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1、I C S 1 1 . 2 2 0 8 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y J T 6 8 4 -2 0 0 3 犬瘟热诊断技术 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r c a n i n e d i s t e mp e r 2 0 0 3 - 0 7 - 3 0 发布2 0 0 3 - 1 0 - 0 1 实施 中华人民共和国农业部发 布 NY / T 6 8 4 -2 0 0 3 月 吐青 本标准的附录A为规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位: 农业部兽医诊断中心 本标准主要起
2、草人: 田克恭、 王宏伟、 遇秀玲、 陈西钊、 王传彬。 N Y / T 6 8 4 -2 0 0 3 犬瘟热诊断技术 1 范围 本标准规定了犬瘟热( C D ) 的临床诊断、 犬瘟热病毒( C D V) 的分离与鉴定、 免疫酶试验和免疫酶组 织化学方法等诊断技术 本标准适用于犬瘟热的诊断 2 临床诊断要点 2 . 1 临床症状 C D的临床表现多种多样， 与C D V的毒力， 环境条件， 宿主的年龄、 品种及免疫状态有关。病犬体 温升高至4 0 以上， 鼻流清涕至脓性鼻汁， 脓性眼屎， 有咳嗽、 呼吸急促等肺炎症状， 腹下可见米粒大丘 疹。病程长的犬足枕角质层增生。病后期C D V侵害大脑时
3、则出现神经症状， 头、 颈、 四肢抽搐。 2 . 2 病理变化 C D V为泛嗜性病毒， 对上皮细胞有特殊的亲和力， 因此病变分布非常广泛。新生幼犬感染C D V通 常表现胸腺萎缩。成年犬多表现结膜炎、 弃炎、 气管支气管炎和卡他性肠炎。表现神经症状的犬通常可 见鼻和脚垫的皮肤角化病。中枢神经系统的大体病变包括脑膜充血， 脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊 液增加。 C D V的包涵体通常呈嗜酸性， 位于胞浆内， 直径 1 t m-5 k m， 可在粘膜上皮细胞、 网状细胞、 白细 胞、 神经胶质细胞和神经元中发现。核内包涵体多位于被覆上皮细胞、 腺上皮细胞和神经节细胞。 3 病毒分离与鉴定 3 .
4、 飞 材料准备 3 . 1 . 1 试剂 3 . 1 . 1 . 1 改良最低要素营养液( D ME M) 培养基， 配方见第 A . 1 章。 3 . 1 . 1 . 2 非洲绿猴肾细胞( V e r o细胞) 。 3 . 1 . 1 . 3 标准阳性血清: C D V单克隆抗体， 中和抗体效价 1 ， 1 0 2 4 . 3 . 1 . 1 . 4 标准阴性血清: 无C D V感染的犬血清。 3 . 1 . 1 . 5 新生牛血清处理: 用无血清 D ME M 洗涤细胞两次， 加人培养液二分之一量的新生牛血清 3 7 吸附 1 h 。吸附后的新生牛血清分装， 置一2 0 备用 3 . 1
5、. 1 . 6 青霉素、 链霉素。 3 . 1 . 2 器材 a ) 细胞培养瓶; 卜 ) 吸管; c ) 二氧化碳培养箱; d ) 3 7 0C 恒温水浴箱; e ) 普通冰箱及低温冰箱; f ) 离心机及离心管; 9 ) 研磨器械; h ) 普通光学显微镜; N Y / T 6 8 4 -2 0 0 3 i ) 微量加样器， 容量 5 1, 1 - 5 0 1, 1 , 5 0 1, L - V 2 0 0 1, l ; j ) 0 . 4 5 1, m微孔滤膜。 3 . 1 . 3 样品 C D V存在于病犬心脏、 肺脏、 脾脏、 胸腺、 淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清 D
6、 ME M制成2 0 %组织悬液， 3 O O O r / mi n 离心 3 0 m i n ， 取上清。1 0 0 0 0 r / m i n离心 2 0 m i n ， 取上清用于 C D V分离。 3 . 2 操作方法 3 . 2 . 1 细胞培养 用含8 %已处理的新生牛血清的D ME M培养基， 在 3 7 培养 V e r 。 细胞。每 3 d -4 d 传代一次， 细胞长成单层时， 用于 C D V分离 3 . 2 . 2 病料接种 将。 . 1 m 工处理好的组织悬液接种 V e r 。 细胞， 3 3 吸附 1h ， 加人无血清D ME M继续培养5d - 7d ， 观察结
7、果 3 . 2 . 3 结果观察 C D V感染V e r o 细胞4 d -5 d 表现为细胞变圆、 胞浆内颗粒变性和空泡形成， 随后形成巨细胞和合 胞体， 并在胞浆中出现包涵体。若第一次接种未出现细胞病变， 应将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍 无细胞病变， 则判为 C D V检测阴性。 3 . 2 . 4 C D V的鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物， 按第4 章的方法制备细胞涂片， 用C D V单克隆抗体进行鉴定。 4 免疫1N试验 4 . 1 材料准备 4 . 1 . 1 试荆 4 . 1 . 1 . 1 磷酸盐缓冲液( P B S ) : 配制见第 A . 2 章。 4 . 1 .
