不同类型苯硼酸改性的聚乙烯亚胺(PEI)做.doc

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1、精品论文不同类型苯硼酸改性的聚乙烯亚胺(PEI)做为基因传递载体的研究钟振林，陈富偈，卓仁禧5（武汉大学化学与分子科学学院，生物医用高分子教育部重点实验室，武汉 430072） 摘要：聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)是最常见的应用于基因载体的阳离子聚合物。本文 设计、合成、表征了两种分别带有 o-胺甲基和 p-胺甲基苯硼酸基团的 PEI(PEI1800-o-BA 和 PEI1800-p-BA)。MTT 毒性测试结果表明这两种 PEI 衍生物的细胞毒性比 25 KDa PEI 小很 多。而且，两种材料在不同细胞中的毒性表现不同，对于 HeLa 细胞，PEI1800-p-B

2、A 的毒性10比 PEI1800-o-BA 小，PEI1800-p-BA 浓度为 1mg/mL 时细胞存活率仍大于 50% ；而 PEI1800-o-BA 的 IC50 约为 0.22mg/mL。相反地，对于 HepG2 细胞，PEI1800-p-BA 的毒性 较 PEI1800-o-BA 大，其 IC50 约为 0.22mg/mL，而 PEI1800-o-BA 浓度为 1mg/mL 时细胞存 活率仍有 50%左右。荧光素酶基因转染实验表明 PEI-BA 是一种有效的非病毒基因传递载体， 其在 HepG2 和 HeLa 细胞上的转染效率皆比 25 KDa PEI 高。在表面富含 Sialyl

3、Lewis X 糖15基的 HepG2 细胞中， PEI1800-p-BA/DNA 的转染效率比 25 KDa PEI/DNA 高约 5-10 倍；在 HeLa 细胞上 PEI1800-o-BA 较 1800Da PEI 要高 2-3 个数量级，在 N/P=10-20 时比 25KDa PEI 的转染效率也要高出 5-10 倍。激光共聚焦实验也显示两种材料在不同细胞上的基因传递效 果不同。这些结果表明苯硼酸对材料的转染效率有着相当重要的作用，而且不同类型苯硼酸 修饰的 PEI 显示出一定的细胞选择性。20关键词：高分子化学与物理；基因载体；聚乙烯亚胺；苯硼酸中图分类号：O633.2Polyet

4、hylenimines (PEI) modified with different types of phenylboronic acid groups for gene delivery25ZHONG Zhenlin, CHEN Fujie, ZHUO Renxi(College of Chemistry & Molecular Science,Key Laboratory of Bimedical Polymers of Ministryof Education, Wuhan University, WuHan 430072)Abstract: Polyethylenimine (PEI)

5、 has been widely used for nonviral gene. In this paper, two derivatives (PEI1800-o-BA and PEI1800-p-BA) of PEI1800 modified with different types of30phenylboronic acid groups were designed, synthesized, and investigated for use as gene vectors.PEI1800-o-BA and PEI1800-p-BA were prepared by the react

6、ion of 1800Da PEI with4-(bromomethyl)phenylboronric acid and 2-(bromomethyl)phenylboronric acid, respectively. The two polymers could bind DNA well when the N/P ratio was 1. They showed much lower cytoxicity than 25 KDa PEI. MTT assay indicated that PEI1800-p-BA had lower cytoxicity than35PEI1800-o-

7、BA in HeLa cells, and higher cytoxicity in HepG2 cells. Efficiency of the PEI1800-o-BA and PEI1800-p-BA as gene vectors was evaluated in vitro by transfection of pGL3 to HeLa and HepG2 cells. Their efficiency was about one order of magnitude higher than that of25KDa PEI. The transfection efficiency

8、of PEI1800-o-BA was much higher than that ofPEI1800-p-BA in HeLa cells but lower in HepG2 cells, showing a cell selectivity.40Keywords: Polymer chemistry and physics; gene vector; polyethylenimine; phenylboronic acid0引言随着基因治疗的兴起，形形色色的材料应用于基因传递载体。其中，聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物无疑是最受关注的之一1-3。聚乙烯亚胺电荷密度高，易与带负电的 DNA

