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1、死因子-、 细胞间黏附分子-1 的表达 J . 临床神经病学杂志， 2003； 16 （6） ： 350-2. 11 Stanimirovic D，Shapiro A，Wong J，et al. The induction of ICAM-1 in human cerebromicrovascular endothelial cells （HCEC）by ischemic-like conditions promotes enhanced neutrophil/ HCEC adhesionJ . Neuro- immunol， 1997； 76 （1-2） ： 193-205. 12 Zhan
2、g RL， Chopp M， Li Y， et al. Anti-ICAM-1 antibody reduces ische- mic cell damage after transient middle cerebral artery occlusion in the rat J . Neurology， 1994； 44： 1747. 13 张 敏， 张 辉 . 七叶皂甙钠对脑缺血和再灌注时大鼠脑组织中 NO 代谢的影响 J . 青岛大学医学院学报， 2003； 39 （3） ： 294-6. 2005-03-31 收稿 2005-09-14 修回 （编辑 牛铁兵） PDECGF 特异性
3、RNA 抑制片段对膀胱癌细胞作用的研究 金 宁 孔祥波 （吉林大学中日联谊医院泌尿外科， 吉林 长春 130033） 摘 要 目的 研究 siRNA （small interfering RNA） 对膀胱癌 t24 细胞株 PDECGF 基因表达的抑制作用及对癌细胞增殖和侵袭能力抑制的作 用。方法 体外合成特异针对人 PDECGF 基因的 siRNA； 荧光标记法标记 PDECGF siRNA； 转入 t24 细胞株； 流式细胞术检测 siRNA 的转染效率； west- ern blot 检测 siRNA 对 PDECGF 表达的抑制作用； MTT 法检测 siRNA 对细胞生长增殖抑制作用
4、； Boyden 小室法检测 siRNA 对细胞侵袭能力的影响。 结果 siRNA 转染组 PDECGF 表达水平明显下降。siRNA 转染组细胞生长增殖抑制率随作用时间而增高。siRNA 转染组细胞侵袭能力明显低于对 照组和空载体组。结论 siRNA 能特异有效下调 PDECGF 基因的表达， 能有效抑制膀胱癌细胞增殖及侵袭能力。 关键词 siRNA； 膀胱癌； PDECGF 中图分类号 R739. 7； R73-36 文献标识码 A 文章编号 1005-9202 （2006） 01-0074-03 Effect of RNA interference PDECGF genes on exp
5、ression in the t24 cell lines of bladder carcinoma JIN Ning，KONG Xiang-Bo. Department of Urology，China-Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun 130033，Jilin，China 【Abstract】 Objective To investigate inhibition of small interfering RNA（siRNA）on PDECGF gene expression in bladder carcino- ma
6、t24 and carcinoma proliferation and invasion. Methods siRNA aiming human PDECGF gene synthesized in vitro was labeled by fluores- cence and transfected t24 cells. The transfective rate of siRNA were detected by flow cytometry. The inhibitions of siRNA on PDECGF ex- pression，cellular growth and invas
7、ive ability were determined by Western blot，MTT and Boyden cabin method. Results The PDECGF ex- pression in siRNA transfective group obviously decreased. The inhibitive rate of cellular growth and proliferation in siRNA transfective group increased with treated time. The invasive ability in siRNA tr
8、ansfective group was significantly lower than that of control group and no-vector group. Conclusions siRNA of PDECGF genes can effectively down-regulate the expression of PDECGF genes and inhibit the proliferation and invasive ability of t24 cells. 【Key words】 siRNA；PDECGF；Bladder cancer 通讯作者： 孔祥波 （
