《金黄色葡萄球菌 α-毒素对 Balbc 小鼠成纤维细胞水通.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《金黄色葡萄球菌 α-毒素对 Balbc 小鼠成纤维细胞水通.doc（6页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、精品论文推荐金黄色葡萄球菌 -毒素对 Balb/c 小鼠成纤维细胞水通道蛋白 1（AQP1）表达的影响1孙成英，李尔然*，王秋月，康健中国医科大学附属一院呼吸疾病研究所, 辽宁沈阳（110001）摘要：目的观察金黄色葡萄球菌 -毒素（-Toxin）对 Balb/c 3T3 小鼠成纤维细胞水通-6-道蛋白 （1AQP1）表达的影响。方法体外培养 Balb/c 3T3 成纤维细胞,给予 -Toxi（n30ug/ml）后，应用 Western-blot 方法检测 4h、6h 时 AQP1 的表达情况。结果金葡菌 -Toxin 作用于 小鼠 Balb/c 3T3 成纤维细胞 4h 时细胞变圆、体积变大
2、，胞核内颗粒增多,AQP1 表达显著增加（7.1939.1%），加入 -Toxin 6h 后细胞呈膨胀状态，胞核体积增大，胞核碎裂，细胞溶 解死亡增多,AQP1 增加达 58.06102.8%。如在 4h 时洗脱毒素，继续孵育至 6h 则 AQP1 仅增加了 27.5%。结论金葡菌 -Toxin 作用于 BALB/c 小鼠成纤维细胞后，细胞体积明显增 大，随着时间增加 AQP1 表达大量增加。去除毒素后，AQP1 增加幅度显著下降。关键词：水通道蛋白 1；金黄色葡萄球菌；-毒素；成纤维细胞水通道蛋白（aquaporins, AQPs）是近年来发现的分布于哺乳动物细胞膜上的特异转运 水的蛋白质家
3、族，广泛分布于包括脑、肺、肾、胃肠道、皮肤及眼等组织中。已知肺部的 AQPs 有 AQP1, AQP3, AQP4, AQP5，它们在肺部的分布各不相同表明了其功能的特异性。 其中 AQP1 主要分布于支气管周围血管床和肺泡毛细血管内皮细胞。一些研究表明 ，病毒、 细菌内毒素可致动物的 AQP1、AQP5 表达下降。金葡菌是临床重要致病菌，可致败血症、 肺炎等严重疾患，而其主要致病因素为其产生的 -毒素（-toxin）。本文选用天然表达 AQP1 的 Balb/c 小鼠成纤维细胞,观察金葡菌 -toxin 对 AQP1 表达的效应，探讨金葡菌的致病机理 及与 AQP1 的关系。1. 材料和方法
4、1.1 材料Balb/c 3T3 成纤维细胞株（购于中科院上海细胞库）。 主要试剂：MEM、优质胎牛血清（GIBCO 公司）；L-型谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、DMSO、金葡菌 -Toxin（Sigma 公司）； BCA 蛋白分析试剂盒(Pierce 公司)；蛋白酶抑制剂（Boelinger 公司）；抗兔 IgG、 ECL-plus (Amersham 公司)；AQP1 抗体(Santa Cruz 公司)； PVDF 膜(BIO-RAD 公司)。1.2 细胞培养及实验分组将 Balb/c 3T3 成纤维细胞培养在 75cm2 培养瓶中，培养液为 MEM，其中加有 10% FBS,2mM L-型谷
5、氨酰胺，青霉素 40units/ml，链霉素 40ug/ml，放在 37含有 5% CO2 的孵箱中 孵育，培养 3 天后，90%细胞单层融合时传代，移入 60mm 培养皿中，细胞数为 5105，24 小时后 80%细胞单层融合时用于实验。分为对照组及实验组，对照组加入生理盐水，实验 组加入 -Toxin 30ug/ml，分别于 4h、6h 采集细胞，并于光镜下观察细胞形态的变化。另外 一组标本在 4h 时洗去毒素继续孵育到 6h 采集细胞。1.3Western-blot：1本课题得到国家自然科学基金（30470766），高等学校博士学科点专项科研基金（20040159011）和教育部 留学归
6、国启动基金（教外司留2004527 号）的资助。配制 12%分离胶，4%浓缩胶，以 20ug 蛋白/每泳道、等体积上样。电泳电压分别为 100V、200V，进行 SDS-PAGE 电泳 2h，0.25A 恒流电转膜 1h。转膜后将 PVDF 膜置于含有 4% BSA 的牛奶阻制剂中，加入一抗（终浓度 1：300），4过夜。Blot wash 液洗膜 3 次共 45min， 加二抗（终浓度 1：5000），室温孵育 1h。洗膜后加 ECL-plus 试剂，然后将 PVDF 膜放入 X 光片暗盒，压片、显影、定影。1.4 数据分析：胶片经 UVP 扫描仪扫描成像，通过计算曲线下面积得到定量光密度值
7、。2. 结 果2.1 -Toxin 对 Balb/c 3T3 细胞形态的影响正常 Balb/c 3T3 细胞形态呈梭形，多角状，分裂相细胞呈类圆形，单层贴壁生长， 加 入 -Toxin 4h 后可见细胞变圆、体积变大，胞核内颗粒增多；加入 -Toxin 6h 后细胞体积更 大，呈膨胀状态，细胞数量减少，胞核体积增大，胞核碎裂，细胞溶解死亡增多（图 1，图2，图 3，X200）。2.2Balb/c 3T3 细胞膜 AQP1 蛋白的表达各组样本中均可检测到 AQP1 的表达,加入 -Toxin 后随着时间的增加 AQP1 表达显著增 加。4h 组较对照组增加 7.19%，6h 组较对照组增加 58