9、形成紧基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(200804860030),国家自然科学基金(20974082)作者简介：钟振林，男，教授，主要研究方向：生物可降解高分子，药物控制释放，基因载体。 E-mail:- 10 -45密的纳米复合物，并通过静电吸引与细胞膜结合，最后通过内吞作用进入细胞4, 5。同时， PEI 还能够起到保护 DNA 免受核酸酶降解的作用，产生较高的转染效率6。但是，PEI 仍有 其局限性，如电荷密度高，细胞毒性较大。一般来说，高分子量的 PEI 具有高的转染效率， 但它们的毒性也很大，而分子量较低的 PEI 虽然没有太大的细胞毒性，但是它的转染效率也 不高。分子量低

10、于 800Da 的 PEI 基本不能很好的复合 NDA，也没有好的转染效果。因此，50通过对小分子 PEI 进行修饰来达到高效低毒的效果是许多研究组的研究课题，如：在低分子量 PEI 间引入可降解化学键来制备交联的 PEI 7-12，可以形成相当于高分子量 PEI 的交联产 物，能够有效地负载和传递 DNA，同时其可降解性也能保证其毒性小于高分子量 PEI；在 低分子 PEI 上引入疏水基团形成两亲性阳离子高聚物，在水中自组装形成阳离子胶束，能够 有效地包裹 DNA，并能有效地进行细胞转染，毒性也相对较低13；此外，在 PEI 分子上引55入靶向基团也能提高转染效果，彭琪等在 1.8 KDa

11、PEI 上修饰 4-溴甲基苯硼酸后发现，其转 染效率比 1.8 KDa PEI 明显提高 2-3 个数量级，且毒性较小14。苯硼酸作为葡萄糖敏感和胰岛素释放的研究内容已经被许多人所认可。通过化学方法可 以将硼酸基团连接到一些聚合物的侧链上进行改性15, 16。通常情况下，这些苯硼酸改性的 聚合物用来分析和检测含有糖类物质或是制备对葡萄糖敏感的凝胶17-20。近年来，作为重要60的糖靶向药物在对细胞表面的糖蛋白识别的过程中起到了非常重要的作用21-24。苯硼酸是一 种路易斯酸，它能与糖基上的二醇可逆形成环状酯而被广泛地用作糖类的靶向和识别。有研 究表明苯硼酸与各种糖基分子的作用强度与苯硼酸的结构

12、及糖基的种类有很大的关系。同 时，不同种类的细胞表面所含的糖基种类与数量也不尽相同，因此苯硼酸在细胞识别上也有 一定的应用25,26。65本文通过在 PEI 分子上分别修饰两种不同类型苯硼酸基团来实现载体材料对细胞的靶 向性，从而表现出更高的转染能力。同时，还考察了不同的苯硼酸基团对聚合物性质的影响。 用凝胶电泳法研究这些聚合物与 DNA 的相互作用，用光散射法表征聚合物和 DNA 形成的 复合物大小及表面电荷情况，考察聚合物对细胞的毒性以及介导 DNA 转染细胞的能力，并 用共聚焦显微法观察了载体材料对细胞的靶向性。701实验部分1.1仪器与试剂1800 Da 和 25 KDa PEI 自

13、Aldrich 公司购得，直接使用。4-溴甲基苯硼酸和 2-溴甲基苯 硼酸自河北德隆泰公司购得。pGL3 质粒自 Promega 公司购得。YOYO-1 和 Hoechst 33258 dye 购于 Molecular Probes 公司。75人类肝癌细胞(HepG2)和人类子宫颈癌细胞(HeLa)购自中国典型培养物保藏中心（武 汉），DMEM 培养基干粉购自 Gibco 。噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)购自 Amresco。二甲亚砜(DMSO)购自 Sigma。细胞培养板和共聚 焦

14、专用培养板购自 Nest，BCA 蛋白检测试剂盒和 GelRed 染料分别购自 Pierce 和 Biotium。1.2质粒 DNA 的提取和纯化80pGL3 和 pEGFP 质粒分别是编码萤光素酶和增强型荧光蛋白的基因，在本文中作为报告 基因系统。pGL3 在 JM109 大肠杆菌中转化，而 pEGFP 则在 DH5 大肠杆菌中转化。两种 菌都是在 LB 培养基中以 37，250 转/分的培养箱中过夜培养来扩增。质粒的提取和纯化是 通过去内毒素质粒纯化过程完成的。然后使用 TE 缓冲溶液脱柱，并在20保存。质粒通859095100105110115120过琼脂糖凝胶电泳和紫外 260 nm、

