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1、精品论文污染物对青海弧菌 Q67 的时间依赖微板毒性分析林楠1,2，张晶2，刘树深25（1. 北京大学城市与环境学院地表过程分析与模拟教育部重点实验室,北京 100871；2. 同济大学环境科学与工程学院长江水环境教育部重点实验室,上海 200092） 摘要：污染物在不同暴露时间可能具有不同的毒性变化规律。以青海弧菌 Q67 为受试生物 和 96 孔板为暴露实验载体，通过优化菌液与长期培养基混合比例，在 Q67 生长周期内选取109 个暴露时间节点(即 0.25、2、4、6、8、12、16、20 和 24 h)，建立了污染物或其混合物在不同暴露时间内对 Q67 发光抑制毒性的微板测试方法(简称
2、 T-MTA)；应用 T-MTA 测定了 5种对 Q67 基本无急性毒性抗生素即硫酸安普霉素、氯霉素、硫酸巴龙霉素和硫酸链霉素在 不同时间内的发光抑制毒性。结果表明这些抗生素的毒性具有明显时间依赖特征。关键词：环境科学；时间依赖毒性；抗生素；青海弧菌 Q67；微板毒性分析15中图分类号：X171.5Time-dependent Microplate Toxicity Analysis (T-MTA) ofPollutant to Vibrio qinghaiensis sp. Q67Lin Nan1, Zhang Jing2, Liu Shu-Shen220(1. Laboratory for
3、 Earth Surface Processes, College of Urban and Environmental Sciences, PekingUniversity, Beijing 100871, China;2. Key Laboratory of Yangtze River Water Environment of Ministry of Education, College ofEnvironmental Science and Engineering, Tongji University,Shanghai 200092, China)Abstract: Some pollu
4、tants could have different toxicity features in different exposure times.25Taking Vibrio qinghaiensis sp. Q67 (Q67) as test organism and 96-well microplate as exposure experiment carrier, we developed a time-dependent microplate toxicity analysis (T-MTA) through the optimum ratio of bacterium suspen
5、sion to long-term medium. The T-MTA could detect the toxicities of pollutants to Q67 in many time points such as 0.25, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, and 24 h. The T-MTA was used to determine the time-dependent toxicities of five antibiotics, apramycin30sulfate (APR), chloramphenicol (CHL), paromomycin sul
6、fate (PAR), streptomycin sulfate (STR) and tetracycline hydrochloride (TET) which have basically no acute toxicities to Q67. It was shown that the toxicities of antibiotics displayed the significant time-dependent features.Key words: Environmental science; Time-dependent Toxicity; Antibiotics; Vibri
7、o qinghaiensis sp. Q67; Microplate Toxicity Analysis350引言越来越多的事实表明，环境污染物的毒性大小不仅与污染物浓度有关，也与暴露时间密 切相关。自 20 世纪八十年代中期起，暴露时间作为毒性影响因素就已受到关注1。目前用 于时间毒性研究的生物多为个体较小但不妨碍以个体为单位进行毒性研究的生物2, 3。这40些生物相比于微生物生长周期较长，需要长的实验周期和大的样品体积。近年来，不少学者 开始关注以种群为毒性测试单位的微生物4, 5。2006 年建立了以新型淡水发光细菌青海基金项目：国家自然科学基金(21177097);高等学校博士学科点专
