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1、精品论文推荐红枝垂组织培养快繁技术的研究1荣冬青，王贤荣 南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京（210037） Email: 摘要：本文以红枝垂（C. subhirtella var. pendula Rosea）的带芽茎段为外植体，接种到MS+1.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA 培养基上，芽的诱导率最高，为 80%；采用正交设计方法， 研究了 6-BA、NAA、蔗糖 3 种不同因素及其组合对红枝垂芽增殖系数的影响，结果表明：细胞分裂素 BA 是幼芽增殖的最主要因素。芽增殖的最佳组合为 A2B3C2 即 MS+0.5 mg/LBA+0.1 mg/L NAA+35 g/L 蔗糖
2、，其增殖系数为 4.15 。当株高在 2-3 cm 时，转入1/2MS+1.0mg/L NAA +1.0mg/L IBA 生根培养基上，接种 25d 后，生根率可达 95%；经过 5-7d的开瓶炼苗，以沙：珍珠岩：蛭石=1：1：1 为基质，20d 后调查，其移栽成活率达 84%。 关键词：红枝垂；快繁；组织培养；正交试验红枝垂（C. subhirtella var. pendula Rosea）隶属于蔷薇科（Rosaceae）樱属（Cerasus）， 是早樱种系下的著名品种1-2，引自日本。其枝条如垂柳般下垂，树形美观，花期在早春 2-3 月，花先叶开放，伞形花序，萼筒形状奇特，颜色粉红至深粉
3、红色，轻柔高洁；满树盛开时， 景色蔚为壮观，具有较高的吸引力和观赏价值，南京玄武湖和梅花山有栽培。目前在樱属植物繁殖技术研究方面，已有大量离体培养的研究，在垂枝樱花类植物中， 徐兆波等对从日本引进的垂枝樱花生长发育特性进行了试验观察，研究了其常规繁殖的砧穗 组合和其抗寒砧木组织培养的条件3，但对红枝垂的繁殖技术还未见报道。随着樱花类植物在园林绿化中的广泛应用，迫切需要探讨出樱花的快速繁殖技术，促进 樱花产业化的迅速发展。本试验在总结前人经验的基础上，试图对早樱种系下的红枝垂离体 再生系统做初步研究，以带芽茎段为研究材料，对组织培养的外植体的启动培养、幼苗增殖 及生根诱导三个步骤的培养，探索主要
4、的影响因素，以期归纳出其组织培养途径快速繁殖的 培养流程，为樱花生产走上工厂化、产业化之路提供科学和技术依据，同时也为其他木本植 物组织培养的相关研究提供一些借鉴。1. 试验材料和方法1.1 试验材料和灭菌处理2006 年 4 月底，从南京玄武湖公园采集红枝垂的当年生半木质化的幼嫩枝条，以带芽 茎段为试验材料。将嫩枝上的叶片全部剪掉，用毛刷蘸洗衣粉洗刷表面，然后枝条剪成约 2cm 的带芽茎 段，流水下冲洗 2h，放于 70%的酒精 30s，然后用无菌水冲洗 4 次，再放入 0.1%Hgcl2（加1-2 滴吐温-20）的溶液中浸泡 8min 后，用无菌水冲洗 5 次，再用无菌滤纸吸干其表面水分，
5、接种于不同培养基上。1.2 培养条件培养温度为 252；日光灯照明，光强为 1500-2000lx；光照时间为 12h/d。1.3 试验方法1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题 SRFDP，编号 2004298001 的资助。-7-试验按 3 个不同的培养阶段设计培养基，通过试验结果分析筛选各阶段的最适培养基。初代培养基添加蔗糖 30g/L（诱导生根时蔗糖量减半)，琼脂 7g/L，添加不同种类及不同浓 度的激素，pH 值为 5.75。1.3.1初代培养基的筛选试验以 MS 为基 本培养 基 ，细胞 分裂素 与生 长 素混合 使用 为 BA0.1mg/L 与 IBA(0.1,0.5
6、,1.0mg/L)组合成 3 个处理；BA1.0mg/L 与 NAA(0.1,0.5,1.0mg/L)组合成 3 个处理； 共 6 个处理（见表 1）。用来诱导腋芽萌发，将消毒后的外植体接种到培养基上，每处理接 种 30 瓶，每瓶接种一个茎段，30d 后统计诱导率，诱导率=诱导出芽的外植体数/接种外植 体数100%。1.3.2幼芽增殖培养基的筛选试验以 MS 为基本培养基，选用 L9(34)设计进行 3 因素 3 水平的正交试验4-7，主要考察 6-BA、 NAA、蔗糖 3 个因素的效应。每个因素设置 3 个水平，6-BA 浓度为 0.1，0.5，1.0mg/L，NAA 浓度为 0.01，0.