15、280 nm 的吸收比值来验证纯度和产量。1.3苯硼酸修饰的 PEI (PEI1800-BA)的合成与表征将 1.80 g 1800 Da PEI (1.00 mmol)和 0.42 g 4-溴甲基苯硼酸 (0.21 mmol)溶于 15 mL 甲醇 中，该混合溶液在 70 oC 油浴下回流搅拌 24 h。冷却到室温后在乙醚中沉淀三次，真空干燥 后得到 1.63 g 浅黄色粘稠固体（PEI1800-p-BA），产率为 74。1H NMR (300 MHz, D2O): 7.39 (d, 2H, ArH), 7.11 (d, 2H, ArH), 3.61-3.70 (m, 2H NCH2Ph),

16、 2.662.47 (m, NCH2CH2N andNCH2Ph)。同样的方法，将 1.80 g 800 Da PEI (1.00 mmol)和 0.42 g 2-溴甲基苯硼酸 (0.21 mmol)溶于 15 mL 甲醇中，该混合溶液在 70 oC 油浴下回流搅拌 24 h。冷却到室温后用乙醚中沉淀 三次，真空干燥后得到 1.53 g 浅黄色粘稠固体（PEI1800-o-BA），产率为 70%。1H NMR (300MHz, D2O): 7.25-7.02 (m, 4H, ArH), 3.60-3.71 (m, 2H NCH2Ph)，2.762.47 (m, NCH2CH2N)。1.4PEI

17、1800-BA/DNA 复合物的制备PEI1800-BA/DNA 复合物必须在实验前新制备。将 PEI1800-BA 溶于 150 mM NaCl 溶液中， 过滤除菌，制备成 1 mg/mL 的溶液。在 1.5 mL 无菌离心管中加入 2.2 L DNA 的储存液(460 ng/L)和适量已灭菌的 150 mM NaCl 溶液，溶液调至 50 L。按照一定的 N/P 比，在温和震 荡下加入计算对应量的 PEI1800-BA 溶液，与质粒 DNA 混合，形成不同氮磷比(N/P)的 PEI1800-BA/DNA 复合物，涡旋震荡 10 s，该复合物在室温下静置半小时后，用于凝胶电泳、 动态光散射，

18、激光共聚焦以及细胞转染等实验。1.5琼脂糖凝胶电泳将已制备的不同 N/P 比的 PEI1800-BA 和 pGL3 形成的复合物，加入含有 2 L GelRed 染 料的 0.7% 琼脂糖凝胶中进行电泳实验，按照 N/P 比分别为 0、0.5、1、2、4、6、8、10 加 样。凝胶电泳实验条件为恒压 80 V，时间 80 min 后取出凝胶在凝胶成像仪(Vilber Lourmat) 下通过紫外照射成像观察。1.6复合物粒径和电位测定PEI1800-BA 复合物的粒径和电位均在 25时测定。取适量的聚合物溶液和 1 g pDNA 制备不同 N/P 比的 PEI1800-BA/DNA 复合物。混

19、匀后，在室温放置 30 min，然后将复合物溶 液用 150 mM NaCl 溶液稀释到 1 mL 来测定复合物的粒径；用超纯水稀释到 1 mL 来测定复 合物的电势。1.7细胞培养人类肝癌细胞 (HepG2) 和人类子宫颈癌细胞 (HeLa) 用含 10%胎牛血清 (FBS)、2 mg/mL NaHCO3 和 100 U/mL 双抗(1%的青霉素-链霉素 10000 U/Ml)的 DMEM (Gibco) 培养 基在 37 、5% CO2 培养箱中培养。1.8细胞存活率检测材料的细胞毒性用 MTT 法在人类子宫颈颈癌细胞 HeLa 细胞上进行的。以约 5000 细胞/孔的密度在 96 孔培养

