应用农杆菌介导的生长点转化方法建立甜.doc

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1、精品论文应用农杆菌介导的生长点转化方法建立甜瓜遗传转化技术郝金凤1，荆培培1，张丽2，哈斯阿古拉15（1. 内蒙古大学生命科学学院，内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙 古呼和浩特 010021；2. 内蒙古大学研究生院）摘要：本文以甜瓜品种河套蜜瓜腋芽生长点做外植体，利用庆大霉素基因作为筛选基因，对10影响农杆菌转化的菌液浓度、转化时间、共培养时间进行了正交实验。通过优化转化条件， 建立了农杆菌介导的甜瓜腋芽生长点遗传转化体系。结果表明，采用培养 20d 的无菌苗，以 腋芽作为外植体，预培养 1d；用 OD600=0.7 的菌液转化 10min 后，黑暗中共培养 2d，然后 用

2、 40mg/L 庆大霉素进行筛选；移栽后在叶片上喷洒 20mg/L 庆大霉素筛选转基因植株，效 果最好。通过对庆大霉素抗性苗进行 PCR 检测，初步验证外源基因已经整合进甜瓜基因组，15转化率达到 76%，幼苗移栽成活率为 76.3%。关键词：甜瓜；植物生长点；遗传转化；农杆菌中图分类号：Establishment of Transformation Method for Melon20(Cucumis melo L.) Using Agrobacterium-mediated Plant genetic transformation via Plant Apical MeristemHao

3、Jinfeng1, Jing Peipei1, Zhang Li2, Hasi Agula1(1. College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Inner Mongolia Key Laboratory ofHerbage Endemic Crop Biotechnology, Hohhot, Inner Mongolia, 010021;252. Graduate School of Inner Mogolia University)Abstract: A high-frequency transformation system

4、has been established by Agrobacterium tumefaciens transformation technology and using meristems of axillary buds as transformation receptor. External factors that affect the efficiency of genetic transformation on the base of gentamicin were studied and optimized, such as the bacterial concentration

5、 and the times of30transformation and co-cultivation. The major results were as follows: seedling was grown for 20 days, then axillary buds excised and stabbed were infected with Agrobacterium tumefaciens which OD600 was 0.7 for 10 min. Then after co-cultivation for 2 days, transformed plants were s

6、elected by 20mg/L and 40mg/L gentamicin on the leaves and rooting respectively. It was originally proved by the PCR that expression cassettes had been transferred into the genome. The positive35transformation rate was 76% by the analysis of PCR. And the living rate of the transgenic plants is76.3%.K

7、ey words: melon; plant apical meristem; genetic transformation; Agrobacterium tumefaciens0引言40上世纪 90 年代初，转基因技术逐步应用于甜瓜。1990 年，Fang 等1报道利用根癌农杆 菌侵染甜瓜子叶，成功地将 NPT基因转入了甜瓜。随后利用农杆菌介导法转化甜瓜的研基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（200801260002）；教育部“春晖计划”科研合作 项目(Z2005-2-01003)作者简介：郝金凤（1977-），女（蒙古族），博士，助理研究员，主要研究方向：植物分子生物学及基因

8、 工程通信联系人：哈斯阿古拉（1961-），男（蒙古族），教授，主要研究方向：植物分子生物学及基因工程. E-mail:- 7 -究越来越多2-5，本实验室分别用农杆菌介导法6,7和花粉管通道法8转化了甜瓜品种河套蜜 瓜，但这些都有其不足之处。花粉管通道法受时间和环境条件的限制，农杆菌侵染甜瓜子叶外植体法的转基因植株移栽成活率很低，而且需要脱分化和再分化的繁琐步骤。自从 198845年 Mccabe 等9用基因枪法转化大豆茎尖分生组织获得成功以来，利用植物顶端分生组织作 为基因转化受体的研究日益增多。本研究以甜瓜腋芽生长点作为外植体，优化了农杆菌转化 甜瓜生长点的体系，经抗生素筛选和分子检测获

