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1、山东医药 2 0 0 6 年第 4 6 卷第 1 3 期 5 一 氮胞昔诱导间质干细胞为心肌细胞的 实验研究 贾敏， , 2 ， 曾秋棠， ， 王永奎， ， 韩雪飞2 ， 戚敏， ， 魏经汉” ( 1 华中 科技大学同济医学院附属协和医院， 湖北武汉4 3 0 0 2 2 ; 2 郑州大学基础医学院; 3 郑州大学第一附属医院) 【 摘要7 分离S D大鼠下肢骨， 培养获得骨髓间质干细胞( MS C s ) ， 经5 - 氮胞昔( 5 - a z a ) 定向诱导 2 4 h 后， 用免 疫细胞化学法检测诱导细胞对连接蛋白4 3 和a 横纹肌肌动蛋白的表达， 用逆转录一聚合酶链反应鉴定心肌细胞
2、 特异性蛋白的表达情况。结果显示， MS C s 经5 - a z a 诱导后， 细胞形态不规则口周后 5 - a z a 1 0 K m组细胞连接蛋白 4 3 , 。 横纹肌肌动蛋白阳性表达; R T - P C R显示细胞表达心肌肌钙蛋白I , a , L . 肌肌动蛋白。 提示 5 - a z a 可体外诱导 MS C s 分化为心肌细胞， 用于心肌梗死的治疗。 【 关键词】 骨髓间质干细胞; 诱导; 5 - 氮胞昔; 心肌细胞 【 中图分类号I R 3 2 9 . 2 文献标识码 B 文章编号 1 0 0 2 - 2 6 6 X ( 2 0 0 6 ) 1 3 - 0 0 2 5 -
3、0 2 骨髓间充质干细胞( MS C s ) 是一种具有多向分 化潜能的干细胞， 在一定条件下可分化为软骨细胞、 成骨细胞、 肌细胞等 1 。 近年来， MS C s 被诱导分化为 心肌细胞及其在治疗心肌梗死方面的作用受到重 视。 2 0 0 3 - 2 0 0 5 年， 我们进行了大鼠MS C s 分离培养 和体外诱导为心肌细胞的研究， 旨在为治疗心肌梗 死寻找理想的细胞材料。 1 材料与方法 1 . 1 动物和试剂4 - 6 周龄 S D大鼠， 体重 8 0 - 1 2 0 g ( 郑州大学实验动物中心提供) ; 低糖 D ME M ( G i b c o公司) ; 胎牛血清( H y c
4、 l o n e 公司) ; 5 - 氮胞昔 ( 5 - a z a ) , 胰蛋白酶、 一抗鼠抗人横纹肌肌动蛋白单克 隆抗体、 兔抗鼠连接蛋白4 3 多克隆抗体( S i g m a 公 司) ; 二抗羊抗鼠I g G 、 羊抗兔 I g G( 北京中山公司) 。 总R N A提取试剂盒、 c D N A第一链合成试剂盒均购 自 上海生工， 引物由上海生工合成。 1 . 2 MS C 。 的分离培养将 S D大鼠颈椎脱臼处 死， 浸泡于7 5 %乙醇中5 m i n ， 无菌条件下分离股骨、 胫骨， 清除骨表面附着组织， 去除股骨、 胫骨骨筋， 显 露骨髓腔。 用含胎牛血清的低糖D ME M
5、培养液冲出 骨髓细胞， 收集于离心管中， 1 2 0 0 r / m i n 离心8 m i n , 弃去上清和脂肪， 收取沉于底部的细胞; 加完全培养 液( 低糖 D ME M 培养液、 1 5 %胎牛血清、 青霉素 1 0 0 tL / m l 、 链霉素l 0 0 t c / m l ) 反复吹打， 待细胞分散后 接种于培养瓶中， 放在 3 7 0C, 5 肠C O : 的饱和湿度孵 育箱中培养。4 8 h 首次换液， 以后每 3 d 换液1 次， 随 换液悬浮细胞被清除。原代细胞生长至9 0 0 o 融合时 弃去瓶中原液， 加人 0 . 2 5 %胰酶 2 m l ， 室温消化 3 5
6、 mi n ， 加培养液终止消化。 离心后， 按 1: 3比例重新 接种传代培养。 1 . 3 MS C s 的诱导分化MS C s 第一次传代后 4 8 h 加人 5 - a z a 。设四个实验组和一个对照组。对照组不 加诱导剂， 四个实验组加人的5 - a z a 浓度为 1 1 m组、 5 1i m组、 l o ll m组、 5 0 t c m组， 分别作用2 4 h 后换去含 5 - a z a 的培养液， 用P B S洗涤3 遍， 加完全培养液继 续培养， 每3 d 换液1 次。 1 . 4 免疫细胞化学检测将对照组和各实验组诱 导后 1 , 2 , 3 周的细胞分别用 0 . 2
