thermal stability J. Biotechnology Progr
27、ess, 2002, 18(3):413-417.3 Fan C, Lee C, Chao Y. Recombinant Escherichia coli cell for D-p-hydroxyphenylglycine production fromD-N-carbamoyl-p-hydroxyphenylglycine J. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 26(2-4):222-228.4 Wegman MA, Janssen MHA，van Rantwijk F, Sheldon RA. Towards biocatalytic synt
28、heses of -lactamantibiotics. Advanced Synthesis & Catalysis, 2001, 343(6-7): 559-576.5 Hubbard BK, Thomas MG, Walsh CT. Biosynthesis of L-p-hydroxyphenylglycine, a non proteinogenic amino acid constituent of peptide antibiotics. Chemistry & Biology, 2000, 7: 931-942.6 He P, Conrad JA, Moran GR. The
29、rate-limiting catalytic steps of hydroxyl andelate synthase fromAmycolatopsis orientalis. Biochemistry, 2010, 49:1998-2007.7 Chiu HT, Hubbard BK, Shah AN, et al. Molecular cloning and sequence analysis of the complestatin biosynthetic gene cluster. Proceedings of Natural Academic Sciences USA, 2001,
30、 98(15):8548-8553.8 Hubbard BK, Thomas MG, Walsh CT. Biosynthesis of L-p-hydroxyphenylglycine, a non proteinogenic aminoacid constituent of peptide antibiotics. Chemistry Biology, 2000, 7: 931-942.9Chia-HsiFan,Cheng-KangLee,Yun-PengChao.RecombinantEscherichiacolicellforD-p-hydroxyphenylglycine produ
31、ction from D-N-carbamoyl-p-hydroxyphenylglycine. Enzyme and MicrobialTechnology,2000,26: 222-228.10 Suthep Wiyakrutta, Vithaya Meevootisom. A stereo-inverting D-phenylglycine aminotransferase fromPseudomonas stutzeri ST-201: purification, characterization and application for D-phenylglycine synthesi
32、s. Journal of Biotechnology,1997.55: 193-203.11 Zohreh Hojati, Claire Milne,Barbara Harvey,et al. Structure, Biosynthetic Origin,and Engineered Biosynthesis of Calcium-Dependent Antibiotics from Streptomyces coelicolor ChemistryBiology,2002, 9:1175-1187.12 Taylor PP, Pantaleone DP, Senkpeil RF,et al
33、. Novel biosynthetic approaches to the production of unnatural225230amino acids using transaminasesJ. Trends in Biotechnology, 1998, 16(10):412-418.13 Khampha W, Meevootisom V, Wiyakrutta S. Spectrophotometric enzymatic cycling method using l-glutamatedehydrogenase and d-phenylglycine aminotransfera
34、se for determination of l-glutamate in foodsJ.Analytica Chimica Acta, 2004, 520(1):133-139.14 Hjggins D R，Cregg J MIntroduction to Pichia pastorls J. Methods in Molecular Biology, 1998,103( 1-15):115.15 高炳森, 长孙东亭, 朱晓鹏等. 毕赤酵母重组子 PCR 模板制备方法的比较J. 中国海洋药物杂志,2009,28(1):7-11.16 南晶. 利用基因工程菌 HC01 固定化细胞制备 D-对羟基苯甘氨酸D. 山西：山西大学，2010.