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1、论著文章编号： 1007 -8738 （2006） 04 -0480 -04 Hsp701A 的 RNA 干涉诱导 K562 细胞凋亡 朱 青1，张王刚2*， 王立锋3， 王 芳3， 张 勇3， 杨安钢3*（西安交通大学医学院： 1第一附属医院肿瘤中心， 陕西 西 安 710061； 2第二附属医院血液内科，陕西 西安 710004；3第四军医大学免疫学教研室，陕西 西安 710032 = ） 收稿日期： 2006 -04 -12； 接受日期： 2006 -04 -29 基金项目：国家自然科学基金资助项目 （30200369） 作者简介：朱 青 （1972 - ） ，女，四川乐山人，主治医师，
2、博士 Tel： 029-85324036；E-mail：araa sohu. com *Corresponding authors Knockdown of Hsp701A induces K562 cells apoptosis by RNA interference ZHU Qing1，ZHANG Wang-gang2*，WANG Li-feng3， WANG Fang3，ZHANG Yong3，YANG An-gang3* 1Department of Medical Oncology，the First Affiliated Hospital of Xi an Jiaotong Uni
3、versity，Xi an 710061； 2Department of Hematolo- gy，the Second Affiliated Hospital of Xi an Jiaotong University， Xi an 710004； 3Department of Immunology，Fourth Military Medi- cal University，Xi an 710032，China Abstract AIM：To investigate the apoptosis of K562 ceIIsinducedbyRNAinterference（ RNAi ） targe
4、ting Hsp701A. METHODS：SmaII interference RNA（ siRNA） targeting Hsp701A was generated and its eukaryotic expres- sion vectors was constructed and transected into K562 ceIIs. ProIiferation，apoptosis and ceII cycIe of the transected ceIIs was respectiveIy detected by MTT coIorimetry and FCM. RESULTS：Th
5、e eukaryotic expression vector of siRNA a- gainst Hsp701A was successfuIIy constructed and transfect- ed into K562 ceIIs，which markedIy decreased the expres- sion of Hsp701A on both mRNA and protein IeveI. K562 ceIIs transfected with the vector exhibited sIower proIiferation，in- creased apoptosis an
6、d increased G0/ G1arrest. CONCLU- SION：The inhibition of Hsp701A gene by RNAi may provide a foundation for the deveIopment of noveI therapeutic strate- gy for chronic granuIocyte Ieukemia（CML） . KeywordsRNA interference； heat shock protein 70；chronic granuIocyte Ieukemia（CML） ；apoptosis 摘 要 目的： 研究 R
7、NA 干涉 （RNAi）Hsp701A 基因的表达 及其诱导慢性粒细胞白血病 （慢粒） 细胞株 K562 的凋亡。 方法：构建 Hsp701A 基因小干涉 RNA （siRNA） 的真核表达载 体，转染 K562 细胞并证实 RNAi 的有效性。用 MTT 比色法、 AnnexinV-FITC/ PI 染色和流式细胞术，分别检测 K562 细胞的 增殖、凋亡和细胞周期。结果：构建了 Hsp701A siRNA 的真 核表达载体。将其稳定转染 K562 细胞后，RNAi 组细胞中 Hsp701ARNA 和蛋白的表达水平明显下降。Hsp701A siRNA 能抑制 K562 细胞增殖并诱导其细胞凋
8、亡，将其阻滞于 G1 期。结论：RNAi Hsp701A 基因诱导的表达有望成为一种新的 慢粒的治疗策略。 关键词 RNA 干涉；热休克蛋白 70；慢性粒细胞白血病； 细胞凋亡 中图分类号 Q342 + . 3 文献标识码 A 慢性粒细胞白血病 （CML） 具有特征性癌基因， 是分子靶向治疗的理想疾病 1。但由于 CML 通常会 发生继发性遗传学改变，即便是革命性酪氨酸激酶 抑制剂 ST1571，对急变期 CML 细胞的抑制作用也明 显减弱，因此发现新的基因治疗靶点仍是慢粒治疗 的重要原则。Hsp701A 属于诱导性表达 Hsp70，在正 常细胞中不表达，而在肿瘤细胞中则呈高表达，是肿 瘤细胞