7、05，0.1mg/L，蔗糖浓度为 25，35，45g/L。按正交表前三列列出不同的试验 配比，构成 9 种培养基，其因素和水平见表 2。待接种的带芽茎段萌发并抽出幼芽后，切取 幼芽转入 9 种增殖培养基中，每处理 10 瓶，每瓶 3-4 个幼芽，重复三次，30d 后统计增殖 系数，增殖系数=增殖芽数/接种芽数，取 3 次重复的平均值。1.3.3生根培养基的筛选试验在参考相关文献的基础上8-12，采用 1/2 MS 培养基作为幼苗生根的基本培养基。用不 同浓度的 IBA、NAA 及二者组合试验，生根培养基配方见表 5。待培养的幼苗长到 2-3cm 时，然后将幼苗转入到生根培养基。每种培养基接种
8、20 个芽，25d 后统计生根率，生根率%=生根的苗数/培养的苗数100%。1.3.4炼苗与移栽生根培养 35d 后，将株高 4cm 以上，根系发达，叶片展开的健壮幼苗在培养室内去掉 封口膜，炼苗 5-7d 后， 将根系附着的培养基洗净，并用 0.1%的多菌灵蘸根处理，移植于 已作消毒处理的基质中，期间喷洒 1 /1 0MS 大量元素营养液及 1 000 倍液的多菌灵，20 d 后统计试管苗移栽成活率，移栽成活率%=移栽成活苗数/移栽苗数100%。2. 结果与分析2.1 初代培养基对芽诱导的影响芽的诱导与分化离不开植物生长调节物质的参与。不同植物生长调节物质的种类与配比 对芽诱导的效果不同。由
9、表 1 可知，当细胞分裂素 BA 分别与 IBA、NAA 组合使用时，后 者优于前者，可能是由于浓度不同或由于 IBA、NAA 的作用方式不同，外源激素总是通过 植物体的内源激素而起作用。当 1.0mg/L 的 BA 与 0.1mg/L 的 NAA 组配使用时，芽的诱导 率最高，为 80%。幼芽长势旺盛，叶色浓绿，逐渐形成丛芽。当 0.1mg/L 的 BA 与 IBA（0.1，0.5，1mg/L）组配使用时，芽的诱导率均较低，在 0.1mg/L 的 BA 与 1mg/L 的 IBA 组合使 用时，芽的诱导率最低为 23.3%。这说明，较低浓度的细胞分裂素与生长素组合使用时，不 利于芽的启动。表
10、 1 初代培养基对红枝垂芽诱导的影响Table 1 Effects of initial culture mediums on buds induction of C. subhirtella var. pendula Rosea培养基成分及质量浓度 mg/ml接种段数分化数诱导率%MS+BA0.1+ IBA0.1301136.7MS+BA0.1+ IBA0.5301343.3MS+BA0.1+ IBA1.030723.3MS+BA1.0+ NAA0.1302480.0MS+BA1.0+ NAA0.5302066.7MS+BA1.0+ NAA1.0301653.32.2芽增殖培养基对芽增殖的影
11、响由表 3 可见，在所选的 3 个因子及水平中，所有组合均能形成丛生芽 ,但各处理间芽的 增殖系数差异很大。通过对增殖系数的级差分析（见表 4），A 因子的级差最大为 1.51，说 明 BA 在幼芽增殖中起主导作用。其次是 C 因子，其级差为 0.52，蔗糖在组织培养中为幼苗 提供碳源，适当提高培养基中蔗糖含量，降低培养基中的渗透势，可以预防试管苗的玻璃化。 B 因素级差最小为 0.27。表 4 说明不同激素浓度及种类和蔗糖的含量对增殖系数的影响是不 同的。根据表 4，把 A、B、C 三因素对芽增殖系数的相对成程度排成主次顺序，用柱状图表 示出来（见图 1）。图 1 表明，随 A 因素(BA
12、含量)水平的上升，增殖系数先上升后下降，且 三水平差异明显，呈现增加趋势；随 B 因素（NAA 含量)水平的上升，增殖系数呈上升趋势， 且三水平差异不明显；随 C 因素(蔗糖含量)水平的上升，增殖系数先上升后下降，三水平差 异较明显。图 1 还表明，幼芽增殖系数的最佳组合为 A2B3C2 或 A2B2C2。A2B3C2 即 BA（0.5mg/L），NAA（0.1mg/L）,蔗糖（35g/L）。A2B2C2 即 BA（0.5mg/L），NAA（0.05mg/L）,蔗糖（35g/L）。从本实验结果来看，A2B3C2 在本试验中出现，同时也证实了对幼芽增殖系 数较好的组合是 A2B3C2 ，其增殖系
13、数为 4.15，而 A2B2C2 组合没有出现，还需进一步的验 证。表 2 L9(34)因子水平表Table 2 L9 (34) orthogonal design table因子水平因子种类及代码 FactorLevels of factorA6-BA(mg/L)B NAA(mg/L)C蔗糖(g/L)10.10.012520.50.053531.00.1045培养基编号No.of medium123456表 3 正交设计实验结果Table 3 The results of orthogonal experiment因子种类 Factors增殖系数proliferation coefficie
14、nt1.742.372.053.123.41ABC0.1(1)0.01(1)25(1)0.1(1)0.05(2)35(2)0.1(1)0.10(3)45(3)0.5(2)0.01(1)45(3)0.5(2)0.05(2)25(1)0.5(2)0.10(3)35(2)4.1571.0(3)0.01(1)35(2)3.0481.0(3)0.05(2)45(3)2.8691.0(3)0.10(3)25(1)2.50表 4 不同培养基对幼芽增殖的级差分析Table 4 Range analysis on bud proliferation of different mediaKijABCK16.167
