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1、2 6 2 鑫盅老篇未泓恳麓；2 0 o ，J u n ；2 9 ( 3 ) ：2 6 2 2 6 72 6 2 J S o u t h e a s t U n i v ( M e dS c iE d i ) 一一一。、7 一一一。 I L 一10 基因内耳局 盎R0 厶 日p ，口疗自身免疫性 感音神经性聋的实验研究 陈文博，谭长强，董伟达，李玉瑾，蔡文君，郭浪，李王伟 ( 南京医科大学第一附属医院暨江苏省人民医院耳鼻咽喉科暨耳鼻咽喉科学研究室，江苏南京2 1 0 0 2 9 ) 摘要 目的：探索局部应用I L 一1 0 基因与慢病毒重组载体对实验性自身免疫性感音神经性聋( A s N H
2、L ) 的治 疗作用。方法：采用纯化同种内耳抗原免疫豚鼠，造成A s N H L 动物模型，再将重组载体分剐经鼓阶、内淋巴 囊和圆窗龛局部注射或渗透，观察听觉功能和内耳病理形态学变化，同时行免疫组织化学试验了解慢病毒转 染和基因产物在内耳的分布。结果：治疗前后A B R 波阈值的均值对比分析结果显示，各实验组局部基因 治疗后均降低：治疗后各实验组组间比较差异无统计学意义。慢病毒主要转染部位是血管纹、C o n i 器、蜗轴 小血管周围及其内淋巴囊等处。基因产物表达部位与转染部位基本相同。结论：重组载体经不同途径均可 转导入内耳，并在内耳表达基因产物，对A s N H L 发挥有效的治疗作用。
3、关键词 自身免疫性感音神经性聋；基因治疗；慢病毒载体 中图分类号 R - 3 3 ；R 7 6 4 4 3 l 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 卜6 2 6 4 ( 2 0 l o ) 0 3 。0 2 6 2 。0 6 d o i ：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 卜6 2 6 4 2 0 1 0 0 3 0 0 6 I L _ 1Og e n ei m p o r t e di n t ot h ei n n e re a rf o rt r e a t i n ga u t o i m m u n e s e n s o r i n e u r a lh e
4、 a r i n gl o s s ：a ne x p e r i m e n t a ls t u d y C H E NW e n 。b o ，T A NC h a n g 。q i a n g ，D O N GW e d a ，UY u - j i n ，C A IW e n j u n ， G U OL a n g ，L IW a n g - w e i ( D e p 口n ，聊m 旷D 幻砘i 加如r ) 仉g D 地眇& R 部砌如6 D r 咖叮旷锄如，) 仇g D D g y ，尉稻t 够f 妣d 胁印豇以细 聊昭胁如耐讹邶妨& 胁咿“胁i 删砌妒妇f ，彬增2 1 0 0
5、2 9 ，现i 舾) A b s t r a c t O b j e c t i V e ：7 r oe v a l u a t et I l e r a p e u t i ce H - e c t so ft r a n s f b r r i n gr e c o m b i n a n tr e p l i c a t i o n 。d e f e c t i V e l e n t i V i r a l v e c t o ro fi n t e r l e u k i nI L 。l Og e n ew i t hG F Pm a r k e di n t oi n n e re
6、 a rf ；叶l o c a l l yt r e a t i n ge x p e r i m e n t a la u t o i m m u n e s e n s o r i n e u r a lh e a r i n gl o s s ( A S N H L )i ng u i n e ap i g M e t h o d s ：G u i n e ap i g sw e r ei m m u n i z e dw i t h5 8k Dp u r i f i e d c o n s p e c i f i ci n n e re a ra n t i g e na n dc a
