超嗜热古菌 Thermococcus spHJ21 产高温 α-葡萄糖.doc

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1、超嗜热古菌 Thermococcus sp.HJ21 产高温 -葡萄糖苷酶条件和酶学性质初步研究杨磊 1,2，吕明生 2，王淑军 2,3，房耀维 2，刘姝 2，李华钟*1,41.江南大学教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡 (214122)2.淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏连云港(222005)3.南京农业大学食品科技学院，南京(210095)4.江南大学医药学院，江苏无锡，(214122)E-mail: 摘要：对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp. HJ21)菌株进行了产 -葡萄糖苷酶条件的优化和酶学性质的初步研究。结果表明：该菌株发酵时间为

2、 6h 时，较适合 产胞内 -葡萄糖苷酶，发酵时间为 21h 时较适合产胞外 -葡萄糖苷酶。其最适产酶温度为85，pH 为 6.5，NaCl 浓度为 2.5%。可溶性淀粉、酵母粉和蛋白胨促进产酶。该酶的最适 作用温度为 100，90半衰期（t1/2）为 2h。最适酶作用 pH 值为 7.0，在 pH 值 5.08.0 之间酶活力相对稳定。金属离子 Cu2、Al3、Ni2对该酶有较明显抑制作用，Hg2几乎完全 抑制该酶的活性，而 EDTA、Fe3和 K对该酶有激活作用。关键词：嗜热古菌；Thermococcus；-葡萄糖苷酶；酶学性质-葡萄糖苷酶(-glucosidase E.C 3.2.1.2

3、0) 又称 -转移葡萄糖苷酶(-transglucosidase E.C 2.4.1.24)，可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开 -1,4 糖苷键，释放出葡萄糖，或将 游离出的葡萄糖残基以 -1,6 糖苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异 麦芽糖（IMO）、糖脂或糖肽等。该酶既具有水解能力，又具有转移能力，-葡萄糖苷酶糖 苷键水解和转移活性的特性可能由于酶结合和催化位点结构的不同引起的13。-转移葡萄 糖苷酶在自然界中分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。在人类的糖 原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。-葡萄糖苷酶在淀粉加 工工业中可以

4、用作糖化酶制剂，与 -淀粉酶一起生产高葡萄糖浆。另外，-葡萄糖苷酶作为 工业化生产 IMO 的关键酶制剂备受国内外食品工业界的重视。目前，国内研究主要集中在医药 -葡萄糖苷酶抑制剂上，而对 -葡萄糖苷酶性质和应 用方面研究报道较少，仅有 Thermus thermophilus、Aspergillus niger 等少数报道。国外对 - 葡萄糖苷酶研究较多，如 Pyrococcus furiosus、P. woesei、Sulfolobus shibatae、S. solfataricus、 Thermococcus zilligii 、 T.hydrothermalis 、 Thermoto

5、ga maritima 和 Thermoanaerobacter ethanolicus 等49。我们对实验室保藏的一株来自深海热液口处的菌株 HJ21 进行了生理生化特征和 16S rDNA 的分析，初步鉴定为属于热球菌属 Thermococcus（另文报道），且发现该菌能产生高 温 -葡萄糖糖苷酶，同时还可以产生高温的高温 -淀粉酶10和普鲁兰酶。本文主要报道该 菌产 -葡萄糖糖苷酶的条件和酶学性质，不仅可为进一步酶基因的克隆和表达打下基础， 而且可望为今后与高温 -淀粉酶一起在淀粉转化葡萄糖的工艺中一起发挥作用提供依据。1材料和方法1.1菌株超嗜热古菌（Thermococcus sp.H

6、J21）由淮海工学院江苏海洋生物技术重点建设实验室本课题得到国家自然科学基金项目（40746030），江苏省“六大人才高峰” 第三批资助项目（06-A-017）和 江苏省教育厅自然科学基金项目（06KJB550004）的资助。- 1 -保藏。1.2 培养基改良 YPS 培养基（1000ml）： 100trace minerals solution 10ml，1CaCl2 H2O 5ml，100N-P mixture 10ml，500Fe EDTA solution 2ml，Resazurin solution 5ml，PIPE 3.35g，酵 母粉 3g，蛋白胨 3g，麦芽糖 5g，硫 5g，

