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1、精品论文胰腺癌细胞中 MEK1 和 MEK2 的差异功能解析谭晓冬，周磊，王怀涛，朱海军，张峻，李捍司，王兆平，孙杨，杨一帆5（中国医科大学附属盛京医院胰腺甲状腺外科，沈阳 110004） 摘要：丝裂原活化蛋白激酶激酶 1/2（mitoge-activated protein kinase kinase 1/2, MEK1/2）信 号转导通路在肿瘤发生发展中有重要作用。能够抑制 MEK1/2 活化的小分子化合物可成为抗 肿瘤药物开发的靶点。但 MEK1 和 MEK2 在胰腺癌发生发展中的作用机制尚未清楚。为了 探究胰腺癌细胞系中 MEK1 和 MEK2 的不同功能，我们利用基因敲减技术分别抑制
2、 MEK110和 MEK2 的 mRNA 合成。我们对 MEK1 及 MEK2 基因敲减的胰腺癌细胞系 PC-1.0 进行细 胞形态学、增殖、有丝分裂阻滞（mitotic arrest）和体外侵袭能力实验。结果显示 MEK1 表 达的抑制能够特异性抑制细胞增殖和 G0/G1 转化。而 MEK2 表达的抑制特异改变细胞形态 及抑制胰腺癌细胞的侵袭能力。在胰腺癌细胞系中 MEK1 和 MEK2 调控不同的生物学反应。 在胰腺癌治疗中，MEK1 和 MEK2 可成为抑制特异细胞功能的不同靶点。15关键词：胰腺癌；MEK1；MEK2；基因干扰；功能调节中图分类号：R735.9MEK1 and MEK2
3、 isoforms regulate distinct functions in pancreatic cancer cells20TAN Xiaodong, ZHOU Lei, WANG Huaitao, ZHU Haijun, ZHANG Jun, LI Hansi,WANG Zhaoping, SUN Yang, YANG Yifan(Department of Pancreatic and Thyroid Surgery, Shengjing Hospital, China Medical University,ShenYang 110004)Abstract: The mitogen
4、-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) signalling pathway plays a25central role in tumour progression. Small molecules that inhibitor MEK1/2 are therefore considered attractive candidates for anti-cancer drugs. However, the exact contributions of MEK1and MEK2 to the development of pancreatic
5、cancer remain to be established. To differentiate the functions of MEK1 and MEK2 in a cultured pancreatic cancer cell line, we utilised shRNA-mediated knockdown of their two mRNAs individually. We studied the effects of MEK130and MEK2 knockdown on cell morphology, proliferation, mitotic arrest, and
6、in vitro invasion capability in PC-1.0 cells. The results showed that inhibition of MEK1 expression was an effective and specific approach to inhibit cell proliferation and induce G0/G1 arrest. On the other hand, MEK2 knockdown specially altered cell morphology and inhibited the invasive ability of
7、pancreatic cancer cells. Therefore, MEK1 and MEK2 mediate different biological responses in35cultured pancreatic cancer cells. These proteins could become distinct targets for the inhibition of specific cellular functions in the treatment of pancreatic cancer.Keywords: pancreatic cancer; MEK1; MEK2;