7、 u s e da n i m a Jm o d e l so fa u t o i m m u n es e n s o r i n e u r a lh e a r i n gl o s s T h ee x p e r i m e n t a l g r o u p sw i t hr e c o m b i n a n tt h e r a p e u t i cg e n ev e c t o r si n j e c t i n gi n t oi n n e re a rt h r o u g ht h r e e 印p r o a c h e s ( t y T n p a n
8、 i c8 c a l e ， e n d o l y m p h a t i cs a ca n dr o u n d 耐n d o wm e m b m e ) f o rt h e r 叩yo fA S N H L B e f o r ea n da f t e rg e n et l l e m p y ( 7d a y s ) ， a u d i t o r yb r a i n s t e mr e s p o n s e ( A B R ) t 1 1 r e s h o l d sw e r ed e t e 瑚i n e d ，a n dt i s s u ep a r a
9、m ns e c t i o n so ft e m p o m lb o n ew 鹅 m a d ea n do b s e r v e d b yl i g h tm i c r o s c o p y a n de l e c t I D n m i c r o s c o p y I m m u n o n u o r e s c e n c ea n d e n z y m e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt e s t sw a sm a d ef o rd e t e c t i n gl e n t i V i r a l 咖
10、n s f e c t i o na n dg e n ep r o d u c te x p r e s s i o n R 酬t s ：尉t e r t r e a t m e n tt h em e a nt h r e s h o l do fA B R w a v ei ne x p e 而m e n t a lA ，B ，Cg m u p sl o w e r e d 山a nt h a tb e f o r et r e a t m e n t ； 收稿日期 2 0 l O O 卜” 修回日期 2 0 l O 一0 2 。0 8 基金项目 国家自然科学基金项目( 批准号：3 0
11、4 7 1 8 7 6 ) 和国家重点基础研究发展计划( 9 7 3 计划) 项目( 批准号：2 0 0 7 C I r 7 0 r 7 8 0 5 ) 作者简介 陈文博( 1 9 8 4 一) ，女，山东泰安人，在读硕士研究生 通讯作者 谭长强E - n l a i l ：c c f 2 0 0 6 y a I l c n 万方数据 陈文博，等I L - 1 0 基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究 2 6 3 粕dc o n t m s t i n gb e 似e e nm e s eg r o u p st h e r ew e r en os i g I l i f i c
12、 a n td i 脆r e n c e k n t r i V i r 觞c 痢n gp u 叩o s eg e n em a i n l y t r 肌s f e r r e dt h ep s a J t e r i a lc o r d ，c o r t i o 唱a n ，c o c h l e a ra 】【i s ，V e s s e l sa n de n d o l y m p h a t i cs a c ，e t c E x p r e s s i n gp a r t so fg e n e p m d u c ta n dt h a n s f b r i n gp