7、pH 6.5。1.3 培养基的制备和菌株培养方法培养基 121灭菌 20min ，加入硫和灭菌的麦芽糖，进行除氧处理。 接种前加入5%Na2S9H2O(w/v)并使之最终浓度为 0.025%，88反应 10min，培养基变为黄色时开始接种。菌株用注射器以 5%接种量接入改良的 YPS 培养基，88培养 9 h11。1.4 产酶条件的研究1.4.1发酵时间对产酶的影响将菌株接入到 YPS 培养基中，在 88下静置培养 36h，每 3h 到 6h 取出测酶活力。1.4.2发酵温度对产酶影响将菌株接入到 YPS 培养基中，分别在不同温度（50、60、70、80、85、90、95、100）下进行产酶发

8、酵试验，培养 9h 后取出测定酶活。1.4.3发酵培养基初始 pH 对产酶影响用 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 将改良的 YPS 培养基的初始 pH 分别调至 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，在 88培养 9 h，测定酶活。1.4.4培养基 NaCl 浓度对产酶的影响在培养基中加入 NaCl，使之终浓度（w/v）分别为 0、1%、2%、2.5%、3%、4%和 5%， 在 88培养 9h，测定酶活。1.4.5培养基碳氮源对产酶的影响去除培养基中的麦芽糖、蛋白胨和酵母粉，以 0.6%（w/v）的硫酸铵作氮源，分别在培 养基加入 0.5的各种碳源（

9、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、马铃薯淀粉、果糖、乳 糖、蔗糖、纤维素）进行碳源对产酶的影响的发酵试验。去除培养基中的蛋白胨、酵母膏， 分别加入 0.3的各类氮源（蛋白胨、酵母膏、酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、酪蛋白、尿素、 胰蛋白胨、鱼粉）进行氮源对产酶影响的发酵试验。1.4.6正交试验设计以蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、时间和 NaCl 浓度为因素设计正交试验 L16（45），蛋 白胨、酵母粉和可溶性淀粉分别用 0.1%、0.3%、0.5%和 0.7%（w/v）四个水平，时间分别 取 18h、21h、24h 和 27h，NaCl 浓度分别取 1.5%、2%、2.5%和 3%（w/v）四水平进行试

10、验。1.5 酶学性质的研究1.5.1酶的作用温度将酶分别在 50、60、70、80、85、90、95、100（水浴）和 110（高 压灭菌锅）温度下，缓冲液为用 pH 7.0 的磷酸钠缓冲溶液（50mmol/L），以 pNPG 作为底 物进行酶活测定。- 9 -1.5.2酶的热稳定性取适量酶液（添加或不添加 Ca2+，终浓度 5mM）分别在不同温度（80, 90, 100）下保 温 4h，每隔 0.5 到 1h 取出一组样品，迅速置于 4冰箱内，待保温结束后统一在标准条件 下测定残余酶活，以未处理的酶液的酶活设为 100%。1.5.3酶的作用 pH 对酶活力的影响用不同 pH 的 40 mmo

11、l / L Brittion-Robinson 通用缓冲液12（40 mmol / L 磷酸-40 mmol/L 硼酸-40 mmol /L 乙酸，用 NaOH 调 pH）取代酶活测定方法中的缓冲液进行酶活测定。1.5.4酶 pH 稳定性酶在不同 pH 的 10 mmol/L 的 Brittion-Robinson 通用缓冲液中常温下 24 h 处理后，加 入 100 mmol /L、pH 7.0 缓冲液恢复 pH，然后在标准条件下测定残余酶活，以未处理的酶液 的酶活设为 100%。1.5.5金属离子和化学试剂对酶活力的影响 将金属离子和化学试剂与酶液混合，使其最终浓度分别达到 1.0mmol

12、/L，5.0mmol/L，然后在 100下测酶活。以未经金属离子和化学试剂处理的作对照（100）。1.6 粗酶液的制备培养 9h 的培养液用滤纸过滤除去硫元素，于 12000g 离心 15 min，取上清液。上清液 中缓慢加入硫酸铵至 65饱和度，4过夜。12000g 离心 30 min，小心弃掉上清，用尽量 少的 25mmol/L pH7.5，Tris-HCl 溶液溶解沉淀，在同样的缓冲液中 4透析过夜后 10000g 离心 10 min，上清即为粗酶液。1.7 测定酶活方法-葡萄糖苷酶活性分析用对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)作底物。取 50L pNPG（浓度为 10mmol/L）

