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1、日 全国船舶标准化技术委员会专业标准 C B * 3 3 2 8 . 1 -3 3 2 8 . 6 - 8 8 船舶污水处理排放水水质检验方法 1 9 8 8 一 0 2 一 1 2发 布1 9 8 9 一 0 3 一 0 1实施 全国船舶标准化技术委员会发 布 全国船舶标准化技术委员会专业标准 船舶污水处理排放水水质检验方法 大肠菌群 数检验法 C a “ 3 3 2 8 . 1 一8 8 分类号 U 4 7 适用范围 本标准适用于船舶生活污水处理排 放水水质的大肠菌群数检验方法， 也可用于 其他废水、 河、 海水 等的大肠菌群数的检验。 原理 大肠菌群( c o l i f o r m g
2、 r o u p ) 是一群在 3 5 - - 3 7 培养 2 4 - 4 8 h 能发酵乳糖， 产酸产气的需氧和兼性厌 氧的、 革兰氏染色阴性反应的不形成袍子的杆状细菌， 其中 包括提高温度至4 4 . 5 士 。 . 2 培养2 4 h 之 内， 能产酸产气的粪性大肠杆菌。 采用多管发酵法， 以最可能数( m o s t p r o b a b l e n u m b e r ) 为指数， 即为大肠杆菌类细菌数目的指数。以 M P N表示大肠菌群数。 培养垂种 类及配制 3 . 1 月桂酞胰膘液态培养基( l a u r y l t r y p t o s e b r o t h ) (
3、 假定试验培养基) 胰膘生物试剂2 0 . 0 g 乳糖分沂纯5 . 0 9 磷酸氢二钾 K , H P O 。分析纯2 . 7 5 g 磷酸二氢钾 K H , P O .分析纯2 . 7 5 g 氯化钠N a C I分析纯5 . 0 g 月桂酞硫酸钠分析纯0 . 1 g 蒸馏水IL 灭菌前， 将上述配好的培养溶液分装入发酵管中， 所加入培养液的量。 必须使培养液在灭菌后还能 淹没发酵管内倒立的小管瓶。所加的培养基配制按表 1 规定。 表 1 月桂酞胰膘液态培养基的配制 接种水样 mL 试管 内 培 养 基 的 量 mL 培养荃+接种的总量 m L 所需脱水的月桂酥胰膘 液态培养基的浓度 mg
4、 / L 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 I 0 或 稍 多 1 0 2 0 5 0 3 5 2 0 1 1或稍 多 2 0 3 0 1 5 0 1 3 5 1 2 0 3 5 . 6 71 . 2 5 3 . 4 1 0 6 . 8 1 3 7 .1 2 1 3 . 0 全国船舶标准化 技术委员会1 8 8 8 - 0 2 一 1 2 批准 198 9一 0 3一 0 1实施 C BS 3 3 2 8 . 1 一8 8 灭菌后 p H值应为 6 . 8 e 3 . 2 亮绿乳糖胆汁液态培养基( b r i l l ia n t g r e e n la c t o s
5、 e b i l e b y o t h ) ( 确信试验培养基) 陈生物试剂1 0 . 0 g 乳糖分析纯1 0 . 0 g 牛胆生物试剂2 0 . 0 g 亮 绿分析纯。 . 0 1 3 3 g 蒸馏 水1L 分装按3 . 1 条规定。 灭菌后p H值应为 7 . 2 , 3 . 3 E C培养基( 确信试验及粪性大肠杆菌培养基) 胰膘或胰酪生物试剂2 0 . 0 g 乳糖分析纯5 . 0 g 胆盐混合物或 3 号胆盐分析纯1 . 5 g K ,H P O分析纯4 . 0 g KH, P O分析纯1 . 5g N a C l分析纯5 . 0 g 蒸馏 水IL 灭菌后p H值应为 6 . 9
6、 分装按3 . 规定。 3 . 4 A - 1 液态培养基( A - 1 b r o t h ) ( 粪性大肠杆菌培养基) 乳糖分析纯5 . 0 g 胰陈生物试剂2 0 . 0 g Na C l分析纯5 . 0g 水杨贰生物试剂0 . 5 g 聚乙烯乙二醇对异辛基苯乙醚分析纯1 . 0 m l , 蒸馏 水IL 先将固态配料溶解， 再加入聚乙烯乙二醇对异辛基苯乙醚。调节p H值为6 . 9 士0 . 1 ， 分装入发酵管 中， 所加入培养液的量， 必须使培养液在灭菌后还能淹没发酵管内倒立的小管瓶。所加的培养基配制按 表 1规定。 3 . 5 乳糖胆盐培养基( 假定试验培养基) 直接采用市售成品
