HIV1中和抗体检测方法的建立.pdf

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1、8 1 0 中国生物制品学杂志2 0 0 8 年9 月第2 l 卷第9 期C h i nJB i o l o g i c a l sS e p t e m b e r2 0 0 8 ，V 0 1 2 lN o 9 中国图书分类号R 3 7 3 9R 3 9 2 - 3 3 文献标识码A文章编号1 0 0 4 - 5 5 0 3 ( 2 0 0 8 ) 0 9 - 0 8 1 0 - 0 3 【实验技术】 H I V 1 中和抗体检测方法的建立 赵东海- ：张喜珍协马红霞1 孔维1 于湘晖1 【摘要】目的以荧光素酶作为报告基因，表达假病毒，建立快速、有效的H I V 1 中和抗体检测方法。方法将

2、H I V - 1 中 国流行株B c 重组亚型和C 亚型E n v e l o p e 基因的真核表达质粒分别与带有荧光素酶报告基因的p N I A - 3 L u e R E 质粒共转 染2 9 3 T 细胞，培养4 8h 后收获含有假病毒的上清液感染表达C D 4 受体和一个辅助受体C C R 5 的H O S 细胞，培养7 2h 后，裂解 细胞，检测荧光素酶含量。结果H I V 1 的B C 重组亚型和C 亚型E n v e l o p e 基因真核表达质粒分别与p N I A - 3 L u c R E 质粒共 转染的2 9 3 T 细胞，均有H I V 1 结构蛋白G a g p

3、o l 和E n v 的表达，相对分子质量分别为5 50 0 0 和1 6 00 0 0 ，用产生的假病毒感染 H 0 “D 4 C R 5 C X C R 4 细胞后，产生的荧光素酶含量观显高于对照组。结论已建立了瞬时转染检测H I V 1 中和抗体的方法， 为今后抗体样本及病毒样本的检测提供了参考。 【关键词】人免疫缺陷病毒l 型；中和抗体；荧光素酶；假病毒 D e v e l o p m e n to fAM e t h o df o rD e t e r m i n a t i o no fH - 1N e u t r a l i z i n gA n t i b o d y Z H

4、A OD o n g - h a i ，Z H A N GX i z h e n ，M AH o n g x i a ，e ta l ( V a c c i n eR e s e a r c hC e n t e r , C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e ，皿i n U n i v e r s 如 ，C h a n g c h u n1 3 0 0 2 1 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T oe x p r e s sp s e u d o v i m su s i n gl u c

5、i f e r s s ea t ；r e p o r tg e n ea n dd e v e l o par a p i da n de f f e c t i v em e t h o df o r d e t e r m i n a t i o no fH I V ln e u t r a l i z i n ga n t i b o d y M e t h o d sT r a n s f e e t2 9 3 Tc e l l sb yp N L 4 - 3 L u c R Et o g e t h e rw i t l le u k a r y o t i ee x p r e

6、s s i o n p l a s m i d sp o D N A 3 1E n v B Ca n dV R l 0 1 2 E n v Cr e s p e c t i v e l ya n dc u l t u r ef o r4 8h T h es u p e r n a t a n tc o n t a i n i n gp s e u d o v i m sW a Sh a r - v e s t e dt Oi n f e c tH O Sc e l l se x p r e s s i n gr e c e p t o rC I Ma n da c c e s s o r yr

7、 e c e p t o rC C R 5 T h ei n f e c t e dc e l l sw e r ec u l t u r e df o r7 2h ，t h e n l y s e da n dd e t e r m i n e df o rl u e i f e r a s ec o n t e n t R e s u l t s H I V - ls t r u c t u r a lp r o t e i n sG a g p o la n dE n v 。w i t hr e l a t i v em o l e c u l a rm a s so f 5 50 0

8、0a n d1 6 00 0 0r e s p e c t i v e l y w e r ee x p r e s s e di n2 9 3 Tc e l l sC O - t r a n s f e c t e dw i t hp c D N A 3 1E n v B Ca n dp N L 4 - 3 L u e R - Ea s w e ba st h o s ew i t hV R l 0 1 2 E n 、疋a n dp N I A 一3 1 _ a e R - E T h el u e i f e r s s ec o n t e n ti nH O S - C I M - -