20、板中接种 HeLa 细胞，并且每孔中加入 100 L 完全 DMEM 培养基， 并将细胞在 5% CO2 培养箱中于 37 培养 24 h。PEI1800-BA 溶于完全 DMEM 培养基，过滤 灭菌，用培养基将其等比例系列稀释成不同浓度的高分子溶液。每孔细胞中加入 PEI1800-BA 溶液 100 L（对照组直接加入 100 L DMEM 培养基），每个高分子浓度做 4 个平行样，对精品论文125130135140145150155照组做 8 个平行样。继续培养 24 h 后，向所有孔中各加入 20 L MTT 的 PBS 溶液 (5 mg/mL)，于 37 湿润环境中温育 3.5 h。吸

21、出孔中的培养基和过量 MTT，并各加入 150 L DMSO 于 其中，并在室温下轻柔振荡，溶解紫色结晶甲瓒。用酶标仪 (550 型 Bio-rad) 在 570 nm 处 记录吸光值。用酶标仪测定 570 nm 处的吸收 OD570nm。每个高分子浓度及对照组做 4 个平行 样。以药物浓度为横坐标(X 轴)、吸光值为纵坐标(Y 轴)绘制曲线图。根据吸光值计算细胞 的相对存活率。空白组即不加细胞及聚合物溶液，对照组即不加聚合物溶液。细胞相对存活率(%) = 100(实验组 OD-空白组 OD)/(对照组 OD-空白组 OD)1.9基因转染实验1.9.1荧光素酶检测材料的荧光素酶基因转染实验是在

22、 HepG2 和 HeLa 细胞上进行的。细胞以 50,000-80,000 细胞/孔的密度在 24 孔培养板中接种，每孔中加入 1 ml 完全 DMEM 培养基。待细胞在 CO2 培养箱中于 37 下培养 24-36 h 至细胞覆盖率约为 70时，即可开始转染实验。将适量的 聚合物溶液和 1 g pGL3 制备成不同 N/P 的复合物，用 150mM NaCl 溶液稀释至 100 L， 室温下混匀并静置 30 min。转染实验前，先移去 24 孔板内的培养基，并加入 900 L 新鲜无 血清的培养基，再将复合好的 100 L 复合物溶液加入到 24 孔板中，培养 4 h 后再次移去培 养基，

23、换成 1 mL 新鲜完全培养基。继续培养 48 h 后，移除培养基，用磷酸缓冲液 (PBS, 0.1M, pH7.4)轻轻润洗细胞，最后在每孔中加入 200 L 裂解液 (Promega) ，冻融三次并吹打以 充分裂解细胞。离心后，取 20 L 细胞裂解上清液与荧光素酶底物 (Promega, 100 L) 充分 混合，在化学发光仪 (Lumat LB9507, Berthold) 上测定荧光素酶的活性。细胞裂解液中的蛋 白浓度由蛋白测定试剂 BCA protein assay reagent kit (Pierce) 测定，OD 值在酶标仪(Bio-rad550)上 570 nm 读取。每个

24、样品做 3 个平行样测量取平均值，表示为平均值标准偏差(SD)。 细胞中表达的荧光素酶活性用 RLU/mg protein 表示。1.9.2激光共聚焦实验采用了激光共聚焦法观察PEI1800-BA/DNA复合物对HepG2细胞的靶向性。HepG2细胞以1.5105细胞/孔的密度在共聚焦专用培养板中接种，每孔中加入2 mL完全DMEM培养基，然 后把细胞在CO2培养箱中于37 下培养1 d。在实验中，先将2 g DNA和5 l 10 M YOYO-1 (Molecular Probes, U.S.A.) 在37 C培养箱中复合15 min，然后把PEI1800-BA按照N/P为20的比 例加入Y

25、OYO-1标记的质粒DNA中，同样在37 培养箱中复合30 min，得到YOYO-1标记的 PEI1800-BA/pDNA复合物。将该复合物加入细胞中，在无血清的DMEM培养基中培育4 h，进 行转染实验。转染后，培养板中的细胞用PBS洗三次，用4%多聚甲醛固定，再用20 L (2 mg/mL) Hoechst 33258 dye (Molecular Probes, U.S.A.) 来标记细胞核，37 ，15 min。细胞 再用PBS冲洗三次后在倒置相差显微镜(TES2000U, Nikon, Japan)下观察并拍摄照片。2结果与讨论2.1PEI1800-BA 的设计及合成如式1所示，低分