8、项科研基金(20120072110052) 作者简介：林楠(1990-),女,2012 年 6 月获同济大学环境科学学士学位,现为北京大学城市与环境学院直博研 究生。研究方向为环境地理学通信联系人：刘树深(1961-),男,教授,博导,主要研究方向为混合污染物分子模拟与分析毒理. E-mail:- 2 -弧菌 Q67(Vibrio qinghaiensis sp.-Q67)作为受试生物的微板毒性分析方法6。2009 年又建立了对 Q67 的长期微板毒性分析方法5。然而，在急性毒性和长期毒性之间污染物有什么样 的毒性变化规律还是未知。45近 10 年来，药品与个人护理品(PPCP)类物质由于对环
9、境的持续污染及对生物的毒害效 应7, 8已逐渐成为继持久性有机污染物之后的又一类新型污染物，已成为环境科学领域的 研究热点之一9。抗生素作为 PPCP 的主要类型之一近年备受关注。已在水及土壤等各种环 境体系中检测到其存在，抗生素已成为目前环境体系中存在最普遍的污染物之一。在临床用 药以及畜禽养殖中的广泛应用已促使各类病菌对抗生素产生了耐药性10, 11，甚至有学者50提出将抗生素抗性基因视为一类新型环境污染物12, 13。有研究者还发现部分抗生素的短 期急性毒性与长期毒性存在显著性差异以及抗生素的多种搭配可能有更好的效果。那么这些 抗生素在短期与长期之间及在混合物中其毒性是如何变化的？要解决
10、这些问题需要对不同 时间点的毒性变化进行系统观测。本文即在上述背景下，以长期微板毒性分析(L-MTA)法为基础，通过优化混合菌液并考55察青海弧菌 Q67 生长周期，建立了不同时间范围内污染物对 Q67 的发光抑制毒性的微板测 定方法，称为时间依赖微板毒性分析法(Time-dependent microplate toxicity analysis, T-MTA)。 应用该方法测定 5 种环境中普遍存在的抗生素，即硫酸安普霉素、氯霉素、硫酸巴龙霉素、 硫酸链霉素和盐酸四环素的时间依赖毒性。这不仅提供了上述 5 种抗生素在不同时间阶段的 毒性基础数据，同时还为研究其它具有时间依赖毒性的污染物提供
11、检测方法与数据分析手60段。1材料与方法(Materials and methods)1.1试剂与仪器试剂：硫酸安普霉素(APR)、氯霉素(CHL)、硫酸巴龙霉素(PAR)、硫酸链霉素(STR)和 盐酸四环素(TET)等 5 种抗生素全部购自 Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司(德国)，其基本性质见65表 1。采用蒸馏水配制抗生素储备液，保存在棕色瓶中，置于 4 C 冰箱待用。表 1 5 种抗生素的基本性质及储备液浓度Tab. 1 Physical properties and stock solution concentrations of five antibiotics抗生
12、素简写CAS 号化学式分子量纯度Stock (mol/L)硫酸安普霉素APR65710-07-8C21H43N5O15S637.6098.0%2.2010-5氯霉素CHL56-75-7C11H12Cl2N2O5323.1398.5%6.7510-6硫酸巴龙霉素PAR1263-89-4C23H47N5O18S713.7190.0%1.0910-5硫酸链霉素STR3810-74-0C42H84N14O36S31457.3890.0%1.5410-6盐酸四环素TET64-75-5C22H25ClN2O8480.9096.0%1.4410-5主要仪器：PowerWave 微孔板分光光度(美国 BIO-
13、TEK 公司)、150C 型恒温振荡培养箱70(金坛市亿通电子有限公司)、BT25S 型五位电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、SW-CJ-IF 超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)、Eppendorf 单道可调移液器(10-100L) (德国 Eppendorf 公司)和手动 12 道移液器(L12-200) (美国 Rainin 公司)。1.2菌种与培养菌种：淡水发光菌青海弧菌(Q67)(Vibrio qinghaiensis sp.Q67)购自北京滨松光子技术股- 8 -7580859095100105份有限公司。短期培养基6：称取 13.6 mg KH2PO4，35.8
14、 mg Na2HPO412H2O，0.25 g MgSO47H2O，0.61 g MgCl26H2O，33.0 mg CaCl2，1.34 g NaHCO3，1.54 g NaCl，3.00 g 甘油，5.00 g 酵母 粉，5.00 g 蛋白胨，溶于盛有 1000 mL 蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀后，用胶头滴管 逐滴缓慢加入 1 mol/L NaOH，并不断搅拌，调节培养基 pH = 8.5 0.5。分装于 50 mL 锥形 瓶中，每瓶 30 35 mL，用牛皮纸封口，然后置于灭菌器中，在 121 C 下高压蒸汽灭菌 20 min， 取出，室温冷却后，置于 4 C 冰箱保存备用。固体培