9、生长所必需 2。Hsp701A 不仅影响癌基因的 成熟，而且参与细胞周期调控，抑制细胞凋亡 3。既 往报道，Hsp70 反义寡核苷酸不仅诱导癌细胞凋亡， 而且能使移植瘤得到根治 4。RNA 干涉 （RNA inter- ference，RNAi） 是指双链 RNA 介导的序列特异性转 录后基因沉默，可特异性地降低或关闭基因的表 达 5。应用 RNAi 技术阻断诱导性 Hsp701A 的表达， 是否有助于诱导肿瘤细胞的凋亡？本实验中我们拟 以慢性粒细胞白血病 K562 细胞株作为研究对象，研 究 RNAi 对 Hsp701A 基因的表达及诱导 K562 凋亡的 作用，希望 RNAi Hsp701
10、A 基因诱导的表达能成为一 种新的慢粒的治疗策略。 1 材料和方法 1. 1 材料 大肠杆菌 DH5 和 siRNA 表达质粒 pSuper. puro 均为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室提供。K562 细胞 （含有慢粒特征性的染色体易位 t （9； 22） ） 由第四军医大 学免疫学教研室庄然博士惠赠。限制性内切酶及 T4 DNA 连 接酶等购自 TaKaRa 公司。RPMI1640 培养液、新生牛血清、 脂质体 LipofectAmineTM2000、Trizol 试剂及 RT-PCR 试剂盒均 购自 Invitrogen 公司。小鼠抗人 Hsp701A mAb （554243）
11、购自 Pharmingen Bid 公司。 084ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2006， 22 （4） 1. 2 方法 1. 2. 1 pSuper. puro 载体的构建及鉴定 根据 Hsp701A 基因 （ GenBank-005345）序列，选取 2 个 RNAi 靶位点。设计并合 成以 下 寡 核 苷 酸 序 列：HSP701A-1（ 正 义 链） ：5-GATC- CCCCACAAGAAGGACATCAGCCTTCAAGAGAGGCTGATGT- CCTTCTTGTGTTTTTCGAAA-3； （ 反 义 链
12、） ：3-CGGGTGT- TCTTCCTGTAGTCGGAAGTTCTCTCCGACTACAGGAAGAA- CACAAAAACCTTTTCGA-5。HSP701A-2 （正义链） ：5-GATC- CCCGGCCAACAAGATCACCATCTTCAAGAGAGATGGTGAT- CTTGTTGGCCTTTTTCGAAA-3； （反义链） ：3-CGGCCGGT- TGTTCTAGTGGTAGAAGTTCTCTCTACCACTAGAACAACCG- GAAAAACCTTTTCGA-5。粗斜体部分为与目的基因干涉靶点 一致或互补的序列。上述寡核苷酸两两退火，用 Bgl II 和 Sal I
13、酶切 pSuper. puro 载体。将酶切产物与退火的寡核酸进行连 接，转化大肠杆菌 DH5。挑取阳性菌落，提取质粒进行酶切 鉴定并测序。 1. 2. 2 表达 siRNA 细胞株的筛选 在6 孔板内按1 106个/ 孔接种 K562 细胞，培养于含 100 mL/ L 新生牛血清的 RP- MI1640 培养液中，在 37、 50 mL/ L CO2饱和湿度的条件下 培养。操作按 Lipofectamine2000 说明书进行。筛选从 48 h 开 始，约 20 30 d 时可出现多个嘌呤霉素抗性的 K562 细胞株， 扩大培养后即获得稳定表达 siRNA 的细胞株。 1. 2. 3 Hs
14、p701A mRNA 表达的 RT-PCR 检测 分别离心收集 筛选的 K562 细胞及未转染的 K562 细胞，采用 TrizolRNA 分 离试剂提取细胞的总 RNA，用紫外分光光度计测定总 RNA 的浓度。取 5 g 总 RNA，加入 0. 5 g oligo（dT） ，按照 Su- per-ScriptII RT 逆转录试剂盒的说明书操作合成 cDNA 第 1 链。PCR 引物如下：上游引物的序列为：5-ATG ACC AAG CAG ACG CAG ATC TTC-3，下游引物的序列为： 5-TTA TCG GCC AAG GTG TTG GCG TCC-3。PCR 条件：94变性
15、30 s， 58退火 30 s， 72延伸 40 s，共进行 25 个循环。电泳，照 相，约 500 bp 左右。 1. 2. 4 Hsp701A 蛋白表达的 Western blot 分析 将一抗鼠抗 人 Hsp70 mAb，用 PBS-T 按 1: 1 000 稀释，以 HRP 标记的羊 抗鼠 IgG 为二抗，用 PBS-T 按1: 5 000 稀释，进行 Western blot 分析，具体操作步骤见试剂盒的说明书。 1. 2. 5 K562 细胞增殖的 MTT 比色法检测 收集对数生长期 K562 细胞，将细胞重新接种至 96 孔板中，使其每孔细胞数 为 103104个，共接种于 6