15、.98K210.688.649.56K38.48.78.03X12.052.632.67X23.562.883.19X32.82.92.68R1.510.270.5243.53增殖系数2.521.510.50123ABC 因素图 1 因素与增殖系数关系趋势示意图Fig 1 The trend diagram of factors and proliferation coefficient2.3生根培养基对幼苗生根的影响由表 6 可知，不同浓度及其种类生长素的添加均诱导了根的形成。在仅含有 IBA 的两 种生根培养基上，根系比较细弱，呈放射状，达 6-10 条，生根率较低，分别为 60%和 70
16、%。 在仅含有 NAA 的两种培养基上，在茎的基部形成大量愈伤组织，根呈白色，粗壮，没有须 根发生，其生根率分别为 55%，70%。IBA、NAA 二者组合根系较粗壮，基部愈伤组织较少， 并伴随有须根的发生，生根条数多，平均为 7 条，根均长在 2cm 以上。根生长粗壮，根毛 丰富，根呈现淡黄色。在本实验中，1/2MS+1.0mg/LIBA+1.0mg/LNAA 培养基中培养，接种10 天后可陆续出现白色根点，接种 30d 后，长成完整植株，生根率最高可达 95%。表 5 生根培养基配方Table 5 The media of rooting culture激素种类激素浓度(mg/L) Con
17、centration of plant hormonesKind of plant hormones0.51.0IBANAA IBA+NAA 表 6 不同培养基对红枝垂生根的影响Table 6 Effects of different culture media on rooting of C.subhirtella var. pendula Rosea培养基编号接种苗数 NNo. of Culture mediumimplantio. of生根苗数 No. of roots ng201260201470201155201470201890201995生根率% Root rate2.4试管苗的
18、移栽由表 7 可得出，试验处理中以沙：珍珠岩：蛭石=1：1：1 为基质，并 1 /1 0MS 大量元 素营养液及 1 000 倍液的多菌灵进行叶面喷施较有利于红枝垂试管苗的移栽成活，最高成活 率达 84%。表 7 基质对红枝垂移栽成活率的影响Table 7 Effects of cultivating medium transplant livability基质Culltivating移栽株Transplanted成活数Survived成活率%Livabilitymediumnumber/plantplant/plant珍珠岩：蛭石=1：1251664珍珠岩：泥炭=1：1251352蛭石：泥炭
19、=1：1251456沙：珍珠岩：蛭石=1：1：12521843. 结论与讨论在组织培养工作中，一种植物组培的成功，与所选取的外植体材料紧密相连。本研究以 红枝垂当年生的带腋芽茎段为材料，其优点是萌芽率高，易成活，而且有良好的遗传稳定性。 在诱导培养基中，MS + BA 1.0mg/L + NAA 0.1 mg/L 培养基上芽诱导率高，达 80%，芽长势 旺盛。在幼芽增殖阶段，激素的种类浓度、蔗糖含量对增殖有显著的影响。通过正交试验得出，A2B3C2 组合即 MS+0.5mg/L BA + 0.1mg/L NAA+35g/L 蔗糖，为最优组合，其增殖系数为4.15，且长势良好。随着 BA 浓度的
20、增大，芽增殖系数先增加后下降，当浓度为 l .0mg/L 时， 幼苗出现轻微的玻璃化现象，即叶片卷曲，出现微透明状况，这与李云等13在珠美海棠上 的研究相一致。在生根培养基中分别添加 NAA、IBA 两种生长调节物质，外植体的生根率都低于 70%； 在 IBA 与 NAA 组合的两种培养基中，幼苗均能达到 90%的生根率，其中以 1/2MS 十 NAA1.0mg/L +IBAl.Omg/L 培养基的诱导生根效果最好，愈伤组织小、单株根数多、根生长 粗壮，生根率高达 95%。移栽前期试管苗生长在高湿的环境中，基部易腐烂死亡。试管苗移栽前在 600-800 倍的 杀菌剂中浸泡 3-5min，能有效
21、地避免茎腐病发生。试验结果表明：以沙：珍珠岩：蛭石=1：1：1 为基质，并 1 /1 0MS 大量元素营养液及 1000 倍液的多菌灵进行叶面喷施较有利于红枝 垂试管苗的移栽成活，最高成活率达 84%。参考文献1王贤荣，国产樱属分类学研究（博士论文），南京林业大学,1997 2王贤荣.早樱种系的分类及其观赏价值，南京林业大学学报,2000,24(6):44-46 3徐兆波,陈秀云,郭绍霞等.垂枝樱花引种观察与繁育技术研究.莱阳农学院学报,2001,18(1): 32-36 4生物统计学，李春喜，王志.和北京科学出版社,2000 5实验设计与分析，袁志发，周静宇.北京高教出版社,2000 6试验