9、 C C R 5 C X C R 4c e l l si n f e c t e dw i t ht h e h a r v e s t e dp s e u d o v i r u sW a gs i g n i f i e a n d yh i g h e rt h a nt h a ti nc o n t r 0 1 C o n c l u s i o nAm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fH I V - ln e u t r a l i z i n g a n t i b o d yb yt r a n s i e n tt r a

10、 n s f e e d o nw a sd e v e l o p e d ，w h i c hp r o v i d e da b a s i sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa n f i b o d ya n dv i r u ss p e c i m e n s 【K e yw o r d s 】H u m a ni n u n u n o d e f i e i e n e yv i r e st y p e1 ；N e u t r a l i z i n ga n t i b o d y ；L u c i f e r a s e ；P

11、 s e u d o v i m s 理想的艾滋病疫苗应当能够诱发机体产生良好 的体液免疫和有效的细胞免疫。病毒的中和抗体可 以在病毒吸附、结合、融合、进入靶细胞的每一个环 节发生作用，也可以阻止组装的核衣壳和胞饮病毒 的释放，其中E n v C D 4 辅助受体是各种抗体阻止病 毒感染的基本靶位。在临床上，科学家发现初次病毒 血症的峰在中和抗体可检出前下降，这提示中和抗 体限制了病毒血症的发展1 。另外，一些感染超过 1 0 年而不发病的无进展者，保持了较强的、广泛的 交叉中和反应，更显示了中和抗体在控制疾病进程 中的积极作用。 传统的中和抗体检测技术准确性低，可重复性 基金项目：国家自然科

12、学基金( 3 0 3 7 1 3 1 7 ) 作者单位：1 吉林大学生命科学学院吉林大学疫苗研究中心( 长 春1 3 0 0 2 1 ) ；2 吉林医药学院病理学教研室( 吉林 1 3 2 0 1 3 ) 通讯作者：孔维E m a i l ：W e i k o n g C 蓟n a i l j l u e d u o n ； 于湘晖。E - m a i h x i a n g h u i j l u e d u c n ； 共享第一作者 差，尤其是宿主细胞的差异容易引起结果发生变异【引。 本研究利用荧光素酶作为报告基因，表达假病毒进 行中和性试验，即构建中国流行株B C 重组亚型、 C 亚型H

13、 I V 一1E n v e l o p e 基因的真核表达质粒。与带 有荧光素酶报告基因的质粒p N L 4 3 L u c R E 共转 染2 9 3 T 细胞，经培养收获含有假病毒的培养液上 清。再用假病毒感染表达C D 4 受体和一个辅助受体 的H O S C D 4 C C R 5 C X C R 4 细胞，检测感染细胞的 荧光素酶含量。靶细胞中荧光素酶的含量即反映了 靶细胞的感染量。 1 材料与方法 1 1 质粒及细胞 p c D N A 3 1 E n vB C 重组亚型、V R l 0 1 2E n vC 亚型质粒由吉林大学疫苗研究中心构建 31 ；质粒 p N L 4 3 L

14、 u c R E 由美国J o h nH o p k i n s 大学于晓方 教授惠赠；2 9 3 T 和H O S - C D 4 C C R 5 C X C R 4 细胞由 吉林大学疫苗研究中心保存。 万方数据 中国生物制品学杂志2 0 0 8 年9 Y 第2 1 卷第9 期C h i nJB i o l o g i c a l sS e p t e m b e r2 0 0 8 。V 0 1 2 1N o 9 8 1 1 1 2 试剂 D M E M 培养基、胎牛血清和转染试剂L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 均购自美国G I B C O 公司；H I

15、V 1 阳性血 清分离自广西艾滋病患者；碱性磷酸酶标记的羊抗 人I g G 购自J a c k s o nI m m u n o R e s e a r c hl a b o r a t o r i e s ， I N C ；B C I P N B T 购自福建迈新生物技术公司。 1 3 细胞培养和转染 于转染前一天将2 5X1 0 5 个2 9 3 T 细胞接种于 6 孔板，至第2 天达7 0 一8 0 单层时，将质粒p N L 4 - 3 L u c R E ( 9 g ) 分别与带有H I V 1 E n v e l o p e 基因 的真核表达质粒p e D N A 3 1 E n v