8、 RNAi; function regulation0引言40胰腺癌常伴随广泛的侵袭和/或转移，无法进行治疗性外科手术治疗。以侵袭/转移相关 因子为靶点的分子治疗方法的发展为提高胰腺癌患者预后提供了新途径。但胰腺癌侵袭/转 移的细胞及分子机制尚不清楚。利用 BOP 诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型，经胰腺内移植（intra-pancreatic transplantation）后，建立两种胰腺癌细胞系 PC-1（非解离型低转移株）和 PC-1.0（解离型基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20092104120014）作者简介：谭晓冬，（1971-），男，教授，主任医师，主要研究方向：胰
9、腺癌侵袭转移机制的研究。E-mail:- 9 -45高转移株），具有了不同的侵袭和转移的潜能1-3。前期研究中我们利用表达差异分析方法（Representational Difference Analysis, RDA）发现 PC-1.0 和 PC-1 细胞的基因表达存在差异。 MEK2 是与 PC-1.0 和 PC-1 细胞的侵袭和转移密切相关的因子4。进一步研究发现 MEK2 参 与调控仓鼠及人胰腺癌细胞的侵袭/转移5。MEK2 作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号转导通50路中的重要激酶之一，参与了较多细胞生化过程，包
10、括细胞增殖、分化，细胞分裂，应激和 细胞凋亡6-9。MAPK 信号转导通路几乎存在于所有真核生物细胞中，可分为三种激酶体系： MAPK，丝裂原活化蛋白激酶激活剂（MAP kinase kinase，MKK 或 MEK）和丝裂原活化蛋 白激酶激酶激活剂（MAP kinase kinase activator，MAPKKK）10。MEK1 和 MEK2 是 MEK 家族的两种同分异构体，通常表达为 MEK1/2。二者拥有 85%相同的氨基酸序列，并在细胞55系及组织中特异表达。二者通常被认为具有相同的功能，但是有文献报道二者可能通过不同 途径调控并产生不同的功能11-13。迄今 MEK1 和 ME
11、K2 在胰腺癌细胞中的作用尚未清楚。 为进一步阐明 MEK1 和 MEK2 在胰腺癌细胞中的不同功能调控机制，我们利用逆转录 病毒，通过短发卡 RNA（short-hairpin RNAs, shRNAs）技术分别沉默解离型高转移株胰腺癌细胞 PC-1.0 细胞中 MEK1 和 MEK2 的基因表达，并进一步检测相应基因功能。601材料和方法1.1 细胞系和细胞培养采用仓鼠非解离型低转移株胰腺癌细胞系 PC-1 细胞和解离型高转移株胰腺癌细胞系 PC-1.0 细胞。PC-1 细胞系是利用 BOP 诱导的叙利亚仓鼠实验性胰腺癌模型建立1。PC-1.0 细胞系是由同系仓鼠皮下接种 PC-1 细胞后
12、产生的肿瘤而建立2。上述两种细胞系呈不同形65态学方式生长。PC-1 细胞呈岛样细胞克隆方式生长，PC-1.0 细胞主要呈单个细胞方式生长3。采用 PC-1.0 细胞的亚克隆表达 MEK1 或 MEK2 的 shRNA。采用 GP2-293 包装细胞复 制逆转录病毒。上述细胞系均以 RPMI-1640 培养液（Gibco-BRL, Grand Island, NY）培养，并加 10胎70牛血清（Bioserum, Victoria, Australia）、100 U /ml 青霉素 G 和 100 g /ml 链霉素，于含 5CO2 37孵箱内培养。上述细胞在进行免疫细胞学实验前无血清培养。1
13、.2 抗体本实验中利用兔抗人的 MEK1、MEK2 及 -actin 多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）作为一抗。利用辣根过氧化物酶结合的抗体和 FITC 标记的荧光抗体（Santa75Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）作为第二抗体。1.3 抗 MEK1 和抗 MEK2 的 RNAi 序列设计和 shRNA 逆转录病毒表达和分布 MEK1 和 MEK2 特异性靶点序列根据在http:/ 网站上（comprehensive online）RNAi 工具（Clontech Laboratories, I
14、nc., CA, USA），利用 MEK1(Gene Bank Accession No. NM_002755) 和 MEK2 （ Gene Bank Accession No.80NM_030662 ） 相 关 序 列 设 计 而 建 立 。 MEK1shRNA标 记mRNA（5-GGAGAAGCACAAGAUCAUG-3 ）的 nt 为 614-632 ，MEK2 shRNA 标记 mRNA（5-CCUGGACUAUAUUGUGAAC-3）的 nt 为 1216-1234，二者根据之前设计经过化学合859095100105110115120成并克隆进入逆转录病毒 pSIREN-RetroQ