13、a r t sw e r eg e n e r a l l yt h es a m e C o n c l u s i o n ：R e c o m b i n a n tr e p l i c a t i o nd e f e c t i V el e n t i V i r a l v e c t o rc a n 咖s f e ri n t oi n n e re a rt l m u g hd i f f e r e n ta p p r o a c h e sa n dg e n e r a t eg e n ep m d u c t ，a n ds h o w st h e r a
14、 p e u t i c e f k c tt oA S N H L K e yw o r d s a u t o i m m u n i t ) ，s e n s o r i n e u r a lh e 商n g1 0 s s ；g e n et h e r a p y ；l e n t i v i r a lV e c t o r 1 9 7 9 年M c C a b e 通过对部分感音神经性聋患者的 临床观察J ，首先提出自身免疫性感音神经性聋这一 概念( a u t o i m m u n es e n s o r i n e u r a lh e 撕n gl o s s ，A S
15、N H L ) ， 之后许多相关专家和学者对该病进行了大量的实验与 临床研究，现已证实，A s N H L 是一种临床疾病实体。 作为目前极少数可以获得有效治疗的感音神经性聋 ( s N H L ) 之一，对其进一步研究工作已成为耳科学领 域的一个热点。 自1 9 9 6 年基因治疗应用于内耳，基因疗法被认为 是未来治疗听力障碍最有希望的方法之一【2 引。目前 A S N H L 治疗方面存在以下问题：激素和免疫抑制剂虽 然有效，但需应用较长的时间，可造成不同程度的毒副 作用；部分患者听力改善达到一定水平后，继续用药疗 效甚微。基因治疗具有一次注射、长期有效的特点，而 且内耳解剖结构特点非常适
16、合进行局部基因治疗。本 项目组在前期实验研究中已采用腺病毒与白介素。l O ( I L 一1 0 ) 和F a s l 基因构建重组载体，对A S N H L 模型动 物进行试验性治疗，证实具有显著的治疗效果M J 。本 次实验采用I L - 1 0 基因与慢病毒构建重组载体，经不 同途径导人内耳，旨在进一步证实局部应用免疫调节 基因对A S N H L 的治疗效果以及不同导入途径的疗效 和安全性，以期探索一种高效、安全和简便的A s N H L 内耳局部基因治疗方法。 1 材料和方法 1 1 实验动物 选择白毛、红眼、健康、3 月龄豚鼠( 雌雄不限) ，体 重2 5 0 3 0 0g ，耳廓
17、反射正常，耳镜检查排除中耳疾 患。所用动物由南京市青龙山实验动物繁殖场提供。 1 2 纯化内耳抗原( p I l r i f i e di 肋e r 髓r 锄t i g e n ， P 嗽) 的制备 将豚鼠清醒断头，取出听泡，在解剖显微镜下分离 膜迷路组织 包括基底膜、螺旋韧带、膜半规管、椭圆 囊和球囊( 去除耳石器) ，置于0 1m o 卜L p H7 4 磷酸盐缓冲液( P B S ) 中，经研磨、冻溶、超声粉碎、匀 浆、离心( 10 0 0r m i n ，5m i n ) 后取上清液，采用紫外 分光光度计测定蛋白含量”J 。采用非变性凝胶电泳 进行蛋白分离，参照标准蛋白，切取5 8k
18、D 条带【6J 。将 膜迷路组织粉碎、匀浆，制成纯化内耳抗原备用。 1 3A s N H L 动物模型制备 将8 0 只豚鼠采用P I E A g 免疫。首次将P I E A g 凝 胶匀浆液0 2I I l l 与等量完全弗氏佐剂( S i g l l l a 公司，美 国) 乳化后，注射于豚鼠右后足垫和背部多点皮下，以 后每隔2 周，采用首次抗原用量的一半与等量不完全 弗氏佐剂注射，作为强化免疫，共2 次J 。 末次免疫后2 周，听觉脑干诱发电位( 肌d i t o r y b r a i n s t e mr e s p o n s e ，A B R ) 波阈值升高( 以免疫前全 部动物