15、养基：在短期培养基配方中再加琼脂 1.5 2 %，然后于 121 C 下高压蒸汽灭菌20 min，取出，置于已紫外灭菌 20 30 min 的超净工作台中，稍冷后将 10 mL 左右的培养 基倒于事先已高温灭菌的培养皿中，铺展均匀、冷却后固化。将冷却固化后的平板放入 4 C 冰箱中保存，Q67 培养实验中备用。长期培养基：长期培养基配方组分与短期培养基相同。每 1000 mL 蒸馏水中，除了蛋 白胨为 6.63 g，酵母粉为 8.78 g，甘油为 6.90 g 外，其余组分质量为短期培养基相应组分质 量的 2 倍5。其余制备方式与短期培养基制备方式一致。青海弧菌 Q67 培养：将一支装有 Q6
16、7 冻干粉安瓿瓶先置于常温下约 15 min，在超净工 作台中打开安瓿瓶，取 0.5 mL Q67 复苏稀释液(购自北京滨松光子技术股份有限公司)加入冻 干粉安瓿瓶中，振荡之后置于室温下 10 min，将溶液点在固体培养基平板上，用接种环在平 板上划线，放于恒温培养箱中于 22 1 C 培养 24 h；挑取菌落接种于新平板上，于 22 1 C 培养 12 h 后转接于另一新平板上，将培养好的第 3 代平板倒置 4 C 冰箱中备用；将培养好 的菌种接种到 30 mL 液体短期培养基中，22 1 C 振荡(120 r/min)培养 10 12 h，暴露实验 中待用。1.3时间依赖毒性测试时间依赖毒
17、性测试中的微板设计中各空白对照与暴露处理组采用与长期微板毒性分析 方法相同的布局5。暴露实验前，取培养至对数生长期的青海弧菌 Q67，按菌液与长期培养基体积为 1:1 的 比例混合(称混合菌液)，确保混合菌液相对发光单位(Relative light unit, 简称 RLU)在 2.5105Lum 左右。利用多道移液枪移取 100 L 混合菌液加入微板中 60 个含有 100 L 空白或不同浓度污染物的微孔中，使试液总体积达到 200 L。在 22 1 C 下分别恒温培养 0.25、2、4、6、8、12、16、20 和 24 h，在 PowerWave 微孔板分光光度计(发光检测仪)上测定各
18、孔试液RLU。设置中速振板 3 s，以使 96 孔板中的试液在测试前能够混合均匀。重复 3 板。以 24 个空白对照 RLU 平均值(RLU0)与各浓度梯度 3 个平行 RLU 平均值(RLUj)计算不同 时间下污染物对青海弧菌 Q67 的毒性即发光抑制率(Ej)。jRLU - RLU RLU E = 0 j = 1-j(1)1.4时间毒性数据处理RLU0RLU0110为了揭示不同时间不同浓度污染物对 Q67 发光抑制毒性变化规律，需要对不同时间节 点的浓度-效应数据进行数值模拟。对于具有单调浓度-效应曲线(Concentration-response curve，简称 CRC)特征的浓度-效
19、应 数据，采用非线性 Weibull 与 Logit 函数进行非线性拟合，选择拟合值与试验观测值之间的115120125130135140145相关系数(Correlation coefficient，简称 R)与均方根误差(Root mean square error，简称 RMSE)评价 CRC 模型的拟合优度。对于具有非单调 CRC 特征的浓度-效应数据，采用最小二乘支 持向量回归(Least squares support vector regression, LS-SVR)对浓度-效应数据进行曲线拟合 14，同样采用拟合值与试验观测值之间的 R 与 RMSE 评价 CRC 模型的拟合
20、优度。对于既不能用非线性函数也不能用 LS-SVR 进行拟合的浓度-效应数据和时间-效应数据 使用 Origin 软件中 B-Spline 方法15获得拟合曲线。将浓度-效应曲线(CRC)与时间变量结合起来构建三维时间-浓度-效应曲面。应用不同时 间节点下的拟合 CRC 曲线，设置时间为 X 轴，浓度为 Y 轴，效应为 Z 轴，作三维图。在三 维图中，使用不同的色彩表示效应区间，每个效应区间大小为 0.2，同时在 X-Y 平面投影构 建效应等高线。2结果(Results)2.1混合菌液生长曲线及混合比例的确定混合菌液由培养至对数生长期的 Q67 菌液和长期培养基按不同体积比混合而成。将培 养至
21、对数期的 Q67 菌液与长期培养基分别按 1:1、1:2、1:3 和 1:4 的体积比进行混合，混合 容器选择已高温灭菌的 50 mL 锥形瓶，混合菌液总体积为 25 mL。将装有混合菌液的锥形瓶 放置于 22 1 C 振荡培养箱中培养，每间隔 2 h 检测混合菌液的 RLU，绘制混合菌液在 24 h 内的生长曲线。结果表明，体积比为 1:1 的混合菌液，在 6 8 h 时达到最高 RLU，之后开 始衰减。而体积比为 1:2、1:3 和 1:4 的混合菌液则基本达不到较高的 RLU，故将菌液与长期 培养基的比例定为 1:1。2.2时间依赖毒性同步生长曲线为了检测时间依赖毒性测试过程中 Q67