7、 5 0 o 胰酶消化、 离心 后制成细胞悬液， 按 1 0 5 个/ m l 密度接种于放有无菌 盖玻片的6 孔培养板内爬片， 做免疫细胞化学分析。 待其完全贴壁后， 将玻片上的细胞用4 %甲醛室温固 定 1 0 m i n , P B S冲洗 3 次， 5 m i n ; 分别滴加 1， 1 0 0 , 1 : 2 0 0 稀释的一抗a 横纹肌肌动蛋白、 连接蛋白4 3 ; 4 “C 孵育过夜， P B S如前冲洗; 加人二抗室温孵育 3 0 m i n ; P B S冲洗后， 加D A B液室温显色 2 一 5 m i n , 显微镜下观察并控制显色时间， 显色适度后流水冲 洗终止染色，
8、 苏木素复染核， 中性树胶封片。各抗体 阴性对照采用P B S 代替一抗， 其余操作同上。 胞质中 有棕黄色颗粒的为阳性细胞。 1 . 5 逆转录一聚合酶链反应( R T - P C R ) 鉴定根据 G e n B a n k报道的基因序列， 针对心肌特异性蛋白合 成 引物用于 R T - P C R检测。R a t 心肌肌钙蛋白 I ( c T n I ) 引物: 上游 5 - T G T T G G A T G G G C T G G G C T - T T G - 3 ，下游 5 - A T G T C C T C C T T C T T C A C C T G - C T T G A
9、 - 3 . R a t a心肌肌动蛋 白引物: 上游 5 - T C T T C C A G C C C T C T T T C A T T G G T - 3 ， 下 游 5 - C C G G C C T C A T C G T A C T C T T G C - 3 。分别取对照 组、 各实验组诱导后 2 , 3 周的细胞提取 R N A。总 2 5 山东医药 2 0 0 6 年第 4 6 卷第 1 3 期 R N A提取参考上海生工试剂盒说明书操作。 在禽源 性反转录酶( A MV) 作用下， 4 2 水浴逆转录 l h ， 获 得c D N A o P C R扩增目的片段， 琼脂糖
10、电泳鉴定。 2 结果 2 . 1 MS C s 生长特性接种 2 4 h后出现贴壁细胞; 3 d 后贴壁细胞明显增多， 均匀分布; 5 d时可见多个 贴壁细胞克隆， 细胞呈梭形或纺锤形， 胞核较大， 带 2 一3 个突起; 7 d 后细胞增殖迅速， 逐渐与邻近细胞融 合， 排列有一定方向性， 呈辐射状或漩涡状。原代细 胞 1 2 d 左右融合成片， 传代后细胞体积增大， 8 d 左右 细胞融合， 3 周可见肌管样结构。 MS C s经 5 - a z a 诱导后， 实验组中的 5 f e m组、 1 印m组细胞逐渐增大、 变长， 形态不规则; 1 t c m组变 化不明显; 5 0 K m组细
11、胞大部分死亡。 2 . 2 免疫细胞化学对照组及实验组中的1 K m组 细胞 1 , 2 , 3 周无阳性表达; 实验组中的5 K m组 3 周 时仅少量阳性表达， l o t L m组有较多阳性细胞， 胞质 中有棕黄色颗粒。 2 . 3 R T - P C R鉴定经 1 0 ti m 5 - a z a 诱导后 3 周的 细胞分别扩增出与目的片段大小一致的条带， 表明 其可表达心肌特异性蛋白c T n l 及 。心 肌肌动蛋白， 扩增产物长度分别为2 9 2 , 3 1 5 b p 。其他各实验组及 l o t m组2 周细胞未出现扩增带。 3 讨论 干细胞移植治疗心肌梗死是近年研究的热点。
12、 Wa k i t a n i 等首次证实 5 - a z a 可诱导MS C s 分化为肌 性细胞。Ma k i n o 等研究发现， 5 - a z a 诱导后的细胞能 自发跳动， 检测到类似心肌细胞的动作电位， R T - P C R表明诱导后的心肌细胞含有心肌R N A 。 本文 实验表明， MS C s 取材容易， 体外易于培养， 扩增能力 强， 经 5 - a z a 诱导后能分化为心肌细胞， 但选择合适 的诱导时间及诱导剂浓度很重要。5 - a z a 是一种细胞 毒性物质， 剂量过大易致细胞死亡， 剂量过小不能使 MS C S 向心肌细胞分化。本文实验证实， 第一次传代 后4
13、8 h , 5 - a z a l O lA m作用2 4 h 是诱导MS C S 向心肌细 胞分化的最佳条件， 诱导过早易影响细胞贴壁， 而诱 导过迟则MS C S 不定向分化。 c T n I 仅在心肌细胞中表达， 是鉴定心肌细胞的 特异性蛋白。连接蛋白4 3 参与缝隙连接构成， 在心 脏中主要存在于心房和心室肌内， 与中间连接、 桥粒 一起构成闰盘的三种特殊结构。 连接蛋白4 3 表达阳 性， 说明心肌细胞间具有形成闰盘结构的形态学基 础， 这便于细胞间化学信息的交流和信号传导， 维持 电活动和机械收缩、 舒张功能的同步性 3 1 ， 对保持心 肌功能非常重要。 本文结果显示， MS C