8、.06%（图 4 及图 5）。图 6 及图 7 显示4h AQP1 表达较对照组增加了 39.1%, 4h 去毒素组继续孵育到 6h 时 AQP1 表达仍有 27.5% 的 增加。6h 组较对照组增加 102.8%。3.讨 论迄今已发现十一种水通道蛋白（aquaporins, AQPs）, 并命名为 AQP0-10。其中以 AQP1 研究最清楚，其相对分子量为 28Kd 1, 它在细胞膜上以四聚体的形式存在，每一个单体在 功能上都作为一个独立的水通道。水通过这些高度选择的通道不需要耗能，同时可以阻止离 子的通过，因而保持了膜电位的稳定。目前研究发现，AQP1 在组织中的分布与其介导的水 的通透
9、性密切相关2。AQP1 基因敲除的小鼠出现尿崩症，表明 AQP1 在肾小管的浓缩和稀 释功能方面起了重要作用3。最近的研究发现 AQP1 在肿瘤转移方面也起着重要的作用9 10。但遗憾的是，肺 AQP1 的生理及病理生理意义至今仍不清楚。研究表明，产期大鼠肺 AQP1、AQP4、AQP5 mRNA 表达增加4，基因敲除 AQP5 可致气道高反应（5）6，而腺病毒 感染致肺 AQP1 和 AQP5 显著降低7。本研究组发现大肠杆菌内毒素（脂多糖）致大鼠急性 肺损伤后 412 小时，AQP1 的表达显著下降；2448 小时有所恢复。皮质激素则刺激了 AQP1 的表达11。推测 AQP1 的表达下降
10、可能导致肺泡-毛细血管间水转运障碍，使液体在肺泡腔、 肺间质内积聚，造成肺水肿。AQP1 参与了机体病变时液体转运异常12。谢艳萍等研究显示：脂多糖，肿瘤坏死因子-、白细胞介素-1 致鼠肺微血管内皮细胞 AQP1 表达下降8。我们意外发现遭到细菌污染的细胞 AQP1 的表达大量增加，这个现象引 起了我们的注意。鉴于金黄色葡萄球菌是临床常见的致病菌，耐药菌株高达 90%以上，由 该菌所致的败血症或脓毒血症在临床感染中仍占首位14，因此，我们用金葡菌刺激 Balb/c3T3 成纤维细胞，得到了相同的结果 。众所周知，细菌的致病性与细菌的侵袭力和毒素有 关，细菌毒素则是主要的致病因子13 。该菌能分
11、泌多种毒素，其中主要致病的是 -毒素（-toxin）。-毒素是一类分子量不均一的蛋白质，分子量 2150kDa.，生物活性广泛，除可造成红细胞溶血外，对白细胞、血小板、成纤维细胞、血管平滑肌细胞等均有损伤作用。 已知该毒素是“膜损伤毒素”(MDTs)的一个典型代表，其膜损伤的准确机制尚不明了，目前 的理论认为七个 -toxin 单体可以在细胞膜上形成一个 12mm 的亲水性通道（故也称 -toxin 为“孔形成细菌蛋白毒素” ，Pore-Forming Toxins），引起细胞渗透压的失衡、水内流，导致 细胞肿胀、溶解乃至死亡15-16。可见，这一发病机理中涉及了跨细胞水的流动，可能与膜上 的
12、具有转运水功能的水通道相关。故而我们选用了金葡菌 -Toxin 刺激 Balb/c 3T3 成纤维细 胞。结果显示 4h 时可见部分细胞由原来的梭形逐渐变圆，细胞体积变大，胞浆淡染，坏死 脱落的细胞较少，随着时间的延长，至 6h 时细胞已明显增大，坏死脱落的细胞增加。这与- Toxin 的作用机理相关 15-16。通常情况下,毒素作用于细胞后，细胞的蛋白质合成减少乃 至停止，导致细胞死亡。但本研究显示 -Toxin 与细胞作用 4h 时，AQP1 的表达较对照组增 加了 7.1939.1%，6h 组 AQP1 表达明显增加, 增加了 58.06102.8%。表明 -Toxin 作用于 Balb
13、/c3T3 成纤维细胞后不仅没有使 AQP1 的表达下降，反而却诱导 AQP1 表达大量增加。 由此我们推测 AQP1 很可能参与了 -Toxin 的致病过程。早期的研究表明17-18，冲洗掉培养液中的 -Toxin 后，成纤维细胞可以恢复到正常。那 末，AQP1 的变化是否也如此呢？本研究观察了 4h 洗去毒素继续孵育到 6h 的成纤维细胞， 结果发现 AQP1 的表达较对照组增加了 27.5%，但却小于 4h 组（39.1%）及 6h 组（102.8%）， 可见移去 - Toxin 后，AQP1 的表达未进一步增加，可能与毒素量有关。有研究表明19-20 ， 即使洗脱 -毒素后，仍将有 3
14、040%的毒素附着于细胞表面。毒素作用于细胞 2h 后，细胞 内钾离子快速外流，ATP 减至正常水平的 1020%；在存在血清、pH 7.4 的情况下，钾离子 及 ATP 于 68h 恢复至正常水平。然而造成大孔径损伤的大肠杆菌溶血素及链球菌溶血素 O 作用于成纤维细胞后，上述指标则并未得到恢复。因此认为 - Toxin 损伤的修复过程是由于 它在细胞膜上所形成的小孔道逐渐关闭所致。根据本研究结果，我们推测可能是 毒素单体在作用细胞膜的过程中，亲水性通道形 成后，促使水由细胞外向细胞内流动，导致细胞形态的变化-细胞肿胀、破裂，细胞为了防 御这种损害（或者细菌利用细胞作出这种反应），诱导 AQP