15、-Zsgreen14。利用 BigDye Terminator Sequencing Kit 的 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer 检测病毒带菌体的序列确认 shRNA 的插入（Applied Biosystems, CA, USA）。1.4 逆转录病毒的生产和感染应用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)试剂盒将 GP2-293 细胞（8105） 与包装带菌体（packaging vector）pVSV-G 和含有 MEK1 或 MEK2 shRNA 插入序列(Clontech laboratori
16、es, Inc., CA, USA)的 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-Zsgreen 带菌体共同转染。对照细 胞系由 GP2-293 细胞与相应的空白带菌体（RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-Zsgreen 和 pVSV-G） 感染而来。转染后上述细胞系在 RPMI 1640 培养液中培养 48 小时。根据逆转录病毒基因转 染和表达用户手册（PT3132, Clontech Laboratories, Inc., CA, USA），将含有逆转录病毒的细 胞上清液过滤并感染 PC-1.0 细胞。为了得到 MEK1 和 MEK2 沉默的细胞株，我们利用免疫 荧光
17、显微镜进行克隆筛选，并分别进行培养和进一步功能分析。1.5 应用 RT-PCR 对 MEK1 和 MEK2 mRNA 表达的分析总 RNA 由 MEK1 或 MEK2 shRNA 表达和感染空白带菌体的 PC-1.0 细胞分离提取。利 用 SuperScript II 试剂盒（Life Technologies, Inc.），从每个样本中取 1 g 反转录成 cDNA5。 MEK1、MEK2 和 -actin 的特异 PCR 引物序列如下：MEK1：5-ATTATTGTTCCCCTAAGTGGATTG-3（forward）5-TTACAACAGCATTGGTACTTGGAT-3（reverse
18、）；MEK2：5-GCAGTCGGACATCTGGAGCA-3（forward）5-CACCGTTGGGCAGCTTAGGA-3（reverse）；-actin：5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3（forward）5-CTCCTTAAGTCACGCACGATTCC-3（reverse）；-actin 作为标准化对照（normalising control）。经最初 95变性 5 分钟后，按照 94 30 秒、55 30 秒、72 1 分钟进行 PCR 30 个循环，最后经 72延伸 7 分钟。每个实验均重 复三次。为了进行 mRNA 定量，样本均与标准化对照即 -actin mR
19、NA 的表达进行比较，并 应用 GeneSnap 和 GeneTools 软件（Syngene, Cambridge UK）进行结果分析。1.6 应用 western blotting 对 MEK1 和 MEK2 蛋白水平表达的分析于直径 90mm 培养皿中加入含 10%小牛血清的 RPMI 1640 培养液 10ml，进行细胞培养。 应用 1ml 预冷的 RIPA 裂解液（50mM Tris，150ml NaCl，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，pH 7.5 1mM 苯甲磺酰氟，使用前加入 1mg/ml leupeptin 和 1mg/ml aprotinin）冰上
20、裂解 细胞 15 分钟。经 4 5000 rpm 5 分钟离心后，取上清液并分装贮存于-80冰箱备用。-actin 作为内参。Western blot 方法同前15。即将总蛋白质含量相同的不同样本（20 g）利用聚丙烯酰胺 平板凝胶电泳按分子量分离，后将蛋白质转印到 PVDF 膜（BIO-RAD, Anaheim, USA）上。 然后，将 PVDF 膜与 0.1% Tween-20/PBS 稀释的一抗共同于 4下孵育过夜。辣根过氧化物 酶标记的二抗以 0.1% Tween-20/PBS 按 1：5000 稀释，并与一抗孵育后的膜共同孵育。柯 达胶片(Eastman Kodak Company,