14、 S 经 5 - a z a 诱导后， 细胞形 态不规则， 3 周在 5 - a z a l 印m组细胞连接蛋白4 3 , a 心肌肌动蛋白表达阳性。说明5 - a z a 可诱导MS C S 分化为心肌细胞。T o m i t a 等 4 1 研究发现， 5 - a z a 可使 MS C S分化成心肌样细胞并形成肌管。5 - a z a诱导 MS C S 定向分化为心肌细胞的确切机制还不清楚。 5 - a z a 是一种D N A甲基化抑制剂， 可与D N A共价结 合形成复合物， 导致 D N A甲基在细胞分裂周期中进 行性丢失， 发挥去甲基化作用， 其去甲基化作用可使 基 因印记丢失，
15、 使某些相关等位基 因得以表达。 K o n i e c z n y等对鼠胚胎细胞系 C 3 H1 0 T 1 / 2由5 - a z a 诱导分化为心肌细胞的研究发现， 这些细胞含有肌 源性决定位点， 当其处于甲基化状态时无转录活性， 5 - a z a 可使其去甲 基化而具有转录活性， 促使其向肌 源性细胞分化。因此推测， 5 - a z a 诱导 MS C S 定向分 化为心肌细胞可能是其激活了MS C S 携带的决定肌 细胞表达的基因位点， 但其确切的机制需进一步研 究 。 【 参考文献】 1 P i t t e n g e r MF , Ma c k a y A M, B e c k
16、 S C . Mu l t i l i n e a g e p o t e n t i a l o f a d u l t h u m a n m e s e n c h y m a l s t e m c e l l J 二 .J S c ie n c e , 1 9 9 9 , 2 8 4 ( 5 4 1 1 ) : 1 4 3 - 1 4 7 . 2 Ma k i n o S , F u k u d a K , Mi y o s h i S , e t a l . C a r d i o m y o c y t e s c a n b e g e n e r a t e d f r o
17、m m a r r o w s t r o m a l c e l l s i n v i t r o J . J C l i n I n v e s t , 1 9 9 9 , 1 0 3 ( 5 ) : 6 9 7 - 7 0 5 . 3 T o y o f u k u T , Y a b u b i M, O t s u K, e t a l . I n t e r c e l l u l a r c a l c iu m s i g n a l i n g v i a g a p j u n c t i o n i n c o n n e x i n - 4 3 t r a n s f
18、 e c t e d c e l l s J 7 . J B i o C h e m, 4 T o m i t a S , c t i o n b o n e 1 9 9 8 , 2 7 3 ( 3 ) : 1 5 1 9 - 1 5 2 8 Mi c k l e D A, We i s e l R D, e t a l . I mp r o v e d h e a r t m y o g e n e s is a n d a n g i o g e n e s i s a f t e r a u t o l o g o u s 宜 n arrows t r o ma l c e l l t r a n s p l a n t a t i o n L J _ : 1 1 3 2 - 1 1 4 0 . ( 收稿日期: p o r c ine T h o r a c C a r d i o v a s c S u r g , 2 0 0 2 , 1 2 3 ( 6 ) 2 0 0 5 - 1 2 - 1 4 ) 告读者 山东医药 杂志被美国 化学文摘 列为来源期刊 经美国化学文摘杂志社中国文献处理中心通知， 山东医药 杂志自2 0 0 6 年起已被世界六大著名检索期 刊之一的美国 化学文摘 ( C A) 列为来源期刊， C O D E N号为S Y H I A J o 本刊编辑部