9、1951-） ， 男， 教授， 博士导师， 主要从事泌尿外科临床 研究。 作者简介： 金 宁 （1977-） ， 男， 博士， 主要从事泌尿外科肿瘤学的研究。 血小板源性血管内皮生长因子 （PDECGF） 在肿瘤发生发 展过程中起着重要作用， 膀胱癌等癌组织中呈高表达状 态 1 3。该因子除促进新生血管形成外， 还能促进膀胱癌细胞 增殖、 以高其侵袭能力 2， 3。本研究采用 RNAi 技术沉默 PDECGF 基因表达， 通过一系列实验， 在细胞分子水平观察其 对人膀胱肿瘤 t24 细胞株增殖及侵袭能力的抑制作用， 为以后 进行动物体内研究以及膀胱癌的多基因联合干预治疗从基础 研究向临床应用过
10、渡提供可靠的理论基础。 1 实验方法 1. 1 细胞培养与分组 膀胱肿瘤 t24 细胞株 （吉林大学医学 硕士马雪涛惠赠， 购于美国 ATCC） 。DMEM 培养液 （10% 胎牛 血清， 青霉素和链霉素各 100 U/ ml） ，37 饱和湿度条件下培 养。实验前倒置显微镜下观察细胞形态良好， 无退化。将细胞 分为三组： 对照组： 不进行任何转染处理； 空载体组： 转入随机 合成的短链 RNA；siRNA 组： 转入针对 PDECGF 的 siRNA。 1. 2 siRNA 序列的合成 用 Ambion 公司的 Silencer siRNA construction kit 合成针对人 PD
11、ECGF 基因序列特异的 siRNA1。 siRNA1 结合的位点是 687 708。siRNA 的随机译本作为对 照， 命名为 siRNA1S。序列如下： siRNA1：5-GCAGCTTGTGGA- CAAGCAT - 3 ；siRNA1S ： AAGGCTCTGACAGGTGGTT。人 PDECGF 基因序列特异 siRNA1 与人 EST （expressed sequencet- ag） 数据库作序列比对， 确认与其他基因无结合位点。严格按 照试剂盒工作手册进行实验操作。体外转录合成 siRNA 后， 紫 外分光光度计定量， -70 冰箱保存备用。 1. 3 FAM 标记 siRNA
12、 体外转录合成 siRNA 后，参照工作手 册， 用 Silencer FAM siRNA Labeling Kit 标记 siRNA。标记后 -70保存， 备用。 1. 4 转染 96 孔板上均匀种植 t24 细胞，待细胞融合后， 按 转染试剂盒说明进行操作。分别用 Opti-MEMI 培养基稀释 47中国老年学杂志 2006 年 1 月第 26 卷 siRNA 和转染试剂， 再以 1 （nmol） ： 35 （l） 的比例混合， 进行转 染。转染后 18 24 h 换液一次， 继续培养。 1. 5 MTT 法检测细胞增殖抑制率 分别取 siRNA1 处理 24、 48、 96 h 后的对数
13、生长期 t24 细胞， 接种于96 孔板。于37CO2 培养箱中培养 24 h。小心吸出各孔内培养液。每组设 3 个复 孔， 于 37CO2培养箱中继续培养。培养结束前 4 h， 各培养孔 加入 5 mg/ ml MTT 10 l， 弃上清， 各孔加入 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 100 l， 振荡器震荡 10 min， 全自动酶标仪检测各孔吸 光度值 A570nm， 按下列公式计算抑制率： 抑制率 （CI， %）= （对 照组 A570nm- 实验组 A570nm） / 对照组 A570nm 100%。每组均设 3 个复孔 （取平均值作为 1 次实验结果） ， 重复实验 3 次。 1.
14、 6 Western blot 转染后 48 h， 将细胞经 0. 25% 胰酶消化， RIPA 细胞裂解液 （50 mmol/ L Tris-Cl，pH 7. 6；5 mmol/ LED- TA； 150 mmol/ L NaCl； 0. 5% NP-40； 0. 5% Triton-X-100，含 1 g/ ml leupeptin，aprotinin 和 antipain；1 mmol/ L NaVO4；0. 5 mmol/ L PMSF） 提取总蛋白。BCA 试剂盒 （Bio-Rad） 检测提取 的蛋白浓度（Bio-RadLaboratories） ， 以 30 g 总蛋白行 7. 5
15、% SDS-PAGE 电泳后转移到 PVDF 膜上， 5%脱脂奶粉4过夜封 闭， 依次用 1: 100 一抗和 1: 2 000 稀释辣根过氧化物酶标记的 二抗， 反应， 显色， 重复 3 次。 1. 7 体外侵袭实验 NIH3T3 细胞培养上清作趋化因子， Boy- den 小室上下室之间隔以无 PVP 膜 （Neuo Probe） ， 膜上铺50 l 1: 6 稀释的人工基底膜 （Mat rigel， CollaborativeRes） ， 上室加入 细胞悬液， 常规培养 10 h， 取出膜 HE 染色， 显微镜下计数穿膜 细胞数。每组设 3 个平行样本。 1. 8 统计学分析 所有的数据
16、结果用 x s 表示，数据的统计 用 t 检验进行分析。 2 结 果 2. 1 流式细胞术结果 siRNA1 处理 t24 细胞 48 h 后， siRNA 的转染效率为（72. 5 6. 1） %。 2. 2 细胞增殖抑制实验结果 siRNA1 处理 t24 细胞 24、 48、 96 h， 其抑制率分别为 （18. 5 5. 6） %、（51. 0 6. 5） %、（82. 2 5. 3） %， 抑制率在 0 96 h 时间范围内随时间的增加而增高 （P 0. 01） 。 2. 3 Western blot 结果 经 PDECGF siRNA 干扰的细胞标本 中，PDECGF 的含量明显降
17、低 （见图 1） 。而空载体组与对照组 相比变化不明显。 图 1 各组细胞 Western blot 结果 2. 4 体外侵袭实验 siRNA 组细胞穿越 Mat rigel 的细胞数为 6. 1 1. 3， 明显低于对照组及空载体组（分别为23. 5 5. 2 和 22. 9 6. 0） ， 差异有显著意义 （P 0. 05） 3 讨 论 PDECGF 是促血管生长因子之一， 能够刺激血管内皮细胞 生长和趋化，主要在瘤细胞和基质细胞表达， 它可以诱导内皮 细胞迁移和增殖。当表达增高时， 肿瘤细胞的分化差， 侵袭性 也高 4。已证实其在卵巢癌、 胰腺癌、 胃癌、 肺癌和直肠癌等许 多人体实体肿