16、个 96 孔板，加入 100 mL/ L 新生 牛血清的 RPMI1640 培养液培养，分别于24、 48、 72 h 进行检 测。每孔加入新配制的 MTT 溶液 （0. 5 g/ L）20 L，于 37 继续培养 4 h 弃上清，每孔加入 150 L-DMSO 溶解样品，用 酶联免疫检测仪于 490 nm 测定各孔的吸光度 （A） 值并绘制生 长曲线。 1. 2. 6 K562 细胞凋亡的 Annexin V 染色法检测 收集 1 106个细胞，PBS 洗2 遍，以800 1 000 r/ min 离心5 min。弃 上清， 加入预冷的结合缓冲液重悬细胞， 加入5 L PI 和5 L Ann
17、exin V 于细胞悬液中，轻轻混匀后 4 避光染色 10 min， FCM 进行分析。 1. 2. 7 K562 细胞周期的 FCM 分析 收集 1 106生长状态 良好的 K562 细胞，用 PBS 洗 2 遍，以 800 1 000 r/ min 离心 5 min。弃上清，加入 1 mL 生理盐水制成单细胞悬液。加入 预冷的无水乙醇 2 mL 快速混匀固定细胞。弃固定液，用 PBS 洗 2 遍，以 1 000 r/ min 离心5 min，加入1 mL DNA 荧光染料 PI，于 4避光染色 15 min，用 FCM 进行分析。 2 结果 2. 1 siRNA 表达载体的酶切鉴定及测序
18、将合成的单链寡 核苷酸经退火后形成双链 DNA，定向插入 pSuper. puro 干涉 载体中，以其转化感受态细胞，挑取阳性菌落，并扩增并提 取质粒，经 EcoR I 和 Sal I 双酶切后，重组质粒的双酶切片段 约 300 bp 左右，高于空载体 pSuper. puro 的酶切片段 240 bp， 表明合成的寡核苷酸已插入重组质粒中 （图 1） 。重组质粒分 别命名为 pSuper. puro-Hsp701A siRNA1、pSuper. puro-Hsp701A siRNA2。将双酶切鉴定的阳性克隆，经 DNA 测序证实，该重 组的 DNA 序列与所设计的序列完全一致，表明针对 Hs
19、p701A 基因的 siRNA 表达载体已成功构建。 图 1 siRNA 表达载体的酶切鉴定 Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of siRNA expression vector M：DL 2 000 DNA marker；1：pSuper. puro；2：pSuper. puro-Hsp701A siRNA1； 3：pSuper. puro-Hsp701A. siRNA2. 2. 2 siRNA 对 K562 细胞中 Hsp70 mRNA 表达的影响 用 跨 RNA 干涉位点的引物对 Hsp701A mRNA 进行 RT-PCR 扩增
20、的结果显示，RNAi 组细胞的 RT-PCR 产物在500 bp 处的条带 明显弱于对照组的条带。表明 siRNA 可降低 K562 细胞中 Hsp701A mRNA 的表达 （图 2） 。 2. 3 Hsp701A 蛋白表达的 Western blot 检测 对 K562 细胞 的裂解液进行 Western blot 检测的结果显示，稳定表达 siRNA 的 K562 细胞中，Hsp701A 基因的表达明显下调，表明 siRNA 确实能特异性的抑制 K562 细胞内 Hsp701A 基因的表达 （图3） 。 2. 4 转染后细胞体外增殖活性降低 不同 K562 细胞的生长 曲线结果显示：未转
21、染的 K562 细胞组与空载体转染组细胞 的生长速度基本一致；而 Bcr-Abl siRNA 转染后细胞组与两种 Hsp701A siRNA 转染后细胞组生长速度明显变慢，表明 Hsp701A siRNA 确实能够高效特异地抑制 K562 细胞的体外 增殖能力 （图 4） 。 184ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2006， 22 （4） 图 2 K562 细胞中 Hsp701A mRNA 表达的 RT-PCR 检测 Fig 2 Detection of Hsp701A expression on mRNA level i
22、n K562 cells by RT-PCR 1：K562 control cells；2：pSuper. puro；3：pSuper. puro-Hsp701A siR- NA1； 4：pSuper. puro-Hsp701A. siRNA2. 图 3 Hsp701A 蛋白表达的 Western blot 检测 Fig 3 Expression of Hsp701A protein by Western blot analysis 1：K562 control cells；2：pSuper. puro；3：pSuper. puro-Hsp701A siR- NA1； 4：pSuper. pu
23、ro-Hsp701A. siRNA2. 图 4 MTT 检测不同组 K562 细胞的生长 Fig 4 Proliferation of K562 cells measured by MTT 2. 5 K562 细胞凋亡的检测 未转化的 K562 细胞、空载体 pSuper. puro 及 2 种 siRNA 转染后 K562 细胞进行检测细胞凋 亡率分别为 16. 8%、 16. 6%、 21. 5%、 35. 4%。siRNA 转染后 细胞凋亡比例明显高于未转染 K562 细胞和空载体转染组。 而 Target2 凋亡比率最高，达到 35. 4% （图 5） 。 图 5 K562 细胞凋亡的