19、均值加2 倍标准差作为判断标准) 并出现针对 P I E A g 特异性抗体( E U S A 法，波长4 9 0n mA 值，以免 疫前全部动物均值加2 倍标准差作为判断标准) 的豚 鼠被判断为A S N H L 模型动物。本组建模成功3 6 只。 1 4 实验分组 3 6 只A s N H L 模型动物按配对设计分成6 组：实 验组分A 、B 、C 亚组，对照组分D 、E 、F 亚组，每组6 只。全部动物手术操作均在全身麻醉下进行，麻醉方 法为3 的戊巴比妥钠3 0m g k g 1 腹腔注射。手术过 程实行无菌操作。 A 组采用鼓阶内注射法：在右耳廓后上方1 5 2c m 弧形切口，暴露
20、听泡。用微型电钻在听泡上钻一 直径约0 5c m 的圆孔，暴露耳蜗底转。用针尖轻轻磨 薄耳蜗鼓阶侧壁的骨壁，钻一针尖大小的孔，用微推进 器将小儿头皮针的针尖( 针尖斜面已打磨变小) 刺穿 骨膜及螺旋韧带，插入鼓阶，深度不超过1m m ，先抽取 少量( 约1 0 斗1 ) 的外淋巴液，再通过微量注射泵缓慢 ( 以0 7 5 卜m i n 。1 的速率匀速注入5 山) 注入治疗基 因。完毕后，退出针头，迅速用骨蜡封闭小孔，以防止 外淋巴液和治疗基因流出。抗生素冲洗中耳腔3 次， 部分局部放置氧氟沙星明胶海绵预防感染。再用明胶 海绵和骨蜡封闭听泡骨孔。然后逐层缝合切口。 B 组采用圆窗龛局部置药法：
21、手术方法同上，暴露 听泡腔后，看清圆窗龛，把浸有携带目的基因慢病毒载 体液( 4 0 山) 的明胶海绵贴放在圆窗龛局部。 C 组采用内淋巴囊注射法：经内淋巴囊途径注入 治疗基因。豚鼠麻醉后，耳廓后上方皮肤切口，分离皮 下和肌肉，暴露枕骨后面，采用枕骨后凹进路，切削钻 头磨开枕骨的颅骨后凹骨质，分离和推开硬脑膜和乙 万方数据 东南大学学报( 医学版) 2 0 l O 年6 月，2 9 ( 3 ) 状窦，暴露内淋巴囊，内淋巴囊部位注入5 山慢病毒 载体液。骨蜡填充骨质缺损，充分止血后缝合皮肤。 D 、E 、F 为模拟手术对照组，均注入P B S 。操作方 法：D 组同A 组，E 组同B 组，F 组
22、同C 组。 1 5 观察指标 1 5 1 血清特异性抗体测定分别于免疫前、末次免 疫后2 周和慢病毒载体液局部注射治疗后2 周心脏采 血，分离血清，采用酶联免疫吸附分析法( e n z ) r m e l i n k e d i I I l r n u n o s 0 I b e n t 鹊s a y ，E L I s A ) 检测针对P I E A g 的特异性 抗体水平。方法为分别采用1 0 0 斗g I I l l P l E A g 凝胶 匀浆液1 0 0 “l 孔。1 包被E u S A 板，4 过夜，P B S - T w e e n 2 0 洗板3 次，每次5m i n ，分别加
23、入用P B s1 ：1 0 稀释的各相应组受试动物血清，1 0 0 斗卜孔，封闭， 3 7 下孵育2h ，洗涤同前；加入1 ：20 0 0 稀释的辣根 过氧化物酶标记山羊抗豚鼠I g G ( S i g n l a 公司，美国) 多 克隆抗体，1 0 0 山孔，3 7 孵育lh ，P B S - T w e e n 2 0 洗板；以T M B 为底物3 7 显色1 0m i n ，用2m o l L “ H ：S O 。终止反应，用酶联免疫检测仪测定4 9 0n m 波长 吸光度( A ) 值。 1 5 2A B R 测试分别于免疫前、末次免疫后2 周 和基因治疗后采用电反应测听系统行A B
24、R 测试。方 法为用l 的戊巴比妥钠( 3 0m g k g 。1 ) 予豚鼠腹腔注 射进行全麻，置隔声屏蔽室内，采用针形电极插入豚鼠 头顶冠状缝与矢状缝交界处作为测试电极，参考电极 置于耳廓后方靠近乳突尖，接地电极置于对测乳突，采 用c l i c k 作为刺激声信号，刺激重复率为1 1 次s ，带 通滤波为1 0 0 一30 0 0H z ，叠加20 4 8 次，记录各波反应 阈值、潜伏期和波幅。 1 5 3 内耳火棉胶切片光镜观察豚鼠末次听觉电 生理检查后，每组各取豚鼠2 只，立即断头，取出双侧 颞骨，修整后浸泡福尔马林固定2 4h ，l O 乙二胺四乙 酸( e t h y l e n
25、 ed i a m i n et e t r 龃c et i c a c i d ，E D T A ) 脱钙，浸泡 硫酸锂2 4h ( 防止组织膨胀) ，逐级酒精脱水和浸胶， 火棉胶定向包埋和修块后，水平切片机切片( 片厚 2 0 2 5 “m ) ，每一耳蜗取靠近蜗轴的3 张切片，保存 于7 0 酒精，H E 染色后光镜观察一。10 | 。 1 5 4 免疫组织化学试验于末次听觉测试后，各组 取豚鼠4 只，麻醉、断头，迅速取颞骨，打开听泡，放置 4 多聚甲醛固定液中，用针挑开圆窗，在蜗尖钻一小 孔，快速灌注数次，固定1 2h ，采用E D T A 脱钙7 1 0d ，修剪后流水冲洗1 2h