16、B C 亚型( 1 斗g ) 和V R l 0 1 2E n vC 亚型( 1 斗g ) 共转染2 9 3 T 细胞，两 种质粒按9 ：1 摩尔比稀释于2 5 0I x l 无血清无抗性 D M E M 溶液中，温和混匀；用前混匀L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ，取6I x l 溶于无血清无抗性D M E M ，温和混匀， 室温作用5m i n ；将上述两种溶液混匀，室温作用 2 0r a i n ；加入细胞培养液内，混匀，置3 7 5 C O ：培 养箱中培养4 8h 。W e s t e r nb l o t 检测目的基因在2 9 3 T 细胞中的表达，

17、同时检测荧光素酶含量。 1 4 假病毒感染 转染4 8h 后，收集瞬时转染的细胞培养上清， 30 0 0r r a i n 离心1 0m i n ，用O 4 5 m 滤器去除细胞 残渣，获得H I V 1 假病毒。 将靶细胞H O S C D 舡C C R 5 C X C R 4 接种6 孔板， 8 1 0 4 个孔，3 7 5 C 0 2 培养2 4h ，每孔加入 2 0 0 山假病毒，置3 7 5 C O ：细胞培养箱孵育lh ； 再向各孔中加入D E A E ，终浓度1 7V L g m l ，置3 7 细胞培养箱培养5h 后，向各孔中补加无抗性完全 D M E M 培养基，至终体积为I

18、I n l ，培养7 2h 后裂解 细胞，检测荧光素酶含量。 1 5W e s t e r nb I o t 检测 收集感染后的细胞，进行S D S P A G E ，将蛋白电 转移到硝酸纤维素膜上，加入P B S 溶解的3 脱脂 奶粉，室温封闭lh ；用P B s T ( T w e e n 2 0 终浓度为 o 2 ) 洗涤1 次，5m i n 次；加入含H I V - 1 阳性血清 的P B S ( 含l 脱脂奶粉) ，振摇1 5h ；用P B s T 洗膜 3 次，5m i n 次；加入含碱性磷酸酶标记的羊抗人 I g G 的P B S ( 含l 脱脂奶粉) ，振摇3 0 4 5I l

19、 l i n ；用 P B S T 洗膜3 次，5r a i n 次；用P B S 洗涤1 次；取6 6 l N B T 和3 3 斗lB C I P 溶液，与1 0I n l 碱性磷酸酶缓冲 液混匀，浸泡膜显色。 1 6 荧光素酶检测 吸弃待检细胞培养基，用P B S 漂洗细胞2 3 次；加入1 裂解缓冲液覆盖细胞；将细胞从培养皿 刮下，漩涡振荡5 1 0s ，1 20 0 0g 离心1 5s ( 室温) ； 取上清液8 0 仙l ，加入荧光仪器专用检测板中，并加 平衡至室温的荧光反应底物，3 0 斗l 孔，仪器读数检 测荧光素酶含量( 样品须在2 0m i n 内检测，否则影响 酶活力；暂

20、时不测的样品保存于- 8 0 ) 。 1 7 统计学分析 实验数据应用统计学软件S P S S I O 0 进行统计 学分析，样本显著性分析用配对t 检验。 2 结果 2 1 目的蛋白在2 9 3 T 细胞中的表达 W e s t e r nb l o t 结果显示，共转染质粒p e D N A 3 1 E n vB C 与p N L 4 3 L u c R E 和V R l 0 1 2E n vC 与 p N L 4 3 L u c R E 的2 9 3 T 细胞均有H I V 1 结构蛋白 G l g ：p o l 和E n v 的表达，相对分子质量分别为5 50 0 0 和1 6 00