22、是否处于对数生长期，我们在所有实验中，均 单独设置一块 96 孔板同步测试 Q67 在微孔中的生长曲线，其微板设计与时间依赖毒性测试 类似：微板周边的 36 个微孔加入 200 L 蒸馏水，在剩余 60 个孔中均加入体积 100 L 的蒸 馏水，再加 100 L 混合菌液，使试液总体积达到 200 L。结果表明，7 条生长曲线在 4 16 h 内发光稳定，处于对数生长期。在 16 h 之后，3 条曲线发光强度开始减弱，在 24 h 之后全部曲线都开始衰减，数据呈现不稳定。因此，时间依赖毒性实验的测试时间长度最多 24 h。2.3浓度-效应曲线由 T-MTA 测试的 5 种抗生素不同时间内的浓度
23、-效应数据(点)以及通过非线性最小二乘 拟合、最小二乘支持向量回归(LS-SVR)或 B-Spline 方法得到的拟合 CRC 曲线绘于图 1。用 非线性函数 Weibull 与 Logit 模型拟合的统计量与回归系数(位置参数a和斜率参数b)以及采 用 LS-SVR 拟合，优化的拟合参数(g 和s2)结果见表 2。从图 1 和表 2 可以看出，暴露时间为 0.25 和 2 h 时，5 种抗生素对 Q67 基本无毒性，此 时运用 B-Spline 方法对数据进行拟合；4 16 h 为 Q67 生长期，除了 CHL 在第 4 h 时的 CRC 运用 LS-SVR 拟合外，非线性 Logit 或
24、Weibull 函数对该段时间内的时间依赖毒性数据拟合 显著，R 均在 0.9700 以上；在 12 和 16 h 两个时间节点，R 均在 0.9930 以上；在 12 h，R 均 在 0.9970 以上，对于 APR、CHL、PAR、STR 和 TET，其 R 值分别为 0.9987、0.9975、0.9987、0.9976 和 0.9972；在 20 24 h，Q67 发光强度开始衰减，5 种抗生素在 20 和 24 h 两个时间 节点的浓度-效应数据出现非单调 CRC 特征，通过 LS-SVR 进行曲线拟合。1.0APR1.0CHL1.0PAR0.50.50.5Inhibition0.0
25、0.00.0-0.51E-71E-61E-5Concentration (mol/L)-0.51E-71E-6Concentration (mol/L)-0.51E-7 1E-6Concentration (mol/L)1.0STR1.0TET0.5Inhibition0.5Inhibition0.0-0.51E-8 1E-7Concentration (mol/L)0.01E-71E-6Concentration (mol/L)1500.25h；2h；4h；6h；8h；12h；16h；20h；r24h图 1 5 种抗生素在 9 个时间节点的浓度-效应曲线Fig. 1 Concentratio
26、n-Response Curves of five antibiotics at 9 time points表 2 5 种抗生素在 9 个时间节点的 CRC 模型参数、EC50 和 pEC50Tab. 2 CRC Models, EC50 and pEC50 of five antibiotics at 9 time points模型参数抗生素时间(h)模型函数/g /s2RMSEREC50(mol/L)pEC50APRCHLPAR0.25B-Spline-2B-Spline-4W12.542.540.043420.97428.2910-65.0816W14.032.700.063500.97
27、414.6610-65.3328L15.982.810.045010.99262.0610-65.68712W14.992.690.018890.99871.9610-65.70916W19.973.650.044180.99342.6810-65.57220LS-SVR400.350.000480.99403.4410-65.46324LS-SVR1130.170.000280.99745.1810-65.2860.25B-Spline-2B-Spline-4LS-SVR23392.310.000150.99425.4210-6*5.266*6L10.601.730.053070.97507
28、.4610-76.1278L14.982.310.044580.99003.2810-76.48512W12.891.980.026660.99752.0210-76.69516W14.992.250.038110.99461.5010-76.82520W19.783.050.040230.99462.4810-76.60524B-Spline-0.25B-Spline-2B-Spline-4L13.262.360.037680.98862.4110-65.6196L15.982.850.037580.98932.4710-65.6078L14.992.480.032820.99659.031
29、0-76.04412W13.712.250.019200.99875.5410-76.25616W14.992.450.024470.99815.4010-76.26820LS-SVR360.350.000610.99031.8210-65.73924LS-SVR390.270.000740.98552.2910-65.6400.25B-Spline-2B-Spline-4W13.052.160.033700.98346.1510-76.2116L16.942.600.031220.99333.0510-76.515STR8W13.822.080.039140.99231.5110-76.82