8、1 . 2 杭原涂片的制备: 将C D V接种V e r o 细胞， 接种后5 d - 7 d ， 病变达5 0 环-7 5 %时， 用胰蛋白 酶消化分散感染细胞， P B S洗涤三次后， 稀释至 1 X1 0 个细胞/ m L 。取印有 1 0个4 0 个小孔的室玻 片， 每孔滴加 1 0 JA。室温自然干燥后， 冷丙酮( 4 0C ) 固定 1 0 m i n .密封包装， 2-2 0 备用。 4 . 1 . 1 . 3 标准阳性血清: C D V单克隆抗体， 中和抗体效价 1 : 1 0 2 4 , 4 . 1 . 1 . 4 标准阴性血清 无C D V感染的犬血清。 4 . 1 . 1
9、 . 5 酶结合物: HR P标记的葡萄球菌 A蛋白( S P A) . 4 . 1 . 1 . 6 底物溶液: 配制见第 A . 3章。 4 . 1 . 2 器材 a ) 普通光学显微镜; b ) 印有 1 0个4 。个小孔的室玻片; c ) 微量加样器， 容量5 川 5 0 p L ; d ) 3 7 恒温培养箱或水浴箱。 4 . 1 . 3 样品 采集被检犬血液， 分离血清， 血清应新鲜、 透明、 不溶血、 无污染， 密装于灭菌小瓶内， 4 或一3 0 保 存或立即送检。试验前将被检血清统一编号， 并用 P B S 作 1 0 倍稀释。 4 . 2 操作方法 4 . 2 . 1 取出抗原
10、涂片， 室温干燥后， 滴加 1 0 倍稀释的待检血清和标准阴性血清、 标准阳性血清， 每份血 清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔， 置湿盒内， 3 7 0C 3 0 m i n a 4 . 2 . 2 P B S漂洗三次， 每次 5 mi n ， 室温干燥 NY / T 6 8 4 -2 0 0 3 4 . 2 , 3 滴加适当稀释的酶结合物， 置湿盒内， 3 7 0C 3 0 m i n e 4 . 2 . 4 P B S 漂洗三次， 每次5 m i n e 4 . 2 . 5 将室玻片放人底物溶液中， 室温下显色 5 m i n -1 0 m i n , P B S 漂洗两次， 再用蒸馏水
11、漂洗一次。 4 . 2 . 6 吹干后， 在普通光学显微镜下观察， 判定结果。 4 . 3 结果判定 4 . 3 . 1 在阴性血清对照、 阳性血清对照成立的情况下: 即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均 无色; 阳性血清与正常细胞反应无色， 与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色， 即可判定结果; 否则应 重试 。 4 . 3 . 2 待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色， 即可判为C D V抗体阴性。 4 . 3 , 3 待检血清与正常细胞反应呈无色， 而与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色， 即可判为 C D V 抗体阳性。 免疫酶组织化学法 5 . 1 材料准备 5 . 1 .