26、子量的1800 Da PEI分别与4-溴甲基苯硼酸和2-溴甲基苯硼酸反应，制 备苯硼酸改性的PEI，即PEI1800-p-BA和PEI1800-o-BA。通过苄溴与胺的烷基化反应，将苯硼 酸接到小分子PEI上。根据核磁计算，平均每个PEI分子上分别接上了2.02（对位）和1.96（邻 位）个苯硼酸，基本上能够完全反应。从式1可以看到，两种苯硼酸接到PEI上会有不同的结精品论文160构，邻位的苯硼酸能和相邻的N形成稳定的五元环结构，也就是所谓的Wullf型苯硼酸。一般而言，由于相邻氮原子的配位作用，Wullf型苯硼酸结合糖类化合物的能力更强，并且适用 的酸碱环境也更宽。BrH2N BNHOH B

27、N OHH2NNH2NHOOHPEIN NN-p-BANH2OH BN N2NNH HBrBHOOHH2N1800H NN NOHHO OH BNNH2NOHBOHPEI1800-o-BA式 1 苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺 PEI1800BA 的制备165170175Scheme 1 Preparation of the phenylboronic acid modified PEI (PEI1800-BA)2.2PEI1800-BA/pDNA 复合物的制备及表征PEI1800-BA/pDNA的制备是通过将PEI1800-BA溶液缓慢滴加到pDNA的溶液中制成的。所 需PEI1800-BA的量是由

28、要测定的N/P比计算得来的，形成的复合物通过琼脂糖凝胶电泳实验 和动态光散射（DLS）表征。如图1 所示，随着N/P 比的增加，材料结合DNA 的能力越来越强。PEI1800-p-BA 和 PEI1800-o-BA分别在N/P为1时就能完全结合DNA，使之不出孔。1800 Da PEI在N/P为4时才能 与DNA形成稳定的复合物4，实验结果显示，这种苯硼酸改性的PEI提高了结合DNA的能力， 使其能在更低的N/P下有效结合DNA。复合物的粒径通过动态光散射法(DLS)在150 mM的NaCl溶液中测定得到，其结果如图2a所示。两种苯硼酸改性的PEI均能在N/P为10到30时与DNA形成直径约为

29、350-450 nm的粒 子。两种复合物的粒径大小远小于1800 Da PEI/DNA,稍大于25 KDa PEI/DNA。180185图 1 N/P 比为 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 时 pDNA 与 PEI-p-BA （a）, PEI-o-BA （b）及 1800 Da PEI (c) 的复合物的凝胶电泳图Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the pDNA released from the polyplex with PEI-p-BA （a）, PEI-o-BA （b），and 1800 Da PEI (c) at the N/

30、P ratios of 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10. Naked DNA was used for comparison复合物的表面电势是在纯水中测定的，其结果如图2b所示。两种苯硼酸修饰的PEI在N/P 大于15后，形成的DNA复合物的表面电势逐渐达到稳定，均在20-30mv左右。这两种复合物 的表面电势处于1800 Da PEI/DNA与25 KDa PEI/DNA之间。其中， PEI1800-o-BA与DNA形成 的复合物表面电势要略小于PEI1800-p-BA /DNA复合物。这可能与苯硼酸上的B能与PEI上的N 形成稳定的五元环配位结构，减少了可质子化的N元素，因而

31、降低了表面电势有关。a140012001000800Size (nm)6004002000PEI-o-BA2PEI-p-BA21800 Da PEI25 kDa PEI0 5 10 15 20 2530N/P Ratios55b 504540Zeta Potential (mv)35302520151050-5PEI-o-BAPEI-p-BA1800 Da PEI25 kDa PEI0 10 2030N/P Ratios190195图 2. PEI-BA/pDNA 复合物在 150 mM NaCl 溶液中的粒径（a）以及在水中的表面电势（b） Fig 2. Size (a) and surfa