13、、200L 适度稀释的酶液和 200L 0.1mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0）于100水浴中保温 15min，立即加入 400L 1mol/L 预冷的碳酸钠溶液中止反应并显色，用酶 标仪在 405nm 处测定吸光值。酶活力单位定义：在上述分析条件下，每分钟催化产生 1mol PNP 的酶量为一个活力单位13。2结果与分析2.1产酶条件的研究2.1.1 发酵时间对产酶的影响胞内 -葡萄糖苷酶是通过超声破碎法获得。以最高酶活设为 100，由图 1A 可知胞内 -葡萄糖苷酶活在 36h 时，产酶量上升速度较快，到发酵 6h 时，即菌体生长到指数期后 期（图中未画出）产酶量最高，随时间增加，酶活

14、力逐渐下降。胞外酶在 321h 成上升趋 势，在 2130h 时产酶较高，在 21h 时最高。从产酶时间来看，胞内 -葡萄糖苷酶在发酵 较短的时间内产生，胞外 -葡萄糖苷酶需要发酵较长的时间；从产酶量来看，胞内酶产量 比胞外酶产量高。所以，判断 T. sp.HJ21 主要产胞内 -葡萄糖苷酶。2.1.2 发酵温度对产酶影响在 85时 -葡萄糖苷酶产量最高，在 7590产酶量较高。若温度过低，古细菌代时 周期加长，古细菌总量较低，直接影响酶产量；温度过高，古细菌不适或不能生长，产酶量 下降（见图 1B）。2.1.3 培养基初始 pH 值对产酶的影响由图 1C 可以看出在 pH 6.07.5 之间

15、产酶相对较高，在 pH6.5 时产酶量最高，这与初 始设计 pH 相同。过低或过高的 pH 对产酶都有一定的影响。2.1.4 培养基 NaCl 浓度对产酶的影响如图 1D 所示，NaCl 质量浓度对产酶影响比较显著。不加 NaCl 时，不利于菌体生长， 几乎不产生酶，随 NaCl 浓度增加，产 -葡萄糖苷酶的量也逐渐增加，当培养基 NaCl 质量 浓度为 2.5%时，产 -葡萄糖苷酶最高，进一步升高 NaCl 浓度则会对菌体生长和 -葡萄糖 苷酶酶活积累产生一定的抑制作用。A相对酶活Relative activity/%100806040200相对酶活Relative activity/%B0

16、10203040 时间Time/h10080604020050 60 70 80 90 100 110 温度Temperature/相对酶活Relative activity/%相对酶活Relative activity/%CD1008060402004 56 7 8 9 10 11 pH1008060402000123456NaCl/图 1 产酶时间（A）、温度(B)、pH（C）和 NaCl 浓度(C) 对酶活力的影响Fig. 1 The effect of time(A), temperature ( B), pH (C), NaCl concentration (D) on produc

17、tion of -glucosidaseA: ，胞内酶；，胞外酶2.1.5 培养基碳氮源对产酶的影响 用硫酸铵作氮源，研究了单因素碳源对产酶影响的试验，结果见表 1，采用单糖、双糖作为碳源，产酶量不如淀粉类的多聚糖，这可能多聚糖类的碳源对产酶具有一定诱导效应，其中以可溶性淀粉的效果最好。我们以麦芽糖作为碳源，改变培养基中的氮源，研究九种氮 源对产酶的影响，结果见表 1。结果表明无机氮源不利于产酶，有机氮源较适合产酶；以尿素为氮源，发酵 9h 后菌体量较少，产酶量最低；以酵母粉、蛋白胨为氮源产酶较高，其中酵母粉为最好氮源。此数据为培养基成分的正交试验提供了设计依据。表 1 碳氮源对产酶的影响Ta

18、ble 1 Effect of carbon and nitrogen source on production of -glucosidase碳源Carbon sources相对酶活Relative activity(%)氮源Nitrogen sources相对酶活Relative activity(%)麦芽糖 Maltose33.32.67蛋白胨 Peptone57.62.19 葡萄糖 Glucose17.81.56酵母膏 Yeast extract21.31.68 可溶性淀粉 Soluble starch100.01.31酵母粉 Yeast extract100.02.37 糊精 Dex

19、trin84.62.45硝酸铵 NH4NO422.91.13 马铃薯淀粉 Potato starch71.81.41硫酸铵 (NH4)2SO410.30.75 果糖 Fructose25.51.24酪蛋白 Casein24.72.76 乳糖 Lactose30.01.80尿素 Urea16.82.37 蔗糖 Sucrose18.11.19胰蛋白胨 Tryptone37.01.53 纤维素 Cellulose20.50.83鱼粉 Fishmeal25.70.782.1.6 发酵条件的正交试验以蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、时间和 NaCl 为因素，每个因素选取四个水平，采用 L16(45) 正交表