26、，常规脱水、透明、浸蜡、 定向包埋。行耳蜗中轴切片，片厚5 “m 。 ( 1 ) 酶免疫组织化学试验：每组各2 只动物，取切 片，用胰酶( 0 2 ) 修复抗原，正常山羊血清封闭 1 0m i n ，加P B S 稀释的一抗( 兔抗鼠I L l O ，) ，4 过 夜，P B S 洗5m i n ，共3 次，加入二抗( 辣根酶标记的山 羊抗兔I g G ) ，3 7 孵育3 0m i n ，P B S 洗5m i n ，共3 次， D A B 染色，封片剂封片，光学显微镜观察摄片。以上 试剂购买自武汉博士德生物工程有限公司。 ( 2 ) 荧光组织化学法：每组各取2 只动物的颞骨 蜡块，行耳蜗中
27、轴切片，片厚5 斗m ，漂片、捞片、粘片后 常规脱蜡至水，在倒置荧光显微镜下直接观察和摄片。 1 6 统计学处理 经正态性检验，各组血清中P I E A g 的特异性抗体 水平( A 值) 、A B R 波阈值的结果符合正态分布，所 得数据以孟s 表示，应用s P S s1 3 0 软件对数据进行 统计分析，P 0 0 5 ) 。各组治疗后与免疫后相比，未见显著性差异 ( 配对f 检验，尸 0 0 5 ) 。 2 2 听觉功能 见表2 。 与免疫前相比，免疫后各组A B R 平均阈值升高， 差异均有统计学意义( f 检验，P 0 0 5 ) 。对照组内耳局部 给药前后比较，A B R 平均阀值
28、差异无统计学意义。 万方数据 陈文博，等I L 一1 0 基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究 2 6 5 表2各组免疫前后及局部治疗后右耳A B R 波阈 值( d B ，p e S P L ) ( 牙s ) T a b27 I l l eA B Rw a v et h r 髑h o mi nd i f f b r e n t g r o u p sb e f o r ea n da f t e ri I l l 哪u n i z a t i o na n da rl o c a l g e n et h e r a p y ( d B ，p e S P L ) ( 莺5 ) 各
29、组内同期左右耳比较，A B R 平均阈值差异均无 统计学意义( t 检验，P 0 0 5 ) 。以各组免疫后的 A B R 平均阈值减2 倍标准差作为判断听觉功能改善 标准，实验A 组有4 耳、B 组有3 耳、C 组有2 耳( 均为 慢病毒载体注射耳) 听觉功能明显提高，治疗有效率 分别为6 7 ( 4 耳6 耳) 、5 0 ( 3 耳6 耳) 、3 3 ( 2 耳6 耳) ；对照组内耳局部给药后，未发现有明显 听力功能提高。 2 3 内耳光镜观察结果 见图l 3 。各对照组均可见不同程度的膜迷路 积水( 图l A ，图l B ) ，螺旋神经节和蜗轴小血管周围有 炎症细胞、淋巴细胞浸润，部分听
30、损耳还可见螺旋神经 节细胞数目减少( 图l C ) 。 A A 组A S N H L 模型动物内耳切片，示膜迷路积水4 0 1 0 ；B D 组A S N H L 模型动物内耳切片，示重度膜迷路积水4 0 1 0 ； c F 组A s N H L 模型动物螺旋神经节切片，示螺旋神经节细胞数明显减少4 0 1 0 A I 衄e re 盯h i s t 叩a t h o l o 舀cs e c t i o no f0 n eA S N H Lm o d e l 粕i m a Jf m m 伊叫pA ，w h i c hs h o w e de n d o l y m p h “ch y d r o
31、 p s4 0x1 0 ；B I 咖e re 甜 h i s t o p a t h o l o 舀cs e c t i o no fo n eA S N H Lm o d e l 明i 眦lf I _ o mg p m u pD ，w h i c hs h o w e dc o 璐p i c u o u 8e n d o l y m p h a t i ch y d m p s 4 0 l O ；C S p i I 甜 g 加曲o nh i s t o p a t h o l o 舀c a ls e c t i o no fo n eA S N H Lm o d e l 绷i I I l a