7、， 配制根据产品说明书。 3 . 6 稀释液的配制 a . 所用蒸馏水应不含有痕量的溶解金属， 灭菌或抑菌物质; 去离子水也可; b . 缓冲液; 配制磷酸盐缓冲储备液， 将 3 4 . 0 g 磷酸二氢钾( K H , P O , ) 溶解在5 0 0 m l , 蒸馏水中， 用 1 N的氢氧 化钠溶液调节p H值到 7 . 2 士0 . 5 ， 然后再加燕馏水稀释到 1 L e 把 1 . 2 5 m L的磷酸盐缓冲储备液和 5 0 m L的氯化镁溶液 ( 3 8 g 的Mg c l ， 加 1 L蒸馏水) 加到 1 L蒸 馏水中， 分装到瓶子内， 分装的量以蒸汽压灭菌 1 5 m i n
8、 后能维持 9 9 士2 . 0 mL 或 9 士0 . 2 m L为度。 c 陈溶液; d . 稀释液; 将以上配好的陈溶液， 用缓冲液 ( 见 3 . 6 b 条) 稀释至一定量， 以得 0 . 1 %的脉的水溶液， p H值最后 应为6 . 8 ， 在蒸馏水中配制 1 0 %的陈溶液。 分装的量， 以蒸汽压灭菌 1 5 m i n 之后能维持 9 9 士2 . 0 mL或9 士0 . 2 m L为度。 C B “ 3 3 2 8 . 1 一8 8 注意: 在任何稀释水中制备细菌悬浮液， 不准在室温下停留3 0 m i n以上。 3 . 7培养基 的灭菌 配制好的培养基， 应立即分装到发酵
9、管中， 并在2 h 之内进行灭菌。灭菌温度为 1 2 1 C， 并在这一温 度下保持 1 5 m i n 。当灭菌气压降草零后， 应立即将培养基从蒸汽压灭菌器中取出， 冷却， 存放备用。 3 . 8 培养基的存放 3 . 8 . 1 成品粉状培养基必须放在干燥、 温度低于 3 0 的暗处， 一旦粉末结块状应弃去。 3 . 8 . 2 每次配制培养基量以一周内用完为度。存放在避光、 温度 2 -4 的条件下。存放的发酵管， 使用前应预先培养过夜， 弃去有气泡的管子， 经存放若管内液体损失超过 1 m L时， 也应弃去。 仪器 4 . 1 隔水式恒温培养箱( 温度在 2 0 -5 0 C ) 4
10、. 2 热空气灭菌烘箱1 7 0 士t o 0C 4 . 3 高压蒸汽灭菌器温度在 1 2 1 C 4 . 4 恒温水浴锅 4 . 5 电冰箱 4 . 6 药物天平精确至 0 . 1 g 4 . 7 发酵试管5支1 5 5 m m 4 . 8酒精灯 4 . 9 酸度计( p H计)精度 士0 . 1 个单位 4 . 1 0 接种器 4 . 1 1 采样瓶5 0 0 m L小口玻璃瓶 4 . 1 2 其他细菌培养所用的材料: 脱脂棉、 牛皮纸、 绳等。 采样 5 . 1 采样前处理。 5 . 1 . 1 含游离氯水样的采取。 对于含游离 氯的水样， 应在水样瓶消毒前就把脱氯剂加入瓶内， 硫代硫酸
11、钠( N a , S , O , ) 或亚硫酸 钠( N a , S O) 。 加 入 量 根 据 水 样中 所 含 游 离 氯 量 确 定， 测 定 分 析 按C B * 3 3 2 8 . 6 - 8 8 船 舶 污 水 处 理排 放水水质检验方法游离氯和总氯检验法 进行 5 . 1 . 2 无氯水样的采取不须加人脱氯剂。 5 . 1 . 3 水样瓶洗涤与消毒 水样瓶洗涤干净后， 应以蒸馏水或去离子水冲洗三次。洗涤完毕， 消毒前， 需加脱氯剂的， 加入脱氯 剂， 不需加脱氯剂的直接以牛皮纸包封好瓶塞外部。放在高压蒸汽灭菌器中在 1 2 1 下消毒 1 5 m i n ; 或 在 7 0 干
12、热灭菌至少 6 0 min 5 . 2 采样程序 用5 . 1 . 3 消 毒过的采样瓶采样。 采样前， 完全打开出水阀， 让其自然流出2 -3 m i n , 然后节制水流进行采样。 采样时， 瓶盖所包的纸要和盖成一体拿开， 小心避免弄脏， 不准手握瓶塞或抓瓶颈部， 应握住近瓶底 部， 让水样注人， 取样液面距瓶口至少 2 . 5 c m， 取好样后， 当即塞好瓶塞， 包封好， 送检。 5 . 3 水样贮存 水样采集后， 应立即进行检验， 若 1 h 之内不能检验应放在 1 0 以下冰箱中暂存不可超过2 h e C B S 3 3 2 8 . 1 一8 8 6 检验 手续 6 1 检验种类