30、012W14.982.200.023940.99761.0610-76.97616W19.992.860.042810.99467.6310-87.11820LS-SVR2000.100.000070.99981.7710-76.75324LS-SVR1000.070.000060.99982.6110-76.5840.25B-Spline-2B-Spline-4L10.712.000.050020.97094.4210-65.3556L12.682.250.028500.99372.3110-65.636TET8L14.992.580.030660.99591.5510-65.81012W1
31、3.282.250.027240.99728.6110-76.06516W18.283.040.043180.99427.3510-76.13420W15.062.590.094540.96721.1110-65.95624B-Spline-155* 因为 4 h 下最大毒性效应未达到 50%，故 EC50 是由拟合 CRC 曲线外推所得。3讨论(Discussion)3.1pEC50 变化曲线为了表征不同时间节点抗生素的毒性大小，以时间为 X 轴，pEC50 为 Y 轴作图，5 种抗 生素从 4 20 h 内的 pEC50 值变化曲线如图 2。7.57.0pEC506.56.05.55.0A
32、PR CHL PAR STR TET48121620Time(h)由图 2 可知，在 4 12 h 内，5 种抗生素 对 Q67 的发光抑制毒性随时间的增加单调增加，其中 PAR 在 4 和 6 h 的毒性变化不显著。 从 12 h 到 16 h，除 APR 的毒性下降外，其它3 个抗生素都为单调增加。从 16 h 之后，Q67发光强度开始衰减，5 种抗生素毒性出现非单 调变化规律，这是否是抗生素对 Q67 产生耐 药性的缘故，还是 Q67 生长衰减所致，有待 进一步考证。4 种抗生素(APR、CHL、PAR和 STR)在 12 h 时的 EC50 分别为 1.96 10-6、图 2 5 种抗
33、生素在 4 20 h 内 pEC50 变化曲线Fig. 2 pEC50 Curves of five antibitics from 4 to 20 h2.02 10-7、5.54 10-7、1.06 10-7mol/L，这160与本课题组的 L-MTA 法16测定的 STR 结的的 STR 结果在 1 个数量级内(2.29 10-7 mol/L)，而 CHL 的结果与 BACKHAUS 等4,17报道 的对费氏弧菌 24 h 的 EC50 (1.86 10-7 mol/L)基本一致。1653.2时间-浓度-效应三维响应面以时间(t)和浓度(c)为 X 和 Y 坐标，发光抑制率为 Z 坐标构建
34、的时间-浓度-效应三维响 应面如图 3。由图 3 可知，5 种抗生素的三维响应面均呈现瀑布状。即同一时间下，低浓度 对应低效应，高浓度对应高效应。低浓度效应随着暴露时间延长可以达到与高浓度在短期暴 露时间内相同的抑制率。投影在 X-Y 平面上的等高线呈现的峰基本在 12 16 h 之间。在 0.25 2 h 时，5 种抗生素均无明显毒性效应，但是随着时间的增加，毒性逐渐明显。这说明有些 污染物比如抗生素，即使处于无明显急性毒性的较低浓度范围，随着暴露时间的延长，也可能产生明显毒性，表明应该对时间毒性变化进行系统观测。1.0APR1.0CHLInhibition0.5Inhibition0.50
35、.00 48 1216 20240.0Inhibition0 48 1216 20241.0PAR1.0STR0.50.5Inhibition0.00 48 1216 20240.00 4 812 1620 241.0TETInhibition0.50.00 48 1216 2024170175图 3 5 种抗生素的时间-浓度-效应三维响应面Fig. 3 Time-concentration-response 3D response surfaces of five antibiotics4结论本文建立了不同暴露时间下污染物对 Q67 的发光抑制毒性的微板测试方法。该法已成 功地应用于 5 种
36、几乎没有急性毒性效应且环境中普遍存在的抗生素对 Q67 的时间依赖毒性测试，表明这些抗生素具有明显时间依赖特征。参考文献 (References)1801851901952002052101 Jay W M, Fishman P, Aziz M, et al. Intravitreal ceftazidime in a rabbit model: dose- and time-dependent toxicity and pharmacokinetic analysis J. Journal of ocular pharmacology, 1987, 3 (3): 257-2622 Hasso
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