32、ce charge (b) of PEI-BA/pDNA polyplexes in 150 mM NaCl solution and water, respectively2.3PEI1800-BA 的细胞毒性采用 MTT 法在 HeLa 和 HepG2 细胞上测定 PEI1800-BA 的细胞毒性。 图 3 显示，PEI1800-BA 系列产物在两种细胞上的毒性均比 25 KDa PEI 低得多，但较 1800 Da PEI 高。图3a 显示 PEI1800-p-BA 在 Hela 细胞上表现出的细胞毒性比 PEI1800-o-BA 小，在浓度为 1mg/mL 时细胞存活率仍大于 50%，

33、而 PEI1800-o-BA 的 IC50 约为 0.22mg/mL。图 3b 显示 PEI1800-p-BA 在 HepG2 细胞上的 IC50 约为 0.22mg/mL；而 PEI1800-o-BA 在浓度在 1mg/mL 时细胞存活率200仍有 50%左右，但是在低浓度区 PEI1800-o-BA 的毒性更大。在 HeLa 细胞上的毒性结果表明，PEI1800-o-BA 由于其能形成 wullf 型苯硼酸的结构，大 大增强了其与细胞表面糖基的作用，从而影响细胞的正常生理代谢，增加了细胞毒性；而 PEI1800-p-BA 不能形成稳定的五元环状结构，在生理条件下与细胞表面糖基的结合能力较弱

34、。a1.21.00.80.6Relative cell viability0.40.2PEI-p-BA PEI-o-BA1800 Da PEI25 kDa PEI0.00.20.40.60.81.01.2Concentration of polymer (mg/mL)b 1.11.0Relative cell viability0.90.80.70.60.50.40.30.2PEI-p-BA PEI-o-BA1800 Da PEI25 kDa PEI0.00.20.40.60.81.01.2Concentration of polymer(mg/ml)205210215220225230图 3

35、 加入 PEI-BA, 1800 Da PEI 和 25 KDa PEI 后 24 小时用 MTT 法测得的 HeLa (a)和 HepG2 (b)细胞的相 对存活率Fig. 3 Relative cell viability of HeLa (a) and HepG2 (b) cells at 24 h after addition of PEI-BA, 1800 Da PEI, and25 KDa PEI as demonstrated by MTT assay根据文献报道，HepG2 细胞表面有一种叫唾液酸化的路易斯抗原 （Sialyl Lewis X）的 寡聚糖。这种寡聚糖大量存在于肝

36、癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺癌、结肠癌以及膀胱癌细胞表 面，并与其肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和预后有着密切的关系。Sialyl Lewis X 由唾液 酸、半乳糖、岩藻糖和 N-乙酰基葡萄糖组成。分子式为 -NeuNAc-(23) - D-Gal- (14) (-L-Fuc-13)- D-GlcNAc。在 Sialyl Lewis X 分子中有 11 个羟基，大都是 cis-1,2 或 1,3 的 双羟基形式存在。许多研究也表明，Sialyl Lewis X 与苯硼酸有相当好的结合能力25-26。在 HepG2 细胞上的毒性结果表明，PEI1800-p-BA 能够与细胞表面的 Sialyl Le

37、wis X 的寡聚糖的 作用从而影响细胞的正常生理代谢导致其毒性增大，而 PEI1800-o-BA 在高浓度时的毒性反而 比 PEI1800-p-BA 小有些出乎意料。2.4PEI1800-BA 为载体的体外基因转染实验PEI1800-BA 的体外基因转染实验通过介导 pGL3 在 HepG2 和 HeLa 细胞上测定，以 25KDa PEI 在 N/P 为 10 时作为评价转染效率的参照物。PEI1800-BA 在 HepG2 和 HeLa 细胞上的转染效率如图 4 所示。对于 Hela 细胞而言， PEI1800-p-BA 在低 N/P 时比 1800 Da PEI 高，但当 N/P 升高

38、时，PEI1800-p-BA 与 1800 Da PEI 基本相当。而 PEI1800-o-BA 比 1800 Da PEI 要高出 2-4 个数量级，在 N/P=15-25 时比参照的25 KDa PEI 在 N/P 为 10 的转染效率也要高出 5-10 倍。对于 HepG2 细胞而言，结果完全不 同，PEI1800-p-BA 显示出相当好的转染效果，比 1800 Da PEI 要高出 2-3 个数量级，在 N/P 为 20-30 时比参照的 25 KDa PEI 在 N/P 为 10 的转染效率也要高出 2-5 倍。而 PEI1800-o-BA 的表现虽然好于 1800 Da PEI，且