9、得了阳性植株。1材料和方法1.1植物材料50植物材料为甜瓜品种河套蜜瓜原种，由本实验室保存。1.2菌种和试剂大肠杆菌(Escherichia coli) DH5、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1 菌株、植物 双元表达载体 pPZP221(35S-GUS-nos)由本实验室保存。TaqDNA 聚合酶、dNTP、10PCR buffer、RNaseA 均购自大连宝生物工程公司。提取质粒试剂盒为 Axygen 产品。植物组织培55养试剂及其它各种常规化学试剂均为国产分析纯试剂。1.3甜瓜生长点的农杆菌转化1.3.1培养基及培养条件农杆菌的培养采用 YEB 培养基，

10、pH 值为 7.4。固体培养时加 15 g/L 的琼脂粉。培养 条件为 28。甜瓜转化培养基见表 1。60表 1 植物培养基Table1 Plant medium培养基类型Type of medium培养基成分Component of medium共培养培养基(G)MS+IAA0.1mg/L+6-BA0.1mg/L+3%蔗糖+0.5%琼脂诱导培养基(YY)MS+IAA0.1mg/L+6-BA0.1mg/L+3%蔗糖+0.5%琼脂+Gen40mg/L+Cef200 mg/L生根培养基(R)MS+NAA0.1mg、L+1.5%蔗糖+0.5%琼脂+Gen40mg/L1.3.2无菌苗培养及外植体的制备

11、取饱满甜瓜种子，去壳，用 0.1%氯化汞消毒 10 min，无菌水冲洗 3 次，然后接种于 1/2 MS固体培养基。24-26、光照强度 2500 lux 和 16 h/d 光照条件下培养成苗。采用培养 20d 的无65菌苗，切除叶片，将茎剪成带叶柄的茎段，每个茎段带一个腋芽，将其接种到 MS 培养基上 进行预培养，培养时间为 1 d。每组实验 50 个外植体。1.3.3无菌苗培养及外植体的制备农杆菌菌液的制备：将含有表达载体 pPZP221(35S-GUS-nos)的农杆菌接种于 5mL液体 YEB 培养基(含 100mg/L Rif，100mg/L Spe) 中，28，170rpm 振荡培

12、养至对数生长期，70再取 1mL 活化菌扩大培养于 50mL YEB 液体选择培养基中，28，160rpm 培养约 48h。于4，5000rpm 离心 l0min 收集菌体，再用 25mL 10mmol/L 的 MgSO4 悬浮菌体，4，5000rpm 离心收集菌体，弃去上清液，用 MS 液体培养基悬浮菌体，测其 OD600 值。 转化过程：无菌条件下从预培养的培养基中用镊子轻轻取出预培养 1d 的外植体，用灭菌的细针刺伤腋芽萌发处，每个腋芽滴加 10L 农杆菌转化菌液使之与农杆菌充分接触一定时间75后，用无菌滤纸吸干菌液，置于共培养培养基(G)上，24-26暗处理共培养。共培养结束后， 外植

13、体用 MS 液体培养基+Cef (200mg/L)浸泡 10min，脱菌 3 次，然后用 MS 液体培养基冲 洗 3 次。用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，转入到诱导培养基(YY)上，24-26、光照强 度 1000-2000 Lux 和 16 h/d 光照条件下进行茎的诱导。待长出的嫩茎长到 4-5cm 高时，将其 切下转入生根培养基 (R)上诱导生根。待再生的小植株出现多条健壮根时，去掉封口膜，在80室内炼苗 2-3d，用自来水冲净根部培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:1)的花盆中。1.3.4农杆菌介导的甜瓜生长点基因转化影响因子的优化农杆菌介导的生长点转化过程中优化的影响因子主要有：菌液

14、浓度（0D600 值为 0.2、0.4、0.5 和 0.7）、转化时间（5、8、10 和 15 min）共培养时间（1、2、3 和 4d）。每个处理分 别侵染外植体 50 个，3 次重复。利用 SPSS 软件分析统计再生抗性植株数据，以确定最佳的85转化条件。90951001051101.3.5转化植株的 PCR 检测采用 SDS 法10提取再生植株的基因组 DNA。利用引物设计软件 PrimerPremier5.0，以载体上的启动子和终止子序列设计引物，作为 转基因植株的 PCR 检测引物 35SP1、35SP2 和 nosP1、nosP2，目的片段大小分别为 437bp 和 212bp。另