24、检测 Fig 5 Apoptosis of K562 cells analyzed by FCM 2. 6 siRNA 转染后出现细胞周期的 G1期阻滞 FCM 显示以 2 种 Hsp701A siRNA 载体转染 K562 细胞 G0/ G1期比例明显 高于未转染的 K562 细胞和空载体 pSuper. puro 组，表明 RNAi 可导致 Hsp701A 基因沉默，因而使 K562 细胞阻滞于 G1期 （图 6） 。 图 6 不同 K562 细胞周期各时相分布 Fig 6 Cell cycle of K562 cells in different groups 3 讨论 RNAi 技术提
25、供了有力的基因沉默工具，我们使 用 siRNA 表达载体方法，是目前惟一可以用来进行 长期研究的方法 6。而 siRNA 或其相应表达载体的 转染效率是影响 RNAi 效果的一个关键因素。本实 验中采用转染后稳定筛选的 K562 细胞株，通过 RT- PCR、Western blot 对转染前后细胞中 Hsp701A mR- NA 及其蛋白表达的检测，表明 Hsp701A 基因在 mR- NA 转录水平和蛋白翻译水平上均明显地受到抑制。 本实验中 Hsp701A 基因表达被 “敲除” 后，K562 细胞的生长均受到明显抑制。将 Hsp701A 的 siRNA 转染正常细胞后，发现 siRNA
26、对细胞的生长无明显 影响。虽肿瘤细胞与非肿瘤细胞的生长都必须依赖 热休克同源物 （Hsc70，heat shock cognate 70） 7，但 Hsp70 是癌细胞生存所必需的，非肿瘤细胞的生长并 不需要 Hsp70。Hsp701A siRNA 抑制 Hsp701A 基因 表达后，稳定转染 siRNA 的 K562 细胞后，凋亡比率 明显高于未转染组和空载体转染组。其中 Target2 转 染的细胞凋亡率最高。其作用可能是 Hsp701A 基因 可抑制凋亡级联通路中的重要步骤，或作为主要信 号分子的伴侣蛋白或直接抑制凋亡 8。进一步研究 表明其机制是 RNA 干涉诱导性 Hsp701A 基
27、因的表达 后，他们于胞质中负反馈调节半胱天冬酶 （Caspase） 、 凋亡诱导因子 （AIF） 等的活性及与 P53 蛋白交联而 发挥促凋亡作用的。 细胞周期中存在应激诱导的 Hsp70 蛋白合成、 分布以及蛋白之间相互作用的调控， Hsp70不但参与 （下转 484 页） 284ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2006， 22 （4） 研究发现，给 ST 段抬高的急性心肌梗死患者使用胰 岛素， 与未使用胰岛素的患者相比较， 血清 C 反应蛋 白的水平明显降低，同时血清肌酸激酶-MB 峰值降 低，提示胰岛素可抑制炎症反应
28、，从而有利于患者心 脏病变的恢复 5。本研究显示，随着培养液中胰岛 素浓度的增高，可溶性 ICAM-1 的水平逐渐下降，胰 岛素的浓度为 40 U 时，其下降程度达到统计学差 异，且胰岛素对 U937 细胞表达可溶性 ICAM-1 的影 响不依赖于葡萄糖的浓度，表明胰岛素自身能明显 抑制 TNF- 诱导的单核巨噬细胞表达炎症黏附因 子，其机制是胰岛素可显著减少单核细胞中氧自由 基的水平，明显地抑制 NFkB 的活性，从而降低可溶 性 ICAM-1 的水平 6。因此，适量的胰岛素应用不仅 有利于控制血糖，同时还可通过其抗炎作用而有利 于动脉硬化的防治。 参考文献： 1Dandona P，Alja
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32、ranuclear nuclear factor kappaB and stimulates IkappaB in mononuclear cells in obese subjects：evidence for an anti-inflammatory effect？ J . J Clin Endocrinol Metab， 2001， 86 （7） ： # 3257 -3265. （上接 482 页） 细胞周期调控的各个阶段，而且还与调节细胞周期 的其他主要分子和蛋白之间发生作用 9。当 RNA 干 涉 Hsp701A 基因表达后，上述调控作用被消除，G1 期细胞的比率便相应增多，与本实验
33、中细胞周期测 定结果相一致。因此，本实验中 K562 细胞的增殖抑 制，不仅是由于凋亡细胞的增多，而且是由于 RNAi Hsp701A 基因表达后，驱动细胞快速分裂的作用丧 失。因此，Hsp701A 可能成为治疗慢性粒细胞白血 病的一个重要的靶点 10。 参考文献： 1Goldman JM. Chronic myeloid leukemia-still a few questions J . Exp Hematol， 2004， 32 （1） ： 2 -10. 2Daugaard M， Jaattela M， Rohde M. Hsp70-2 is required for tumor cel
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