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1、因的表达是否普遍存在于其他各种卵巢癌耐药细胞 中， 这些信息将使我们进一步洞悉耐药的机制并有助 于今后设计出针对个体耐药卵巢癌患者的精确治疗策 略以克服耐药 参考文献 川V A S E P A . R es i s ta n c e to c h a m a h e m p y in a d v u n e n 二二: m mh a n i a n d - o t s 6te . e a J . B r J c a n c e r , 2 0 0 3 , 8 9 ( S u p p l 3 ) : 57 3 . 2 丁 Y A M A M O T O K , O K A M O T O A ,
2、 I S O N I S H I S , a a . H e a t s h u c k l o o- te in 2 7 叩- re g u la t ed in 6 刘. t in re s is ta n t h w n a n ma n a n h o n o r G u a n g d o n g M e d ic a l J o t n n a l F e b . 2 0 0 6 , V o l . 2 7 , N o . 2 c e ll h en : a n d as s o c i a te d w ith th e ) sp L ,ti n re s i m J l . C
3、 a n c er L e tt , 2 0 0 1 , 1 6 8 ( 2 ) : 17 3 3 ) L U N D P , 义印用 M D , M K E T E C H A D F , e t a l . A u t o - i n h ib i - tin t d c h e m o th e ra p y re e p - in h u m a n liv e r tu m or c e ll o 场 in s u li n - li k e g r o w th t a c t.一 101 . C a n - I .e tt , 2 0 0 1 , 2 0 6 0) : 8 5 .
4、 4 l G O U A Z E V , A N D R IEU -A B A D I E N , C U V B J I M O , e t a t . G o - ta tl d - p - d a se 一 I p ao t ,a li n en C D 9 5 一itd u c a d a p op t. 6 s J 1 . J B id C h em, 2 0 0 2 , 2 7 7 ( 4 5 ) : 4 2 8 6 7 . 5 l Z H O N G X , S A F A A R . R N A h e lm A in t h e M E F I b u n s . ip t
5、io n 阮- fo r c m g il e o u p 一 re g a l. . th e M D R I g e n e i n m d ti R P M I 1 6 4 0细胞培养基、 胎牛血清、 胰蛋白酶购自 H y c l o n e 公司; 小鼠抗 M D R 1 , M R P , L R P 抗体、 荧光标记 的抗 小鼠 抗体购自 北京中山公司; 阿霉素( a d r ie m y c i n , A D M ) , 5 一氟尿啼吮佃u o r o u r a c i , 5 一F U ) 及顺铂( c i e - 禅 a t i n , D D P ) 均为本院药房国产药
6、品。 1 . 2方 法 1 . 2 . 1 刺激浓度的确定HE P G 2细胞株按常规方法 培养， 呈对数级增殖时， 1 0 5 浓度移人9 6 孔板继续培养 4 h , M T T 法求出3 种药物对细胞株I c a , 的浓度: A D M为 0 . 1 1 娜m l ; 5 一 F U 为1 . 6 t 官m 1 ; D D P 为。 . 8 6 p g / r a l o 1 . 2 . 2 实验分组I EP G 2 细胞株按常规方法培养， 当细胞增殖到5 0 瓶时， 以 A D M, 5 一F U , D D P单药及联 合用药分组， 同时设对照组， 每组1 0 瓶细胞。各实验 组的