15、外根据农杆菌 AGL1 中的 Ti 质粒的 VirA 基因设计引物 VirAP1、VirAP2，用于 转基因植株中残留农杆菌的检测，目的片段大小为 346bp。以未转化的甜瓜叶片基因组为阴 性对照。引物序列分别为：35SP1: 5AGGGTCTTGCGAAGGATAG3，35SP2:5GGCGAACAGTTCArACAGAG3；nosP1: 5GCGATAATTTATCCTAGT3，nosP2:5TTTGGCAATAAAGTTTCT3；VirAP1:5TTTCTTGGGTCCGCTTCAGTG3，VirAP2:5ATACCGTCGCCCGTTCGTT3。以上述提取的 300ng 总 DNA 为

16、模板，分别用 35SP1 P2 和 nos P1P2 两对引物进行检测。 为了排除叶片上残留的农杆菌造成的假阳性，再用 VirAPIP2 引物进行检测。PCR 反应体系 含 10PCR 反应缓冲液 2.5L，引物各 0.5mol/L，dNTP 各 0.25mmol/L，Taq DNA 聚合酶0.65U。反应条件分别为：35SP1 P2，94变性 50sec，53退火 50sec，72延伸 1min，30个循环；nos P1P2，94变性 30sec，43退火 30sec，72延伸 30sec ，30 个循环；VirAPIP2，94变性 30sec，57退火 1min，72延伸 1min，30

17、个循环。 计算转化率，转化率(%)= PCR 检测的阳性再生植株数/ 处理的外植体总数100%。2结果与分析2.1农杆菌介导的甜瓜生长点转化体系的优化2.1.1农杆菌菌液浓度对甜瓜生长点转化的影响 农杆菌介导法转化过程中，合适的农杆菌菌液浓度是基因转化的一个重要影响因子。本研究共设计 4 个菌液浓度(以 OD600 来衡量)：0.2、0.4、0.5、0.7，用 SPSS 软件分析农杆菌菌液浓度对甜瓜生长点转化的影响。结果显示 OD600=0.7 的菌液转化效率最好(表 2)。表 2 农杆菌菌液浓度对甜瓜生长点转化的影响Table2 Effect of different concentrati

18、on values on induction of multiple shoot in melon菌液浓度/OD600MeanStd.95% Confidence IntervalErrorLower BoundUpper Bound0.244.9253.13837.24652.6040.457.5003.13850.67166.0290.545.0003.13837.32152.6790.760.8503.13853.17168.5291152.1.2转化时间对甜瓜生长点转化的影响 侵染时间短，附着在外植体受伤细胞处的农杆菌少，转化频率会降低；侵染时间过长会导致外植体褐死，丧失再生能力。本研

19、究共设计4个转化时间：5、8、10、15min，用SPSS软件分析转化时间对甜瓜生长点转化的影响。结果显示转化10min后转化效率最高(表3)。表 3 侵染时间对甜瓜生长点转化的影响Table3 Effect of infection time on induction of multiple shoot of melonErrorLower BoundUpper Bound3.13839.84655.2043.13838.09653.4543.13858.17173.5293.13842.29657.654侵染时间/minMeanStd.95% Confidence Interval547.

20、525845.8501065.0001549.9751202.1.3共培养时间对甜瓜生长点转化的影响共培养过程中根癌农杆菌的增殖和生长状态与其侵染能力相关，直接影响转化的效率。 本研究共设计 4 个共培养时间：1、2、3、4d，用 SPSS 软件分析共培养时间对甜瓜生长点 转化的影响。结果显示黑暗中共培养 2d 转化效率最高(表 4)。表 4 共培养时间对甜瓜生长点转化的影响Table4 Effect of co-culture time on induction of multiple shoot of melonErrorLower BoundUpper Bound135.0003.138