15、1 的表达增加，而移去毒素后， 这种刺激减少，导致 AQP1 的表达减少。确切的机制有待进一步研究。参考文献1 Verkman AS. Physiological importance of aquaprin water channels. Am Med ，2002，34（3）：192-2002 Agre P，Kozodo D. Aquaporin water channel;molecular mechanism for human diseases. FEBS Cell, 2003,555：72-783 Schnermann J ,Chou CL, et al. Defective pro
16、ximal tubular fluid reabsorption in transgenic aquaporinl null mice .Proc Natl Acad Sci USA，1998,95: 9660-9664.4Yasui Y，et al. Perinatal changes in expression of aquaporin 4 and other water and ion transportiesin rat lung . JPhysiol , 1997, 505: 3-115 Song Y，et al .Aquaporin 5 dependent fluid secret
17、ion in airway submucosal glands. J Biol Chem, 2001,276(44):41288-412926 KraneCM.Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. J Proc Nat A cadSci,2001,98:14114-141197 Towne JE, Harrod KS, et al .Decreased expression of aquaporin-1 and aquaporin-5 in mouse lung aft
18、er acute viral infection. J Am Respire Cell Mol Biol , 2000, 22（1）: 34-448 谢艳萍，陈才平，王建春等。脂多糖，肿瘤坏死因子-、白细胞介-1 对肺微血管内皮细胞 AQP1 表达 的影响。中国呼吸与危重监护杂志，2005，4:142-1449 Samira Saadoun，Marios C，ect. Impairment of angiogenesis and cell migration by targeted aquaporin-1 gengdisruption. Nature ,2005, 434:786-79110
19、Xing Y，Ma B，Li T，et al. Acetazolamide inhibit aquarporin -1 protein expression and angiogenesis J . Actapharmocol Sin ,2004,25(6) :812-81611Jiao GY, Li ER, Yu ZJ. Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lungs inrats J . ChinaMedical Journal ,2002,155:963-96712 Yasui Y，et al. perinatal
20、 changes in expression of aquaporin 4 and other water and ion transportiesin rat lung. JPhysiol ,1997, 505:3-1113 Bruce AM，et alToxicology. Cambridge University Press ，199414 陈敏，周陶友，陈文昭等。耐甲氧西林金黄色葡菌球菌感染的临床和耐药性。中华医院感染学杂志，2004，2（14）：223-22515 Alouf JE. Pore porming bacterial protein toxin :an overview
21、.Current topics in microbiology and immunology2001;257:116 Michael Wilson, Rod McNab, et al. Bacterial Disease Mechanisms . Cambridge University Press ，2002，17 Monica Thelestam. Membrane damage by staphylococcal - Toxin to different types of cultured mammalian cell. Biochimica et Boiphysica Acta, 19