32、 lf hg r o u pF ，w l l i c h8 h o w e dd e c r e a 船0 fs p i m Ig a n g l i c e U sn u m b e r 4 0 1 0 图1内耳组织切片光镜观察 2 4 免疫组织化学试验 2 4 1 免疫荧光试验荧光显微镜观察，实验A 组 和B 组荧光主要显示部位基本一致( A 组：血管纹、螺 旋韧带、C o n i 器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围；B 组： 螺旋神经节、螺旋韧带、C o n i 器、血管纹，蜗轴小血管 周围前庭膜) ；C 组荧光主要显示部位为内淋巴囊、内 淋巴管、前庭囊斑、壶腹嵴等处。对照组均未见明显荧 光
33、积聚。 2 4 2 酶免疫组织化学酶免疫组织化学观察结果 显示各组实验耳基因产物表达部位：A 组为血管纹、螺 旋韧带、C o n i 器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围；B 组 为螺旋神经节、螺旋韧带、C o n i 器、血管纹，蜗轴小血 管周围前庭膜等处；c 组为内淋巴囊、内淋巴管、前庭 囊斑、壶腹嵴等处。 3 讨论 目前临床A S N H L 患者几乎均采用传统自身免疫 病治疗方法，即采用皮质激素或免疫抑制剂治疗【l ， 虽然疗效较快、较好，但该类药物毒副作用多，而且还 存在停药后复发率较高等问题。与传统的治疗方法相 比，基因治疗具有高效性和靶向性、一次注射长期发挥 疗效等优点。内耳的解剖特征
34、，即存在相对独立和封 闭的腔隙，非常适合局部注射和基因治疗。现有的研 究表明，基因治疗在听力损伤和平衡障碍的治疗方面 有较大的潜在应用价值，目前内耳基因治疗正从试验 可行性研究转向内耳安全导入的探索上。 万方数据 2 6 6 东南大学学报( 医学版) 2 0 1 0 年6 月，2 9 ( 3 ) A A 组动物的螺旋韧带切片的照片4 0 l O ，可见有明显的荧光反应，尤以血管纹部位更为显著；B A 组动物的螺旋神经节纵轴切 片的照片4 0 1 0 ，可见螺旋神经节细胞有明屉荧光反应；C B 组动物的螺旋神经节切片的照片4 0 1 0 ，可见有明显的荧光反 应；D B 组动物的螺旋韧带切片的照
35、片4 0 l O ，可见螺旋神经节细胞有明显荧光反应，较A 组稍弱；E B 组动物的螺旋韧带切片 的照片4 0 1 0 ，可见有明显的荧光反应，尤以血管纹部位更为显著 A Ap h o t os l i c es p i r a ll i g a m e n t ( z m 1 0 ) o fg m u pA ，s h o w 8s i g n 访c a n tn u o m s c e n tr e a c t i o n ，e s p e c i a l l yv 踮c u l a rp a t t e mi sm o r ep m m i n e n t p 嘴i t i o n ；B
36、Av e r t i c a la 】【i ss l i c es p i r a lg a n d i o np h o t o g m p h s ( 4 01 0 ) o fg m u pA ，s p i m l 髟m 甜i o nc e l l sc a nb es e e ns i g n i f i c a n tf l u o r e s c e n t r e a c t i 叽；C Ap i c t u r eo fs p i r a Jg 肌掣i o n8 l i c e s ( 4 0 1 0 ) o fg m p eB ，s h o w 8s i 印i 矗c 锄tn u
37、 o r e 8 c e n tr e a c t i o n ；D Ap i c t u r eo fs l i c e so fs p i r a l l i g a m e n t ( 4 0 l O ) o fg m u pB ，s h o w ss p i r a lg 明g l i o nc e l l s ，s i 印m c 彻tn u o r e s c e n tr e s p o n s e ，w e a I 【e rt h a nt h eAg m u p ；E Ap i c t u r e0 fs l i c 髓 o fs p i m ll i g a m e n t