13、a .假定试验; 、 确信试验; c . 粪性大肠杆菌试验。 采用 A - 1 液态培养基时， 不做确信试验。如果假定试验所有发酵管都是阴性反应时不必做确信试 验， 即可得到结果为无大肠菌群。通常水样必须作确信试验。 船舶污水处理排放水水质的大肠菌检验用A - 1 液态培养基的多管发酵试验检验粪性大肠杆菌。 6 . 2 假定试验 使用 3 . 1 培养基或 3 . 5 培养基。 6 . 2 . 1步骤 e .水样稀释操作 见图 1 ) . 发醉汁 图 1 稀释操作 b 以消过毒的移液管对一系列假定试验发酵管 ( 管内装有3 . 1 培养基)接种水样。每个水样取发 酵管 1 5 支组成一个系列，
14、 即每5 支为同一稀释度接种水样 ( 1 m L 的十进倍数或约 数) 。 所用稀释水按 3 . 6条提供。 如 果水 样 用1 0 0 m L 的 量 ， 应该 先 将 水 样瓶 在3 5 C 预 温。 发 酵 管内 所 加 水 样量 应 按 表1 规 定。 力 6 入水样后， 要充分混合。 c接种 后的发酵管. 放在3 5 士 。 . 5 C 培养。 2 4 士 2 h 后， 轻轻 摇荡每支试管， 并做 检验， 如果里面没 有气体产生， 应继续培养。在第 4 8 士3 h时再检查， 记录有无气体产生， 气体的量不计。 62 . 2 解释试验结果 如果在 4 8 士3h 之内， 在管内的发酵
15、管或小管瓶中产生了任何量的气体， 便可断定为阳性假定试 验。注意切不可以将发酵管内培养基清晰而含有气泡误为阳性反应。4 8 士3 h培养后， 仍不见气体产 生。即表示结果为阴性。 假定试验步骤详见图 2 , C B S 3 3 2 8 . 1 一8 8 假 定试 验 图 2 6 . 3 确信试验( c o n f i r m e d t e s t ) 步骤( 见图3 ) 培养基采用3 . 2 ， 用复发酵管发酵。 6 . 3 . 1 凡 4 8 士3 h之内假定试验发酵管产气者， 全部进行确信试验。 把假定试验发酵管产气者， 轻摇， 用无菌金属接种环或一支无菌小棉球木棒插入假定试验阳性的发
16、酵管中， 其插人培养液 ( 3 . 1 ) 深度为 2 . 5 c m， 立即抽出， 再插入确信试验用发酵管中的培养液( 3 . 2 ) 底 部， 再取出接种器， 塞好棉塞( 整个操作应在无菌条件下进行) 。 6 . 3 . 2 把接过种的确信试验发酵管放在 3 5 士0 . 5 培养 4 8 士3 h 。在这段时间内， 发酵管中有气产 生者， 为确信试验阳性反应 。 c R斧33 28.1 一 88 之袱，卜报匆隘心专袱 1鲜林裂三安 一乞长丫叹 二 二沈尸三蛛眨 二一冈盗资被蚕裂领 提铸欲省r洲几长丫祠 潺性涯嗜牡 遨刊二国华以矛侧 江班叹省长了洲化 侧 翻场华蓄 的画 二囚刊岛蛤碧咐.。
17、曰男担卜担写趁弼游欺岛笙裔塑叹卜禽渊 牛仁降粼捆斗鑫长 。豁城划鑫只 。州忆长丫暇 q) 二代月国甘蛛公 口旧引澡担护璐 聋笃知黑之团四翼杯 断似定叹怎悦坦蓄 鼠津车。长州洲先 双堰二奚袱 共洲餐忿 子尸曰洲儿 门 C B S 3 3 2 8 . 1 一8 8 6 . 4 粪性大肠杆菌试验 采用 3 . 3和3 . 4 培养基。 6 . 4 . 1 采用 3 . 3 培养基( E C培养基) 按 6 . 3 规定操作， 也可与 6 . 3同时操作。 6 . 4 . 2 采用 3 . 4培养基( A - 1 培养基) 操作按 6 . 2条规定。 6 . 车3 培养温度 a .采用 E C培养基的
18、接过种的发酵管放在 4 4 . 5 士0 . 2 水浴锅的水中， 培养 2 4 士2 h ， 所有接过种 的 E C培养液 ( 3 . 3 )发酵管必须在 3 0 m i n内放在恒温水浴中。水浴的水面必须超过发酵管内培养基 ( 3 . 3 ) 的液面。在 2 4 h内产气者为粪性大肠菌阳性反应。反之， 为阴性反应; b .采用 A - 1 培养基， 培养基接种的发酵管必须先在 3 5 士0 . 5 培养 3 h ， 再转移到恒温水浴于4 4 . 5 士0 . 2 培养 2 1 士2 h 。在这期间发酵管产气者， 可确认为粪性大肠菌阳性反应。反之， 阴性反应。 大肠菌群数的结果 计算 7 .