22、设计与抽样技术，廖桂宗，彭世揆.中国林业出版社,1993 7康冰，于福科,张广军等.应用正交实验筛选玫瑰茎段增殖培养基J.西北植物学报,2003,23(4):653-655.8 Kris Pruski , Tess Astatkie & Jerzy Nowak. Tissue culture propagation of Mongolian cherry (Prunus fruticosa)and Nanking cherry (Prunus tomentosa). Plant Cell, Tissue and Organ Culture ,2005,82: 207-2119 M.S. RAO
23、 and S.D. PUROHIT,In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. BIOLOGIA PLANTARUM 2006,50 (4): 501-50610王光萍，黄敏仁.福建山樱花的组织培养和植株再生.南京林业大学学报（自然科学版），2002，26（2）:73-7511朱志国.紫叶矮樱的离体快速繁殖，安徽农学通报，2005, 11( 3):7212 袁小环，彭向永，李青等. 甜樱桃组培苗的生根研究. 西北农林科技大学学报( 自然科学版) 2004
24、,32(4):71-73,78 13李云,田亭,罗晓芳.珠美海棠试管苗玻璃化发生机理的初步研究.北京林业大学学报,1996,(1):52-58A Study on Tissue Culture and Rapid Propagation technology of C. subhirtella var. pendula RoseaRong Dongqing, Wang XianrongCollege of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing, PCR (210037)AbstractSel
25、ected explants, stem section with bud,were inoculated medium of MS 1.0 mg /L N6 -benzyladenine(BA) and 0.1mg/L -naphthaleneacetic acid (NAA) , the highest shoot induction rate is 80%. The N6-benzyladenine (BA), -naphthaleneacetic acid (NAA) and sucrose were used to compare their effect on shoot prol
26、iferation coefficient in the C. subhirtella var. pendula Rosea by using the orthogonal experiment design. The test result indicated that cytokinins(BA) was the main factor. The optical medium for reproduction of the bud was A2B3C2, namely, MS with 0.5 mg /L BA and 0.1 mg /L NAA+ 35 g/L sucrose; Prol
27、iferation coefficient was 4.15. Plantets were transplanted the 1/2MS medium with1.0 mg/L indole-3-btyricacid (IBA) and 1.0mg/L -naphthaleneacetic acid (NAA) for rooting, when the explants were reached 2-3cm.,the rooting rate could reach 95% after 25 days. Opening the culture bottle during seedling t
28、raining in 5-7d, Substrate with sand, perlite and vermiculite by 1 to 1 to 1 was the optimal. After 20 days the survival rate of transplants reached 84%.Keywords: C.subhirtella var. pendula Rosea , Rapid propagation, Orthogonal Design, Tissue culture作者简介：王贤荣，女，湖北竹山人，博士，副教授，研究方向为植物分类学与资源植物学， 通讯作者，E-mail: , 。图 1 丛生芽的形成；Fig. 1 The form of fasciculated shoot； 图 2 生根培养；Fig. 2 rooting culture； 图 3 组培苗的生根；Fig. 3 Plantlet rooting； 图 4 完整的再生植株; Fig. 4 An intact regeneration plant； 图 5 开瓶炼 苗；Fig. 5 Opening the culture bottle during seedling training； 图 6 移栽后的小苗；Fig. 6 Transplants