20、进行试验14，考查这几个因子对 T. sp. HJ21 产酶的综合影响，筛选出最优的 培养条件。结果如表 2 所示，级差 R 越大，表明因素对 -葡萄糖苷酶产量的影响越大，本 试验中，因 R5R1R4R2R3，所以这五个因素对 -葡萄糖苷酶产量的影响重要性依次为 NaCl 浓度蛋白胨量时间酵母粉量可溶性淀粉量。由此可以看出在发酵过程中要控制好 NaCl 的浓度和蛋白胨添加量。优化发酵条件为 A4B3C4D2E3，但表中不包含 A4B3C4D2E3，需 要通过补做试验加以验证。在蛋白胨 0.7%、酵母粉为 0.5%、可溶性淀粉 0.7%、发酵时间为21h、NaCl 浓度为 2.5%时发酵试验，结

21、果产 -葡萄糖苷酶 16.46U/L。说明该条件确实为最 适发酵产 -葡萄糖苷酶条件。表2 L16(45)正交试验设计与结果Table 2 Orthogonal experiment design and the results of fermentation conditions实验号No.蛋白胨(%)Peptone酵母粉(%)Yeast extract可溶性淀粉(%)Soluble starch时间(h)TimeNaCl(%)酶活力（U/L）Activity10.10.10.1181.53.5520.10.30.32128.8330.10.50.5242.58.8140.10.70.727

22、34.1850.30.10.32438.5460.30.30.1272.59.0670.30.50.71829.3580.30.70.5211.54.0390.50.10.52723.67100.50.30.7241.55.63110.50.50.121310.78120.50.70.3182.56.45130.70.10.7212.515.50140.70.30.51838.31150.70.50.32728.28160.70.70.1241.59.9K16.3427.8158.3226.9155.373K27.7457.9578.0259.7857.938K36.6329.3056.205

23、8.2209.995K410.4986.148.6656.2977.953R4.1563.1652.463.4884.6222.2 酶学性质研究2.2.1酶的作用温度不同温度下酶活力的变化如图 2A 所示，试验过程中以最高酶活力为 100，图 2 表明， 该 -葡萄糖苷酶在 100时有最大的催化效率，在 110仍有 60的催化活性，而在 70 以下催化效率较低。2.2.2酶的热稳定性如图 2B 所示，Ca2+对 -葡萄糖苷酶有抑制作用。该酶在不加 Ca2+的情况下，80保温4 h，保持 90的酶活力；在 90保温 1 h 时，可以保持 80的酶活力；在 100保温 0.5 h，可以保持 70左

24、右的酶活力。延长保温时间，酶活力呈逐渐下降趋势。相对酶活Relative activity/A100806040200B507090110 温度Temperature/10080604020相对酶活Relative activity/0012345 时间Time/h图2 酶作用温度对-葡萄糖苷酶活性(A)及稳定性(B)的影响Fig.2 The effect of temperature on activity(A) and stability(B) of -glucosidaseB:（，80；，80加Ca2；，90；，90加Ca2；，100；，100加Ca2）2.2.3pH 值对酶活力的影响如

25、图 3A 所示，该酶在较广的 pH 值范围表现出酶活力。最适反应 pH 为 7.0，pH 值在6.08.0 有 70以上的酶活力，在 pH3.04.0 几乎没有酶活力，可能此范围内影响酶的正 确折叠。2.2.4pH 值对酶稳定性的影响结果见图 3B。-葡萄糖苷酶在 pH 值 5.08.0 的范围内较稳定，该酶在 pH5.56.0 处 理后，保持近 100的酶活力，而在 pH3.04.0 处理后，酶活性几乎消失，但总体上该 - 葡萄糖苷酶在较宽 pH 值保持稳定。相对酶活Relative activity/A100806040200B3 4 5 67 8 9 10 pH10080604020相对

26、酶活Relative activity/03 4 5 6 7 8 9 10 11 pH图3 酶作用pH对酶活性（A）及稳定性（B）的影响Fig.3 The effect of pH on activity （A）and stability （B）of -glucosidase2.2.5 金属离子、化学试剂对酶的作用如表 3 所示，Fe3+ 、K+、 Ag+ 、DTT 和 EDTA 对 T. sp.HJ21 的 -葡萄糖苷酶有激活 作用，1mmol/L 的 Cu2+ 、Al3+ 、Ni2、碘乙酸和 SDS 对有明显抑制作用，Mg2+和 Ca2+对 -葡萄糖苷酶有较小的抑制作用，浓度增加，抑制作用