19、1 将假定试验、 确信试验、 粪性大肠杆菌试验所得各阳性反应的发酵管数， 以阳性组合的方式记录 下来， 并折算成最可能数( M P N) ( 见表 2 ) 根据表 2 可查其大肠菌群数。 三种稀释 ( 1 0 m L , 1 . 0 m L , 0 . 1 mL的水样份量) ， 每种稀释用 5 支试管做检验所得的各种阳性组合 所应具有的( M P N ) 指数及其 9 5 置信界限。 表2 中 所采用的水样量是。 . 1 , 1 . 0 , 1 0 . 0 m l , ， 如果不是这三种取样量， 按下述方法换算: a . 取水样量为: 1 0 0 , 1 0 ， 工 m L时， 表 2指数值应
20、乘以。 . l 。 即为其MP N , 取水样量为 1 . 0 , 0 . 1 , 0 . 0 1 m l , 表 2 指数值应乘以1 0 ， 即为其MP N 。以此类推之。 b .利用才( 1 ) 杯马斯( T h o ma s ) 氏的简单分式计算 : MP N/ l 0 0 mL= 阳性试管数X 1 0 0 甲( 阴性试管中的 水样数, m L ) X( 全部试管中水样数， m L ) ( 1 ) c . 按式( 2 ) 求算术平均值 二#X; 人 = . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 乙夕 介 式中 X为算术平均值， M P N / l 0 0 mL X . 为 1 , 2 , 一 二 个 MP N ( 最大可能数) 大肠菌群数目八O O m L , 按式( 3 ) 或式( 4 ) 计算几何平均值 X ,刁( XJM) . . . . . . X.， 。 ， ， -( 3 ) : lo g : 一 # 架 黔互 甲 - - ，. ，. ， ， ， 一 ( 、 ) 式中: X , - 一一 几何平均数。 检验船舶污水处理水水质的大肠菌群数据计值以几何平均数报告结果。 C BS 3 3 2 8 .
22、1 一8 8 表 2 阳性 组 合 MP N 指数 八 O O . L 9 5 置信界限 一组 合 一 : ra vO.L 】 下限上限 一 下限仁“限 0 -0 -0 0 - 0 - 1 0 - 1 一0 0 -2 -0 1 -0 -0 1 - 0 -1 I - 1 - 0 1 - 1 - 1 1 一 2 - 0 2 - 0 - 0 2- 0 - 1 2 - 1 一0 2 - 1 一1 2 -2 - 0 2 -3 -0 3 - 0 - 0 3 - 0 - 1 3 - 1 一0 3 - 1 一1 3 -2 - 0 3 - 2 - 1 4 - 0 - 0 4 - 0 - 1 4 - 1 一 0
23、4 - 1 - 1 4 - 1 - 2 O 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 1 2 8 1 1 1 1 1 4 1 9 1 7 1 3 1 7 1 7 21 2 6 0 5 D . 5 D 5 0 . 5 0 5 0 . 5 0 5 0 . 5 0 5 1 I 2 2 3 1 2 2 4 4 5 3 5 5 7 9 7 7 11 7 1 1 I I 1 5 1 5 1 3 1 7 1 7 21 2 1 2 8 1 9 2 5 2 5 3 4 3 4 4 6 3 1 4 6 4 6 6 3 7 8 一 一 一 2 2 2 6 2 7 3 3 3 4 2 3 31 4 3 3 3 4 6 6 3 4 9 7 0 9 4 7 9 1 1 0 1 ; 。一 、;一一 一 8精密度 5支发酵管同一个稀释度为 工 m L水样时， 一次全部阴性可能性小于 I %. 附加说 明: 本标准由船用辅锅护及防污染装置专业组提出。 由中国船舶工业总公司七院七0四研究所归口。 本标准由七0四研究所负责起草。