38、( z m 1 0 ) o fg r o u pB ，s h o w ss i g n m c 锄tf l u o r e s c e n tr e a c t i o n ，e s p e c i a U yv 如c l l l a rp a t t e mi sm o r ep m m i n e n tp o s i t i o n 图2 内耳组织中转染基因荧光自显影的免疫荧光组织化学染色 A A 组动物的螺旋韧带切片的照片1 0 1 0 ，可见有明显的染色，尤以血管纹部位更为显著；B B 组动物的螺旋韧带切片的照片 4 0 l O ，可见蜗轴血管周围和血管纹部位有明显显色；C A 组动
39、物的螺旋神经节纵轴切片的照片4 0 l O ，可见螺旋神经节细胞有 明显染色；D C 组动物的螺旋韧带切片的照片4 0 1 0 ，可见壶腹脊部位有明显的显色反应；E B 组动物的螺旋神经节纵轴切片的 照片4 0 1 0 ，可见螺旋神经节细胞有明显染色 A O n ep h o t o $ l i c es p i r a Jl i g a m e n t ( 1 0 l O ) o fg r o p eA ，s h o w sac l e a rs t a i n i n g ，e s p e c i a l l yi np a n 8o fv 跚u l a rp a n 哪i sm o r
40、ep m I I l i n e n t ； B Ap i c t u r eo f8 l i c eo fs p i r a lI i g 锄e n t ( z 1 01 0 ) o f 目m p eB ，c a nb es e e nm o d i o l a rb l o o dv e 8 s e l s 锄dv a s c u l a rp a t t e 吣a 工D u n dt h es i t ea c l e 盯c o l o r ；c Ap i c t u mo f 锄i r l l a l sav e r t i c a la x i s8 l i c es p i r a
41、 Jg 蛐一i o np h o t o g r a p h s ( 4 0 1 0 ) o fg r o p eA ，s h o w sac l e 盯s p i m lg 卸d i o nc e l l s s “n e d ；D w ec 明s e eac l e 盯p a no f 砌p u U ar i d g ec h m m o g e n i cr e a c t i o n ( 4 0 1 0 ) o fg r o p eC ；E S p i r a Jg a n g l i a 】【i ss l i c e so ft l ep i c t u r e ( 4 0 1 0
42、) o f 掣印eB ，s h o w sa c l e a rs p i r a Ig a n i o nc e l l ss t a i n e d 图3内耳组织中针对基因产物的酶免疫组织化学染色 万方数据 陈文博，等I L - 1 0 基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究 2 6 7 随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发 展，用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非 病毒性载体两类2 | 。慢病毒载体与简单的逆转录病 毒载体相比，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、容纳 外源性目的基因片段大，目的基因表达时间长、不易诱 发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗中载体 研究
43、的热点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。 载体进入体内的途径是决定安全有效基因治疗的 一个主要因素，耳蜗基因治疗必需确保转染基因精确、 有效定位于靶器官，以提高转染效率，降低易变性。目 前介导病毒载体进入耳蜗的方法有耳蜗切开、通过圆 窗注人、耳蜗底回钻孔注入、内淋巴囊注入3 | 、微渗透 泵和通过脑脊液【1 4o 等不同的进路。理想的导人模式 是载体能均匀地分布到内耳各个部位并转染特异性 细胞。 本项目设计利用内耳解剖特点和慢病毒载体的诸 多优势，采用慢病毒与免疫调查基因构建重组载体内 耳局部给药。同时考虑到由于耳蜗位置深在，结构复 杂，采用了圆窗龛局部给药这一较为便捷、安全和具有 临床应用前