27、更明显。-葡萄糖苷酶对 Hg2比较敏 感，1mmol/L Hg2几乎完全抑制该酶的活性，5mmol/L Hg2时完全让该酶失活。表 3 金属离子和化学试剂对酶活力的影响Table 3 Effect of metal ion and chemical reagent on the glucosidase activity金属离子Metal ion相对酶活（）Relative activity相对酶活（）Relative activity化学试剂Chemical reagent相对酶活（）Relative activity相对酶活（）Relative activity1 mmol/L5 mmol/

28、L1 mM5mMMg2+96.61.5094.82.35三氯乙酸99.63.22102.22.75Fe3+110.52.16104.73.27碘乙酸74.52.3762.11.53Ca2+ Cu2+ K+ Al3+ Ni294.12.2973.50.85116.41.4748.12.8970.61.7290.32.8562.13.27107.21.8840.33.2664.12.59DTT EDTA SDS110.41.46118.32.3260.91.65127.11.36124.32.6256.23.27Ag+Hg2+110.22.673.41.04129.63.2403 讨论微生物发酵产

29、酶水平不仅取决于生产菌种的本身的特性，而且要赋予合适的环境条件才 能充分表达出来。因此我们通过研究环境条件的变化来研究其最佳发酵条件，如发酵时间、 温度、pH、NaCl 浓度和碳氮源等。经研究 T. sp.HJ21 主要产生胞内 -葡萄糖苷酶，这与已 报道文献相似9。发酵温度比 P. furiosus 低（100）14，比 T. hydrothermalis 发酵温度高（80）13。最适发酵碳源为可溶性淀粉，以多糖作碳源比寡糖产酶量高，以酵母粉和蛋白胨为氮源较好，这与已报道古菌文献相同。经研究发现，嗜热古菌 T. sp. HJ21 为厌氧、硫依赖性菌 株，但接种量（1%）和硫添加量（0.2%）

30、对产酶影响不大。经过正交设计优化培养条件， 酶活产量达 16.46U/L。T. sp.HJ21 的 -葡萄糖苷酶最适温度在 100，比 T. hydrothermalis（110）和 P. woesei（110）低，比 S.shibatae（85）和 Thermus caldophilus GK24（90）高9；90半衰期为 2h，80保温 4h 仍然有 85的酶活力，热稳定性较好。-葡萄糖苷酶最适 pH 为 7.0，与 T. zilligii 和 T. sp. AN1 相同，不同于 T. hydrothermalis（6.0）和 P. furiosus（5.06.0）。对金属离子和变性剂也有

31、较强的耐受性，1mmol/L 和 5mmol/L 的三氯乙酸对 - 葡萄糖苷酶影响较小，Ag+、K+、DTT 和 EDTA 对 -葡萄糖苷酶有激活作用，而 -葡萄糖 苷酶对 Hg2+比较敏感，5mmol/L Hg2+完全抑制该酶活性。T. sp.HJ21 产的 -葡萄糖苷酶不同 于已报道的糖苷水解酶，是一种比较新颖的酶。由于古菌生长条件的限制，与细菌和真核微生物相比产酶量普遍偏低，需要人为进行改 造以满足工业生产要求。我们已经克隆出该酶基因开放阅读框（ORF），在 Genebank 中比对 与 T. hydrothermalis 的氨基酸序列高达 90的同源性。我们将对其进行克隆表达以进一步研

32、 究 T. sp. HJ21 的 -葡萄糖苷酶特性，为今后的工业应用的研究奠定了一定的基础。另外，目前对蛋白质的功能和三级结构的关系已成为一个热点，T.sp. HJ21 的 -葡萄糖 苷酶是一个很好的材料，对了解高温酶的嗜热机理和系统进化具有重要意义，同时还可以进 行分子定向进化以研究其特性。参考文献1 Tanriseven A, Dogan S. Production of isomalto-oligosaccharides using dextransucrase immobilized in alginate fibersJ. Process Biochem., 2002, 37:111

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43、ctThe production and characterization of -glucosidase from Thermococcus sp. HJ21 have been studied. Maximum production time of intracellular -glucosidase and extracellular one were around 6h and 27hrespectively. The temperature，pH and NaCl concentration of -glucosidase production were 85, 6.5and 2.5% respectively. Addition of soluble starch, yeast extract and peptone enhanced enzymeproduction. The optimal temperature of the -glucosidase was at 100, and this enzyme exhibited extreme thermostability, with a half-