7、 药物 刺激浓 度按照 上文I c “ 的浓度用R P M I 1 6 4 0 细胞培养液配置( 联合用药组为以上 3 种药物的半 量) 。每组细胞加药后 3 d换培养基时按各药物的半 衰期计算余药量加人相应的化疗药物。 化疗周期的确定: 每个化疗组 1 0 瓶细胞， 当细胞 从化疗中逐步恢复， 又增殖为1 0 瓶时即可实施下一次 化疗不同药物。 1 . 2 . 3 流式细胞仪测量每次化疗周期留下一瓶细 胞继续培养、 传代， 其余细胞消化, P B S 液洗2 遍， 加人 0 . 5 %多聚甲醛4 固定3 0 m in 。固定的细胞分两管: 一管加0 . 1 % T ri t o n 细胞打孔
8、， 平均分成相应的离心管， 然后加A M， 和L R P 抗体一抗; 另一管直接加M D R 1 抗 体的一抗。加人荧光标记的二抗， 孵育后洗去多余的 二抗， 细胞重悬后上机检测。每管测 3 ) ) 个细胞， 记 录阳性细胞的百分数和平均荧光强度。 广东医学2 0 0 6 年2 月 第2 7 卷第2 期 1 . 3 统计学方法流式细胞仪检测每个结果重复2 次， 取平均数。抗体总量为阳性细胞的百分数和平均 荧光强度二者乘积表示。3 种药物各个多药耐药相关 蛋白间采用 S P S S 1 0 .0统计软件进行双变量相关性分 析， 发现有相关性的组间将进一步行偏相关分析。 2 结果 2. 1 3种化
9、疗药物连续利激 F I E P G 2为 6个周期 MD R I 表达的变化情况各化疗药物组以及联合化疗药物组 连续刺激细胞株 6 个周期， 表达的M D R 1 抗体总量变 化无明显规律。将各组不同周期表达的M D R I 抗体总 量进行相关性分析， 相关系数位于一 。5 5 一 。 . 7 8间( P 均) 0 . 0 5 ) ， 未发 现组间 相 关有统 计学意 义。 2 . 2 3种化疗药物连续利激 HE P G 2为 6个周期 MR P 表达的变化情况各化疗药物组以及联合化疗药物组 连续刺激细胞株6 个周期， 表达的M R P抗体总量变化 无明显规律。将各组不同周期表达的 M R F
10、 . 抗体总量 进行相关性分析， 相关系数位于一 0 . 2 1 一 0 . 7 9 之间( P 均 0 . 0 5 ) ， 未 发现组间 相关 有统 计学意 义。 2 .3 3 种化疗药物连续刺激 H E P GG 2为6个周期 L R P 表达的变化情况 各化疗药物组以及联合化疗药物组 连续刺激细胞株6 个周期， 表达的L R P抗体总量变化 无明显规律。将各组不同周期表达的I I I P 抗体总量进 行相关性分析， 除5 一F U与联合组外， 相关系数位于- 0 .3 9 - 0 . 4 0 之间( P均 0 . 0 5 ) ， 未发现组间相关有统 计学意义。 5 一 F U与联合组之间
11、相关系数为0 .9 7 ( P 0 .0 5 ) ， 偏相关系数为0 .9 8 ( P 0 . 0 5 ) . 3 讨论 临床确诊的恶性肿瘤患者中， 2 / 3 为中晚期， 需接 受以 化 疗为主的 综 合治疗2 1 。 多药耐 药是导 致化 疗失 败 的主 要原因之一 11 。 多药耐药多数为原发性耐 药， 亦有一部分为化疗药物诱导的获得性多药耐药。参与 多 药耐 药形成的蛋白主 要包括M D R I , M R P , L R P , r e f - 1 , N F 一K a p p a B , M D M 2 , C S T , T , , M T , P 2 7 等。我们实验 采用的M
12、 D R 1 , M R I ， 及 L R P是目 前研究比较清楚与肝 癌关系密切的耐药蛋白二 M D R I 的编码产物P -糖蛋白 是一种A T P 依赖的跨膜蛋白外排泵， 可以将蕙环类及 鬼臼 碱 类底物从细胞内 泵出， 导 致多 药耐药 3 1 o M R P 也是M D R家族的一员， 其表达与耐V P 一1 6 , D D P及 V C R有关 4 一 5 。L R I ， 主要通过核与胞质间药物运转障 碍， 使 烷化 剂与铂 类等 底物浓 度下降 而产 生耐药 6 流式细胞仪测得的荧光量代表细胞所表达的相应 抗原量。阳性细胞百分数与平均荧光强度的乘积为被 测量蛋白总量。在本实验