44、景的给药途径，探讨重组基因载体经圆窗 膜渗透和导入内耳的实际疗效，并与内耳直接注射和 经内淋巴囊注射给药疗效的对比分析，了解其应用价 值和意义。 本次实验结果显示，采用纯化豚鼠内耳组织5 8 k D 抗原免疫豚鼠，可成功制作A S N H L 的动物模型。免疫 组织化学试验结果证实，3 种给药途径( 中耳腔给药经 圆窗膜渗透、鼓阶内注射和内淋巴囊局部注射) 均可 将携带I L - 1 0 的慢病毒载体转导入内耳，并在内耳表 达基因产物( I L 一1 0 ) 。听觉功能试验结果证实，3 种给 药途径均可有效改善豚鼠的听力，手术本身并不明显 影响听力。鼓阶和圆窗途径转染部位相似。圆窗途径 组织损
45、伤轻，能保持耳蜗的自然解剖结构。内淋巴囊 接种载体到达范围广，可有效地转染经鼓阶不易达到 的部位，该途径可能具有较特殊的应用价值，但操作较 为复杂。鉴于鼓阶途径有损伤听力的风险，而中耳腔 圆窗途径治疗因其简单易行，故有较好的应用前景。 参考文献 1 M c c A B EBF A u t o i m m u 舱辩咖r i n e u r a lh e 面n gl 8 J A n n0 t o lR h i n o lL a r y n g o l ，1 9 7 9 ，8 8 ( 5P 【1 ) ：5 8 5 5 8 9 2 L A L w A N IAK ，W a l s hBJ ，R e i
46、 U yPG ，e ta 1 D e v e l 叩m e n to f 讥砒g e n et h e r 印yf o rh e 撕I I gd i s o r d e 鹉：i n t m d u c t i o no f a d e n o s o c i a t e dv i m si n t o 山eg u i n e ap i g J G e n eT h e r ， 1 9 9 6 ，3 ( 7 ) ：5 8 8 9 2 3 R A P H A E LY 。F R I s A N c H 0Jc ，R O E s s L E RBJ A d e n o v i r a l m e d
47、 i a t l 耐g e 舱a n s f e ri n t og l l i n e ap i gc o c l l l e 盯c e U s 流口洳 J N e u m s c ik t t ，1 9 9 6 ，2 0 7 ( 2 ) ：1 3 7 。4 1 4 蔡文君，谭长强自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实 验研究 J 东南大学学报：医学版，2 0 0 9 ，2 8 ( 2 ) ：7 9 8 4 5 陆玲，谭长强致自身免疫性梅尼埃病主要内耳抗原成份分 析研究 J 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2 0 0 8 ，4 3 ( 8 ) ： 5 9 6 - 6 0 0 6 李玉瑾，谭长强纯化内耳
48、组织抗原免疫致豚鼠自身免疫 性梅尼埃病的实验研究 J 东南大学学报：医学版，2 0 0 9 ， 2 8 ( 3 ) ：1 5 7 - 1 6 2 7 谭长强特异性体液转移免疫致豚鼠先天性感音神经性聋 实验研究 J 东南大学学报：医学版，2 0 0 7 ，2 6 ( 5 ) ： 3 2 7 3 3 2 8 T A NcQ ，D O N cwD ，G u OL ，e ta 1 A u d i t o r yf u n c t i 伽i n w o m e nw i t 量la u t o i m m u n ei m l e re 盯d i s e a s 明dt h e i ro f f s p r i n g J I n tJP e d i a 仃帆d l i n o l a r y n g o l ，2 0 0 9 ，7 3 ( 1 2 ) ： 1 7 0 2 - 1 7 1 1 9 谭长强，周红，卜行宽，等同种内耳抗原免疫致聋豚鼠的 子代内耳生理功能和病理形态学研究 J 中华耳鼻咽喉 科杂志，2 0 0 5 ，4 0 ( 1 ) ：2 2 - 2 6 1 0 谭长强，董伟达，陆玲同种内耳抗原免疫孕豚鼠所产子 鼠听觉损伤