21、0 0 ；而单独转染p N I A 3 L u c R E 及p N I A 3 L u c R E + V R l 0 1 2 质粒的细胞只有结构蛋白 G a 9 1 ) o l 的表达，见图1 。 l ：p r 岫m a r k e r ；2 ：p N L 4 - 3 L u g R E + p c D N A3 1 E n vB C ；3 ：p N L 4 - 3 L u c R - E4 - V R l 0 1 2E n vC ；4 ：b l a n k c o n t r o l ；5 ：p N I A - 3 L u c R - E + V R l 0 1 2 ；6 ：p N I

22、A - 3 L u c R - I l 图1 目的蛋白在2 9 3 T 细胞中表达的W e s t e r n b l o t 检测 1 W e s t e r nb l o t t i n go fe x p r e s s e dp r o d u c ti n2 9 3 T c e l l s 2 2 转染的2 9 3 T 细胞荧光素酶含量 将表达荧光素酶的p N L 4 3 L u c R E 质粒单独 转染或与表达E n v 基因的质粒共转染2 9 3 T 细胞后， 均有很强的荧光素酶的表达。p e D N A 3 1E n vB C 共转染组和V R l 0 1 2E n vC 共

23、转染组与空白对照组 ( 2 9 3 T 细胞) 相比，其荧光素酶表达强度均显著升高 ( t l - 1 5 7 0 ，t 2 = 1 1 8 9 ，P 均小于0 0 1 ) ，见图2 。 2 3 假病毒感染H o S - C D 4 C C I 巧C X C R 4 细胞 后的荧光素酶含量 结果表明，p N L 4 3 L u c R E 和p c D N A 3 1E n v B C 以及p N I A 3 L u e R E 和V R l 0 1 2E n vC 共转 染后的细胞上清均能检测到荧光素酶表达，证明荧 万方数据 8 1 2 中国生物制品学杂志2 0 0 8 年9 月第2 1 卷

24、第9 期C h i nJB i o l o g l c a l sS e p t e m b e r2 0 0 8 ，V 0 1 2 1N o 9 光素酶渗入到假病毒颗粒中，并具有感染能力；而无 论p N L 4 - 3 L u c R - E 和V R l 0 1 2 共转染组，还是p N L 4 - 3 L u c R E 单转染组，都因不能形成完整的假病毒 颗粒而无法进一步感染H O S 细胞，因而无法检测到 荧光素酶表达。与空白H O S 组相比，其荧光素酶强 度基本相同。共转染p N L 4 3 L u c R E 和p c D N A 3 1 E n vB C 以及p N L 4

25、3 L u c R E 和V R l 0 1 2E n vC 组 与空白对照组比较，差异有显著意义( t 。= 2 3 2 ，赴= 3 8 5 ，P 均小于0 0 1 ) ，见图3 。 1 ：p N L 4 - 3 L u c R - E + p c D N A 3 1E n vB C ；2 ：p N L 4 3 L u c R - E + V R l 0 1 2E n vC ；3 ：b l a n kc o n t r o l ( 2 9 3 T t e n s ) ；4 ：p N L 4 - 3 L u c R - E + V R l 0 1 2 ；5 ：p N I A - 3 L u 己

26、RE 图2 转染的2 9 3 T 细胞的荧光素酶含量 F i g2 L n c i f e r a s ec e n t e n ti nt r a n s f e c t e d2 9 3 Tc e l l s 1 ：p N L 4 - 3 L u c R - E4 - p c D N A 3 1E n vB C ：2 ：p N L 4 - & L u c R - E + V R l 0 1 2E n vC ：3 ：P N I 柏L u c R - E + V R l 0 1 2 ； 4 ：p N L 4 - 3 L u c R - E ；5 ：b l a n kc o n t r o l

27、( H O Sc e l l s1 图3 假病毒感染肿S C D 4 - C C R 5 C X C R 4 细胞后荧 光素酶含量 n g3 L u c i f e r a s ec o n t e n ti nH o $ C D 4 C C R 5 C X C R 4 c e l l sa f t e ri n f e c t i o nw i t hp s e u d o v i r u s 3 讨论 最初的m V 1 中和试验是用原型病毒分离株 ( 如H I V I I I B ) 在T 细胞系( 如H 9 和C E M 2 S S ) 中 生长，监测病毒诱导的合胞体数。这种试验能定量，