13、中， 代表各化疗周期 H E P G 2 细胞株耐药相关蛋白总量。 人肝癌细胞株 H E P G 2为贴壁细胞， 死细胞培养 中 悬浮在培养液中， 检测前将培养液倒出， 进行检测的细 胞均为化疗后存 活细胞。化疗后残存细胞耐药相关蛋 白的动态变化规律即可反映出连续化疗药物刺激对细 胞多药耐药形成的影响。 我们选用3 种肝癌常用化疗药物连续刺激 H E P G 2 细胞株， 了解不同化疗药物连续作用下细胞株 H E P G 2 耐药相关蛋白动态变化规律， 结果发现: 3 种化疗药 物连续刺激下， H E P G 2 细胞株耐药相关蛋白表达在不 同实验周期同样呈现不稳定性; 不同化疗药物连续 刺激
14、下， H E P G 2 细胞株耐药相关蛋白表达总量之间无 相关性( 5 一F U与联合组 L R P 表达之间呈现一定相关 性为极其个别现象， 与我们实验刺激周期较少有关) 。 实验表明: 不同药物刺激同一细胞株， 细胞所诱导的耐 药相关蛋白的表达完全不同， 并且呈现相当大的无序 性， 提示化疗药物诱导肿瘤细胞耐药机制非常复杂， 存 在非常大的不稳定性与不确定性。 目前临床化疗方案选择主要是根据某 一类型肿瘤 的临床药物试验的人群统计学结果为依据， 并未考虑 到化疗诱导耐药的不稳定性。我们的实验恰好说明， 诱导耐药是化疗药物难以预测的特性。在实体瘤化疗 中， 由于化疗经常难以达到足够的药物浓
15、度， 诱导耐药 显得尤其重要， 这可能也是实体瘤化疗治愈率非常低 的原因之一。建立个体化化疗评价体系， 在临床中开 展实体瘤个体化精确化疗， 对提高实体瘤化疗治愈率 是非常重要的。 参考文献 1 H O WM A N N U , K R O E M E R H K . 侃 A B C h a n e p u te re M D R I 耐 M R P 2 : ,d h p le 6-a- is d ie p mfi m d x m山涌.耐 d m g - t a a c e 3 . D m g M d a b R e v , 2 0 0 4 , 3 6 ( 3 - 4 ) : 6 6 9 一
16、7 0 1 . 2 K I M K B , I g1 A N R , 、 ， 犯P , d a l. I d e n t if- im d a n o va l e y n t h e ti c tri te ,p emid , m e th y l 一 2 一- y - 。 一 3 , 1 2 - d io md e a n e 一 1 , 9 一 a - 2 8 一 o a t e , ht p o ten tl y m d u e e a ee s p e ce一m d ia le d a p o p tm, is h u n w n lu n g e a 6 J . M o l C a
17、 n c e r T h e r , 2 0 0 2 . 1 ( 3 ) : 1 T 7 一 1 8 4 3 R I T n E R O D T M, H A R A D A K . R e p e tit iv e d m a u h ie in d 沙曲 , _ 口 血 e a h a n c s阮 P G P e 耳 la l 一e s p e c 泣ro l e 阮e n d a 恤. l is l e eU . J . Ep T u x ie d P a h . 1 , 2 0 0 3 , 5 5 ( I ) : ，一 4 4 . 4 T T A M D G H I H , % I
18、G A W A J , S U L T A N A H , e a l . S ensi ti v ity to a n ti - - n e e n a and . - a g ar - r - J - d - i n te a r c JI c a r d - gi n d t h e 一1 7 1 . 6 S U N N A R A M B L , G A N D E M E R V , S E B R L O T M , e t a l . L R P p rz s s i m in n ro n s c y d c li n e a g e J . I& u k R e s , 2 0 0 3 , 2 7 ( 的: 7 5 5 一 7 5 9 . ( 收稿 日 期 : 2 0 0 5 一 08 一 0 5 编 辑: 张素文 )