21、27.32142.679263.3503.13855.67171.029356.6753.13849.77165.129453.3253.13845.64661.004共培养时间/dMeanStd.95% Confidence Interval125130通过对以上结果的分析，得到了农杆菌转化甜瓜生长点的最优体系： OD600=0.7 的菌液转化 10min 之后，黑暗中共培养 2d。在后期筛选转基因植株时，通过在叶片上喷洒 20mg/L庆大霉素，诱导嫩茎和生根培养基中加入 40mg 庆大霉素进行筛选。 对转化的影响因素统计结果进行了方差分析，结果可以看出，因素 A(农杆菌菌液浓度)、因素 B

22、(转化时间)和因素 C(共培养时间)对实验结果影响都非常显著(PBA。说明在用农杆菌 AGL1 转化甜瓜腋芽生长点时，对转化效率影响最大的是 共培养时间的长短，其次是转化时间的长短，再其次是农杆菌菌液浓度(表 5)。表 5 转化影响因素的方差分析Table5 Tests of between-subjects effectsSourceType Sum of SquaresdfMean SquareFSig.Corrected Model3682.926(a)9409.21410.389.005Intercept43733.266143733.2661110.269.000A869.53732

23、89.8467.358.020B1017.5323339.1778.611.014C1795.8573598.61915.197.003Error236.339639.390Total47652.53016135140145150155Corrected Total3919.246152.2甜瓜抗性再生植株的获得扦插使甜瓜茎段与母体的分离，可以引起其内部激素的重新分配或重新合成，激活处于 休眠状态的腋生分生组织，启动腋芽的生长进而发育成主干，因此选择了甜瓜腋芽茎段做外 植体。转化后，待长出的嫩茎长到 4-5cm 高时，转入生根培养基 R 上诱导生根。约 95%以 上的嫩茎 20d 后生成数条较

24、健壮的根，约 40d 后形成了较发达的根系，发育成完整的抗性再 生植株(如图 1)。移栽后 60%以上成活。图 1 抗性再生植株1. 腋芽萌发2. 4-5cm 的腋芽茎段3. 再生茎段生根4. 移栽到花盆中成活的再生植株Fig.1 Resistant regenerated plants1. The germination of axillary buds2. The stems of 4-5cm3. Rooting of regenerated stems4. Regenerated plants in pots2.3转化植株叶片上残留农杆菌 AGL1 的检测为了检验转化植株中是否残留有根癌

25、农杆菌 AGL1 菌体，对转化株中 VirA 基因进行了 PCR 检测，结果没有得到扩增条带，证明转化株中不存在根癌农杆菌的污染，这一结论可 以间接证明用此转化技术研究时，外源基因来自于宿主基因组 DNA，而不会有农杆菌菌体 混入，从而在检测外源基因时排除了假阳性的可能(如图 2)。图 2 VirA 引物对再生植株的 PCR 检测1-16. 待检测样品17. 阴性对照18. 阳性对照19. DL2000 分子量标记Fig.2 PCR analysis of regenerated plants with VirA Primers1-16. DNA Samples of regenerated

26、plants17. Negative control18. Positive control4-24. DL2000 DNA Marker1601651701751801852.4 转化植株的 PCR 检测以转基因甜瓜总 DNA 为模板，分别用 35SP1 P2 和 nos P1P2 为引物进行 PCR 检测。电 泳结果显示扩增得到预期大小的特异性片段(见图 3 和图 4)，并与阳性对照具有一致的 PCR 特异性扩增条带，而作为阴性对照的未转基因甜瓜叶片总 DNA 的 PCR 没有得到特异性扩增 产物。说明外源基因己插入到转基因甜瓜基因组中。正交实验的阳性率在 20-70%之间不等， 有的可以

27、达到 73.3%。利用优化体系转化的腋芽生长点阳性率达 76%。图 3 35S 引物对抗性植株的 PCR 检测1.DL2000 分子量标记2. 阳性对照3. 阴性对照4-24.待检测样品Fig.3 PCR analysis of resistant regenerated plants with 35S primers1. DL2000DNAMarker2. Plasmid pPZP221(35S-GUS- nos) as positive control3. Non-transgenic plant as negative control4-24. DNA samples of resist