28、 具有可重复性，但局限于以C X C R 4 为辅助受体、感 染T 细胞系形成合胞体的病毒，且受培养条件、镜检 者的影响而难以准确定量。由于所有的H I V 一1 均能 在人外周血单个核细胞( P e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r c e l l ，P B M C ) 中生长，改用P B M C 作为靶细胞，监测 细胞中表达的病毒蛋白如p 2 4 抗原或逆转录酶，这 种E H S A 抗原捕获中和试验需要几轮病毒复制( 通 常需7d ) ，需大量的细胞冲洗，以除去病毒抗原和血 清抗p 2 4 抗体。同时由于病毒生长条件的变化和细 胞

29、死亡p 2 4 抗原的释放等原因，使p 2 4 抗原E L I S A 中和试验缺乏可重复性【4 。 质粒p N L 4 3 L u c R E 带有H I V 1 的全套基因 组，只有E n v 基因移码突变，其他基因均可有效表 达，而E n v 基因由共转染的另外一个基因表达补偿。 因此，两质粒共转染表达后，可以包装成病毒颗粒。 该病毒颗粒内包装了质粒p N L 4 3 L u c R E 所带有 的全部基因，包括荧光素酶基因，并带有另一个质粒 上E n v 基因所表达的H I V 1 相应亚型的包膜蛋白。 但是该病毒的基因组没有有功能的E n v 基因，仅有 1 次感染性，因此称之为假病

30、毒。如果各亚型质粒共 转染后形成了单轮感染性病毒，那么，用该假病毒感 染靶细胞H O S C D 4 C C R 5 C X C R 4 时，病毒即可进 入靶细胞，且所带的荧光素酶基因亦将在靶细胞中 翻译表达。 质粒p N L 4 3 L u c R E 单独转染时，虽然2 9 3 T 细胞内的荧光素酶表达极强，但由于缺少H I V 感染 所必需的包膜蛋白基因，无法形成具有感染性的病 毒颗粒，即无法进入H O 孓c D 4 C C R S C X C R 4 细胞。 因此上清感染后的H O S C D 4 C C R 5 C X C R 4 细胞中 几乎检测不到荧光素酶活性。两种质粒共转染后，

31、在 感染的靶细胞中有较强的荧光素酶活性，因此C 亚 型和B C 重组亚型均可判断成功包装了具有感染 性的假病毒颗粒。 本研究建立了一种H I V 1 B C 重组亚型和C 亚 型中和抗体评价体系，为今后抗体样本及病毒样本 的检测提供了参考。 参考文献 1 F e r r a n t e l l iF ，R a s m u s s e nR A ，H o f m a r m L e h m a n nI t , e ta 1 D on o t u n d e r e s t i m a t et h ep o w e ro fa n t i b o d i e s 2 1 e s s o n s

32、f r o ma d o p t i v et r l l n s - f e ro fa n t i b o d i e sa g a j n 8 tH I V V a e c i n e , 2 0 0 2 ，2 0 ( S u p # 4 A ) 6 ：1 - 6 2 黑发欣，邵一鸣H I V 中和抗体的免疫机制、诱导和检测国外 医学病毒学分册，2 0 0 4 ，1 1 ( 1 ) ：5 - 9 3 马红霞，于湘晖，姜春来，等中国流行株H I V B C 重组亚型包 膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选中国生 物制品学杂志。2 0 0 6 ，1 9 ( 4 ) ：3 6 5 3

33、 6 7 4 M a s c o l aJ R , L o u d e rM kW i n t e rC ，e ta 1 H u m a ni m m u n o d e f i c i e n c y v i r u st y p e1n e u t r a l i z a t i o nm e a s u r e db yf l o we y t o m e t r i cq u a n t i t a t i o n o fs i n g l e r o u n di n f e c t i o no fp n m a r yh u m a nTc e l L s JV i r o l ，2 0 0 2 。 7 6 ( 1 0 ) ：4 8 1 0 - 4 8 2 1 ( 收稿日期：2 0 0 8 - 0 2 - 2 3 ) 万方数据