22、83,762:481-48818 Walev L, Palmer M, Martin E, et al. Recovery of human fibroblasts from attack by the pore-forming -toxin of Staphylococcus aureus. Microbial Pathogenesis 1994;17:187-20119 King LS，Nielsen S，Agree P. Aquaporin-1 water channel protein in lung : ontogeny, steroid-inducedexpression and
23、distribution in rat. J Clin Invest, 1996，97:2183-219120 K.S. Schweitzer，et al. S aureus Alpha-Toxin Produces Aquaporin-1 Accumulation and Redistribution inCultured Cells. Nature，2005，EFFECTS OF -TOXIN OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS ON AQUAPORIN-1 EXPRESSION IN CULTURED MOUSE BALB/C 3T3 FIBROBLASTSSun Chen
24、gying , Li Erran*, Wang Qiuyue, Kang JianThe first affliliated hospital of China Medical University, Shenyang, China (110001)AbstractObjective To observe the effects of -toxin of Staphylococcus aureus (S.A.) on aquaporin-1 expression of cultured mouse Balb/c3T3 fibroblasts. MethodsMouse Balb/c 3T3 f
25、ibroblasts was exposed to30ug/ml of -Toxin for 4h and 6h. In the other group, -Toxin was wash out in 4h and continued to incubate until 6h. Morphologic change of the cell line exposed to -Toxin was record and AQP1 expression was detected by western blot. ResultSwelling, rounding up and death of the
26、cells was noted in 4h and 6h -Toxin incubation. The expression of AQP1 increased 7.1939.1%, and58.06102.8% in 4h and 6h -Toxin group respectively. The expression of AQP1 increased 27.5% in6h when -toxin was wash out in 4h de-Toxin group ConclusionS.A. -Toxin induced strong up-regulation of AQP1 expr
27、ession in mouse Balb/c 3T3 fibroblasts overtime. AQP1 still had high expression at 6h after withdrawing -Toxin at 4h incubation.Keywords: Aquaporin-1; -Toxin ; Staphylococcus aureus；Fibroblasts作者简介：孙成英(1966 年)，女，汉族，副主任医师，中国医科大学附属第四医院呼吸科； 李尔然，通讯作者。图 1 正常 Balb/c 3T3 细胞形态。细胞主要呈梭形，多角状，分裂相细胞呈类圆形，单层贴壁生长（2
28、00）图 2 加入 -Toxin 后 4h Balb/c 3T3 细胞的形态 可见细胞体积变大，胞核内颗粒增多。（200）图 3 加入 -Toxin 后 6h Balb/c 3T3 细胞的形态。 可见细胞体积更大，细胞数量减少，胞核体积增大，胞核碎裂，细胞溶解死亡增多（200）。图 4 -Toxin 诱导 Balb/c 3T3 成纤维细胞 AQP1 表达180160140120100806040200control 4h 6hcontrol4h6h孵育时间图 5. -Toxin 诱导 Balb/c 3T3 成纤维细胞 AQP1 表达：UVP 扫描蛋白印记（图 4）结果得到的相对密度（AVG）图 6 去除 -Toxin 后 Balb/c 3T3 成纤维细胞 AQP1 的表达80706050 4h对照4h实验406h去毒素306h实验201004h对照 4h实验 6h去毒素 6h实验图 7. 去除 -Toxin 后 Balb/c 3T3 成纤维细胞 AQP1 的表达：UVP 扫描蛋白印记（图 6）结果得到的相对密度（AVG）