28、ant regenerated plants图 4 nos 引物对杭性植株的 PCR 检测1.DL2000 分子量标记 2. 阳性对照 3. 阴性对照 4-24. 待检测样品Fig.4 PCR analysis of resistant regenerated plants with nos primers1.DL2000DNAMarker2. Plasmid pPZP221(35S-GUS-nos) as positive control3. Non-transgenic regenerated plant as negative control4-24. DNA samples of re

29、sistant regenerated plants在上述优化的转化甜瓜腋芽生长点体系的基础之上，转化了 50 个腋芽外植体，再生植株经 35SP1P2 和 nosP1P2 两对引物检测，得到 38 株阳性植株，转化率达到 76%。经过生根 后移栽的小植株成活的有 29 株，成活率达 76.3%。3讨论同一植物的不同外植体以及同一外植体的不同发育阶段的转化效率有着明显的差异。植 物茎尖是细胞分裂的旺盛部位，也是农杆菌的敏感部位，所以，容易获得转基因植株。自从1988 年 Mccabe 等9用基因枪首次转化大豆茎尖分生组织获得再生植株，并在 T1、T2 代植 株中检测到了外源基因以来，以植物的生

30、长点作为转基因受体的研究日益增多，并取得重要 进展。2004 年王宏芝等11比较了基因枪法与农杆菌介导法转化小麦不同时期的生长点，结 果发现农杆菌与小麦生长点共培养的转化效率较高，而且植物生长点发育状态良好。本文利用甜瓜腋芽生长点作为外植体，用灭菌针刺伤生长点萌发处创造伤口，进行了农 杆菌转化体系的优化。经过抗生素筛选和分子检测证实其具有较高的转化率，缩短了甜瓜的 再生周期，提高了幼苗移栽的成活率，为甜瓜的遗传转化提供了一条可行的途径。190195200205210致谢感谢高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（200801260002）；教育部“春晖计划” 科研合作项目(Z2005-2-01

31、003)对本研究的支持。参考文献 (References)1 Fang G W，Grumet R. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and regeneration of muskmelon plants. Plant Cell Rep. 1990, (9):160-1642 Yoshioka K, Hanada K, Nakazaki Y, et al. Successful transfer of the cucumber mosaic virus coat protein geneto Cucumis melon L.

32、Japanese Journal of Breeding, 1992, 42(2): 277-2853 Ayub R, Guis M, Ben Amor M, etc. Expression of ACC oxidase antisense gene inhibits ripening of cantaloupe melon fruits J. Nat Biotech, 1996, 14: 862-8664 Bordas M, Montesinos C, Dabauza M, et al. Transfer of the yeast salt tolerance gene HALI to Cu

33、cumis melo L.cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance. Transgenic Res, 1997, 6(1): 41-515 樊继德，孔庆国，张梅等. 子房注射法获得转基因甜瓜植株.园艺学进展(第七辑)，2006，510-5136 哈斯阿古拉，方天棋，张竞秋等. 用反义 Acc 合成酶基因转化河套蜜瓜的研究.云南大学学报(自然科学 版)，1999，21(增刊): 200-2017 郝金凤，财音青格乐，方天棋等. 农杆菌介导的 ACC 氧化酶反义基因转化甜瓜品种河套蜜瓜的研究.内 蒙古大学学报(自然科学版)，2006，3

34、7(1): 54-578 哈斯阿古拉，牛一丁，张丽等. 花粉管通道法转基因技术在甜瓜品种河套蜜瓜上的应用. 内蒙古大学学 报(自然科学版)，2007，35(4): 419-4239 McCab DE, Swain W, MartinellBJ. Stable transformation of soybean by particle acceleration. Bio Technol,1988, 6: 923-92610 周翼明，卫志明，许智宏等. 根癌农杆菌介导转化葛菜获得转基因植株. 植物生理学报，1997，23(1):21-2811 王宏芝，魏建华，李瑞芬等. 农杆菌介导的小麦生殖器官的整体转化.中国农业科技导报，2004 年，6(3):22-26