12、1 试荆 a ) 磷酸盐缓冲液( P B S ) : 配制见第 A . 1 章。 b ) 标准阳性血清: C D V单克隆抗体， 中和抗体效价 1 : 1 0 2 4 c ) 标准阴性血清: 无C D V感染的犬血清 d ) 酶结合物: H R P标记的S P A o e ) 过氧化氢甲醇溶液: 配制见第 A . 4 章。 f ) 盐酸酒精溶液: 配制见第 A . 5 章。 9 ) 胰蛋白酶溶液: 配制见第A . 6 章。 h ) 底物溶液: 配制见第 A . 3章。 5 . 1 . 2 器材 a ) 普通光学显微镜; b ) 微量加样器， 容量5 0 p L - 2 0 0 p f ; c
13、) 石蜡切片机或冷冻切片机; d ) 载玻片及盖玻片; e ) 3 7 0C 恒温培养箱或水浴箱。 5 . 1 . 3 样品 对疑似C D V的病死犬或扑杀犬， 立即采集肺、 脾、 胸腺、 淋巴结和脑等组织数小块， 置冰瓶内立即 送检不能立即送检者， 将组织块切成 1 c m XI c m左右大小， 置体积分数为1 0 %的福尔马林溶液中固 定， 保存， 送检。 5 . 2 操作方法 5 . 2 . 1 新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片风干后用丙酮固定 1 0 m i n -1 5 mi n ; 新鲜组织或 固定组织按常规方法制备石蜡切片， 常规脱蜡至P B S ( 切片应用白胶或铬矾
14、明胶做粘合剂， 以防脱片) 。 5 . 2 . 2 去内源酶: 用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液3 7 作用2 0 m i n 5 . 2 . 3 胰蛋白酶消化: 室温下， 用胰蛋白酶溶液消化处理2 m i n ， 以便充分暴露抗原。 5 . 2 . 4 漂洗: P B S漂洗三次， 每次 5 mi n . 5 . 2 . 5 封闭: 滴加体积分数为5 %的新生牛血清或1 : 1 0 稀释的正常马血清， 3 7 0C 湿盒中作用3 0 m i n 5 . 2 . 6 加适当稀释的标准阳性血清或标准阴性血清， 3 7 C湿盒中作用 1 h或3 7 湿盒中作用 3 0 mi n 后 4 过夜。 5
15、 . 2 . 7 漂洗同 5 . 2 . 4 N Y / T 6 8 4 -2 0 0 3 5 . 2 . 8 加适当稀释的酶结合物， 3 7 0C湿盒作用 Ih 5 . 2 . 9 漂洗同 5 . 2 . 4 , 5 . 2 . 1 0 底物显色: 新鲜配制的底物溶液显色 5 mi n -1 0 mi n 后漂洗。 5 . 2 . 1 1 衬染: 苏木素或甲基绿衬染细胞核或细胞质。 5 . 2 . 1 2 从9 0 %乙醇开始脱水、 透明、 封片、 普通光学显微镜观察 5 . 2 . 1 3 试验同时设阳性对照和阴性对照。 5 . 3 结果判定 阳性和阴性对照片本底清晰， 背景无非特异着染，
16、 阳性对照组织细胞胞浆呈黄色至棕褐色着染， 试 验成立; 被检组织细胞胞浆、 偶见胞核呈黄色至棕褐色着染， 即可判为C D V抗原阳性。 6 综合判定 当在临床上怀疑有C D V感染时， 可根据实际情况在上述方法中选一种或两种方法进行确诊。对 于未接种过C D V疫苗的犬， 采用任何一种方法检测呈现阳性结果时， 都可最终判定为 C D V感染犬。 对于接种过 C D V疫苗的犬， 当病毒分离鉴定试验为阳性结果时， 可最终判定为C D V感染犬; 若仅血清 学试验呈现阳性结果， 应结合病史和疫苗接种史进行综合判定， 不可一律视为C D V感染犬。 N Y / T 6 8 4 -2 0 0 3 附
17、录A ( 规范性附录) 试剂的配制 D ME M( 高箱) 培养液的配制 量取去离子水 9 5 0 ml ， 置于适宜的容器中。 将D M E M粉剂1 0 g 加于3 0 的去离子水中， 边加边搅拌。 每1 。 。 。 m l 培养液加3 . 7 g 碳酸氢钠。 加去离子水至 1 0 0 0 m l ， 用 I m o l / I氢氧化钠或盐酸将培养液p H值调至p H 6 . 9 - 7 . 0 。在过 九九人九几 滤之前应盖紧容器瓶塞。 A . 1 . 5 立即用孔径。4 5 f a m的微孔滤膜正压过滤除菌， 4 冰箱保存备用。 A . 2 磷酸盐级冲液( P B S , 0 . 0
18、1 mo l / L p H 7 . 4 ) 抓化钠 氯化钾 磷酸二氢钾 十二水磷酸氢二钠 蒸馏水 8g 0 . 2 g 0 . 2 g 2 . 8 3 g 加至 1 0 0 0 ml A . 3 底物溶液 3 , 3 一 二胺基联苯胺盐酸盐( D A B ) PB S 丙酮 3 。 % 过氧化氢 浊纸讨滤后使用， 现用现配。 4 0 mg 1 0 0 mL 5 mL 0 . 1 ml -A . 4 过饭化氮甲醉溶液( 0 . 3 %) 3 0 % 过氧化氢 甲醇 现用现配。 A . 5 盐酸酒精溶液( 1 %) 1mL 9 9 m l 盐酸 7 0 %乙醇 1 ml 9 9 mL A . 6 胰蛋白醉溶液( 0 . 5 %) 胰蛋白酶。5 g P B S 1 0 0 mL 低温保存。使用时， 用P B S 稀释为。 . 0 5 %0