21、 Rochester, NY) 加入增强型化学发光剂（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）以探测收集蛋白条带光信号。1251301351401451501551.7 体外细胞增殖实验我们将 MEK1 基因敲减、MEK2 基因敲减及空白对照的 PC-1.0 细胞分别以 5000 个/孔 的密度接种于 96 孔培养板中，同时加入含 10% FBS 的培养液进行培养。培养 3 天后，按照 产品说明应用 CCK-8 试剂盒（Cell Counting Kit 8, Dojindo Co., Kumamoto, Japan）对有活力 的细胞进行计数。该试剂为
22、一种四唑盐复合物（WST-8），与活细胞内特异物质反应形成一 种有颜色物质并在 450nm 有吸收高峰，即 450nm 时该物质的量直接反映了培养基中活细胞 的数量。各实验均重复接种于 3 个孔中。1.8 细胞周期实验应用 PI（propidium iodide）对 DNA 染色以分析细胞周期和有丝分裂阻滞的变化。细胞 经胰酶消化、沉淀，再用预冷的 PBS（phosphate-buffered saline）制成细胞悬液。将预冷的95%乙醇 three volume 缓慢加入此细胞悬液并轻轻震荡。预冷试剂和缓慢加入乙醇的目的在 于减少细胞聚集后沉淀。用等量的 PI 溶液（30 g/ml，溶于
23、PBS）和 RNase A 溶液（100 g/ml， 溶于 PBS）再次制成细胞悬液。已染色的细胞在 4下避光保存过夜。应用 FACScan 流式 细胞仪（Becton Dickinson, San Jose, CA）对细胞周期进行分析，观察细胞处于 G1 期、G2 期 和 S 期的比例。1.9 体外侵袭实验应用 Invasion Chambers（Becton Dickinson Labware, Bedford, MA）进行体外侵袭实验。1ml 含 10FBS 的 RPMI-1640 培养液作为化学诱导物、相同剂量 BALB/3T3 细胞的无血清 条件培养基加入到培养板孔中。将 MEK1
24、基因敲减、MEK2 基因敲减和空白对照的 PC-1.0 细胞的细胞悬液（1x105/ml）约 500l 以及等量的相应实验原料一起加入到 transwell 的内室 中。上述细胞 37培养 12 小时后，用棉拭子擦去滤膜上表面的残留细胞，对已迁移到滤膜 下表面的细胞进行固定并应用 Diff-Quik 试剂（Dade Behring, Dugen, Switzerland）染色，之 后在 1mm2 网格上计数细胞核数目以确定滤膜下表面迁移细胞的数目（x100 倍放大）。1.10统计学分析数据以平均值标准差形式表示。通过 Stat View 计算机软件（SAS Institute，Inc.，Car
25、y，NC）利用非配对 Students t 检验评估每个分组之间的差异。P0.05 认为差异具有显著性。2结果2.1 MEK1 shRNA 和 MEK2 shRNA 质粒的建立为进行细胞功能实验，应用含有 MEK1 或 MEK2 shRNA 的 pSIREN-RetroQ-Zsgreen 带 菌体阻滞 MEK1 或 MEK2 的表达。经空白对照反转录病毒感染的 PC-1.0 细胞在细胞形态学、 细胞增殖、细胞周期和体外侵袭实验方面与未感染的 PC-1.0 细胞进行比较，发现空白质粒 本身不影响 PC-1.0 细胞的生物功能（数据未给出）。为了阻滞内源性 MEK1 或 MEK2，我 们在 RNA
26、i-Ready pSIREN-RetroQ-Zsgreen 上对两个基因各选择了三种 shRNA 序列。我们发 现所选择的 shRNA 均分别降低内源性 MEK1 或 MEK2 mRNA 的表达，其中减少最多的分 别是 MEK1 shRNA 3（98.4%）和 MEK2 shRNA 3（77.5%）（图 1）。与空白质粒组比较， MEK1 shRNA 3 和 MEK2 shRNA 3 作用后明显抑制 MEK1 和 MEK2 的蛋白表达（图 2）。 故筛选出这两种带菌体进行下一步实验。160165图 1 经 shRNA 基因敲减调节后 PC-1.0 细胞中 MEK1 和 MEK2 mRNA 表达
27、变化；与对照组相比，表达MEK1 shRNA 的 PC-1.0 细胞中 MEK1 mRNA 表达水平显著降低，而 MEK2 表达没有变化。同样，MEK2 shRNA 显著降低 MEK2 mRNA 表达水平而 MEK1 表达无明显变化。-actin 为标准化对照。图 2 经 MEK1 或 MEK2 基因敲减后 PC-1.0 细胞中 MEK1 或 MEK2 的蛋白表达变化；与对照组相比，有 MEK1 shRNA 表达的 PC-1.0 细胞中 MEK1 蛋白表达水平显著降低，而 MEK2 没有变化。MEK2 shRNA 显 著降低 MEK2 蛋白表达水平而对 MEK1 表达没有作用。-actin 作