39、在低 N/P 比时比 PEI1800-p-BA 转染效率高，但在高 N/P 比 时不如 PEI1800-p-BA。这个结果与前面的毒性测试有一定的对应关系。在 HepG2 细胞表面有一种叫 Sialyl Lewis X 的寡聚糖，这种寡聚糖与苯硼酸有相当好的 结合能力25-26，而在 HeLa 细胞上几乎没有这种寡聚糖。PEI1800-p-BA 的转染效果显示，其 在有丰富 Sialyl Lewis X 寡聚糖的 HepG 2 细胞上有相当好的转染效果，而在 Hela 细胞上表 现不佳。上述结果表明，苯硼酸在转染实验中起到了比较关键的作用, 并且对细胞种类表现出一定的选择性。HeLa10101

40、800 Da PEIPEI-o-PB PEI-p-PB 25 kDa PEIHepG21081800 Da PEI PEI-o-PBPEI-p-PB 25 kDa PEIRLU/mg protein109RLU/mg protein10710810710610610510510152025301015202530N/P RatioN/P Ratio104235240245250255图 4 pGL3 与 PEI-PB 的复合物在 HeLa 和 HepG2 细胞的转染效率（以 25KDa PEI 为参照） Fig. 4 In vitro transfection efficiency of th

41、e polyplexes of pGL3 with PEI-PB in HeLa and HepG2 cells in comparison with 25 KDa PEI而 PEI1800-o-BA 在两种细胞上都表现出较好的转染效果，均比未修饰苯硼酸的 1800 Da PEI 高。这是因为 PEI1800-o-BA 中的苯硼酸由于在苯环邻位上的甲氨基可与苯硼酸形成配位 键而成为五元环的 Wullf 型苯硼酸结构。文献报道，Wullf 型苯硼酸在生理条件下对大多数 糖类分子都表现出较一般苯硼酸更高的结合能力。因此，PEI1800-o-BA 在 HeLa 细胞上表现 出极为优秀的转染效果。比较

42、两种材料在两种细胞上的转染实验，可以得出以下结论：苯硼酸与细胞的相互作用 是提高转染效率的关键。同时，PEI 所带的正电荷仍然起到很大的作用，两种作用起到了协 同作用。在低 N/P 比时，由于苯硼酸修饰的 PEI 提高了与 DNA 的结合能力从而使转染效果 提高；在高 N/P 比时，PEI1800-o-BA 在 HepG2 细胞上转染效果不如 PEI1800-p-BA，其原因有 待进一步探讨。图 5 在 PEI-o-BA/pDNA 复合物 (A)和 PEI-p-BA/pDNA 复合物(B)存在下培养的 HepG2 和 HeLa 细胞的激 光共聚焦显微照片。左: H33258 标记的细胞核（蓝色

43、）；中: YOYO-1 标记的 DNA（绿色）；右：叠加图 Fig5Confocal microscopy images of HepG2 and HeLa cells incubated with PEI-o-BA/pDNA polyplexes (A) and PEI-p-BA/pDNA polyplexes (B). Left: H33258 labeled nucleus (blue)；middle: YOYO-1 labeled DNA (green)； right：overlapped.260为考察 PEI1800-BA/pGL3 对细胞的靶向性，用激光共聚焦显微镜观察了 PEI1

44、800-BA 在HepG2 和 Hela 细胞上的细胞吞噬情况(图 5)。结果表明：两种材料均能有效地携带质粒 DNA 进入细胞，并且能有效地传递到细胞核。对 HepG2 细胞而言，PEI1800-p-BA 比 PEI1800-o-BA 更好；而对 HeLa 细胞而言，PEI1800-o-BA 更好。这样的结果与前面的转染结果类似。综合 毒性、体外转染和共聚焦结果，苯硼酸提高材料的转染效果与其能否有效的结合细胞表面糖精品论文265270275基有密切关系。当苯硼酸能有效结合细胞表面糖基时，其转染效率增高，细胞吞噬增强，同时，由于影响了细胞的正常生理代谢，毒性增大。反之，苯硼酸不能有效结合糖基时，转染 效率不增高，细胞吞噬不强，毒性也低。3结论本文成功合