28、为内参。2.2 MEK1 和 MEK2 基因敲减的 PC-1.0 细胞的形态学和生长方式变化实验结果表明 MEK2 基因敲减的 PC-1.0 细胞以克隆方式生长。而 MEK1 基因敲减的细 胞在细胞生长方式方面与空白质粒感染的 PC-1.0 细胞没有变化（图 3）。170175180185图 3 MEK1 和 MEK2 基因敲减后 PC-1.0 细胞的形态学变化；与对照组（A）相比，MEK2 基因敲减显著 诱导了 PC-1.0 细胞（C）的细胞集聚。而经 MEK1 基因敲减 PC-1.0 细胞（B）未表现出显著的细胞生长方 式变化。免疫荧光图像显示了对照组（D）、MEK1-shRNA 组（E）
29、和 MEk2-shRNA 组（F）细胞的稳定转 染情况。2.3 MEK1 和 MEK2 基因敲减的 PC-1.0 细胞的增殖变化对 MEK1 和 MEK2 基因敲减的 PC-1.0 胰腺癌细胞的细胞增殖进一步进行研究。结果发 现 MEK1 基因表达下调抑制 PC-1.0 细胞的增殖（图 4）。尤其在培养 48 小时和 72 小时以 后，PC-1.0 细胞增殖活动显著减低，与空白对照细胞相比抑制率分别为 62.0%和 60.5%（P0.05）。图 4 MEK1 和 MEK2 基因敲减后 PC-1.0 细胞的增殖变化；PC-1.0 细胞经 MEK1 基因敲减后在培养 48 小 时和 72 小时后表
30、现出明显的抗增殖作用。而 MEK2 基因敲减在细胞生长或增殖的抑制方面没有明显作用。1901952.4 MEK1 和 MEK2 基因敲减的 PC-1.0 细胞的细胞周期变化我们应用 FACScan 流式细胞仪对 MEK1 和 MEK2 基因敲减的 PC-1.0 细胞进行细胞周 期分布分析。在 MEK1 基因敲减细胞中只有 8.1%0.7%的细胞处于有丝分裂的 S 期。而空 白对照 PC -1.0 细胞中有 26.6%5.4%的细胞处于 S 期（P 0.05，图 5）。图 5 MEK1 和 MEK2 基因敲减后 PC-1.0 细胞的有丝分裂阻滞变化；MEK1 基因敲减减少了处于 S 期 PC-1
31、.0 细胞的百分比，而 MEK2 基因敲减后 PC-1.0 的细胞周期没有明显变化。黑色条带，含有空白质粒的对照 PC-1.0 细胞；斑点条带，MEK1 基因敲减的 PC-1.0 细胞；白色条带，MEK2 基因敲减的 PC-1.0 细胞。S， 显著；NS，不显著。2002052.5 MEK1 和 MEK2 基因敲减的 PC-1.0 细胞的体外侵袭能力变化如图 6，空白对照细胞表现出较强的侵袭能力（侵袭细胞数=52.65.8）。而与空白对照 细胞相比，MEK2 基因敲除显著抑制了 PC-1.0 细胞的侵袭能力（侵袭细胞数=20.13.1, P 0.05）。图 6 MEK1 和 MEK2 基因敲减
32、后 PC-1.0 细胞的侵袭能力变化；与含有空白质粒的对照 PC-1.0 细胞相比， MEK2 基因敲减显著抑制了 PC-1.0 细胞的侵袭能力。而 MEK1 基因敲减后并没有影响细胞的侵袭能力。S， 显著；NS，不显著。精品论文2102152202252302352402452502553讨论MEK 蛋白家族包含多个调节位点，多种信号分子能与这些位点结合。MEK1 和 MEK2 在两个部位存在较大的不同：氮端的 ERK 结合位点和磷酸化位点，可与几种其他信号蛋白 结合。MEK1 和 MEK2 在重要位点上的差异提示二者可能具有不完全相同的功能。有研究 利用基因敲除大鼠进行实验指出 MEK1
33、和 MEK2 蛋白存在功能差异，支持以上假说12, 16。 另据文献指出 MEK1 和 MEK2 在肝细胞中表现出特异的功能。MEK2 调节细胞生存，而 MEK1 参与细胞增殖17。在近期的研究中，将 MEK1 和 MEK2 基因从胰腺癌细胞中敲减以 研究二者的功能变化。一些 MEK1/2 的小分子抑制剂（如 U0126）已成为癌症分子靶向治疗 的候选分子5, 18，但大部分抑制剂同时阻滞 MEK1 和 MEK219。因此这些抑制剂缺乏特异 性。而 RNAi 被认为是检测基因功能的强大工具，并在治疗癌症等疾病方面作为经典治疗方 法20。4结论本研究发现胰腺癌细胞中 MEK1 和 MEK2 调节
34、不同的生物功能。MEK1 而不是 MEK2 的表达抑制是抑制细胞增殖和诱导 G0/G1 阻滞的特异且有效的方法。而 MEK2 mRNA 特异 性改变细胞形态和抑制细胞侵袭能力。总之，表达 MEK1 和 MEK2 shRNA 的重组逆转录病 毒在胰腺癌治疗方面可作为一种值得探索的手段。参考文献 (References)1 Egami H, Takiyama Y, Cano M, Houser WH, Pour PM. Establishment of hamster pancreatic ductal carcinoma cell line (PC-1) producing blood grou
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