18、瘤等许多实体肿瘤中异常增高 5， 且其表达增高 往往提示预后不良 6而降低其活性能抑制肿瘤生长。说明异 常增高的 PDECGF 不仅对血管新生有作用， 并且对肿瘤的恶性 度表现、 生长和转移均有影响。抑制 PDECGF 可能成为肿瘤治 疗中的一个新途径 6。据文献报道2， 7，PDECGF 在膀胱癌中 的表达 均 明 显 增 高， 而 正 常 膀 胱 组 织 中 很 少 表 达， 提 示 PDECGF 可能与膀胱癌的发生发展有一定关系， 并且在维持癌 细胞的生长过程中发挥着重要作用。实验还发现，PDECGF 阳 性表达率随膀胱癌的病理分期和组织分化程度升高而升高， 提 示 PDECGF 可加速
19、肿瘤的生长与侵袭， 与瘤细胞的增殖活性及 侵袭有关。 RNA 干扰作用 （RNAi） 是一些具有序列特异性的小双链 RNA（siRNA） 以高效特异地阻断体内特定基因表达， 促使 mR- NA 降解， 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。虽然目前反 义寡核苷酸在基因表达抑制中的应用最为广泛，但其有显著 的缺点，比如其治疗所需浓度往往与中毒剂量非常接近，而且 需经常给药以维持疗效 8。RNAi 是近年发现的一种细胞， 在 抵制外源性病毒或细菌侵入的自我调控机制。通过在细胞内 转染与靶基因相同序列的双链 RNA， 即可使靶基因降解， 而且 具有特异性强、 抑制效率高等特点 9， 10。 在本实验中，
20、 针对 PDECGF 设计了短链 RNA， 转染膀胱癌 t24 细胞株。Western blot 结果显示， 经 PDECGF siRNA 干扰的 细胞标本中，PDECGF 的含量明显降低。而空载体组与对照组 相比变化不明显。提示该 siRNA 能有效抑制 PDECGF 基因的 表达。本实验采用 MTT 法来观察 PDECGF siRNA 转染对膀胱 癌细胞增殖的抑制作用。转染后 24 h 空载体组 OD 值与对照 组接近， 而 siRNA 细胞 OD 值即明显低于对照组， 抑制率达 （18. 5 5. 6） %。且抑制率在 0 96 h 时间范围内随时间的增 加而增高 （P 0. 01） ，
21、 于 24、 48、 96 h 时间点其抑制率分别为 （18. 5 5. 6） %、 （51. 0 6. 5） %、 （82. 2 5. 3） %，表 明 PDECGF siRNA 转染转染对膀胱癌 t24 细胞株细胞增殖的抑制 作用明显。Boyden 小室法体外侵袭实验结果表明： siRNA 组细 胞穿越 Mat rigel 的细胞数为 6. 1 1. 3， 明显低于对照组及空 载体组（分别为23. 5 5. 2 和22. 9 6. 0） ， 提示针对 PDECGF 的 RNA 抑制能降低膀胱癌细胞的浸润能力。针对 PDECGF 的 RNA 抑制是一种有效的基因干预手段， 能有效地降低 PD
22、ECGF 表达、 抑制细胞增殖、 抑制细胞浸润能力的作用。 4 参考文献 1 OBrien TS， Fox SB， Dickinson AJ， et al . Expression of the angiogenic factor thymidine phosphorylase/ platelet derived endothelial cell growth factor in primary bladder cancer J . Cancer Res， 1996； 56 （20） ： 4799- 57金 宁等 PDECGF 特异性 RNA 抑制片段对膀胱癌细胞作用的研究 第 1 期 804
23、. 2 Mizutani Y，Okada Y，Yoshida O. Expression of platelet-derived endo- thelial cell growth factor in bladder carcinoma J . Cancer， 1997； 79 （6） ： 1190-4. 3 Crew JP， OBrien T， Bradburn M， et al. Vascular endothelial growth fac- tor is a predictor of relapse and stage progression in superficial bladde
24、r cancer J . Cancer Res 1997； 57 （23） ： 5281-5. 4 Guo L， Kuroda N， Toi M， et al. Increased eapression of plate derived en- dothelial cell growth factor in human hepatocellular carcinomas correlated with high Ed mondson grades and portal vein tumor thrombosis J . Oncol Rep， 2001； 8 （4） ： 871-6. 5 Tak
25、ebayashi Y， Akiyama S， Akiba S， et al . Clinicopathologic and prog- nostic significance of an angiogenic factor， thymidine phosphorylase，in human colorectal carcinomaJ. Natl Cancer Inst， 1996； 88（16）: 1110-7. 6 Imazono Y， Takebayashi Y， Nishiyama K，et al. Correlation between thy- midine phosporylase
26、 expression and prognosis in human renal cell carci- noma J. Clin Oncol， 1997； 15（7） ： 2570-8. 7 Kanayama H，Yokota K，Kurokawa Y，et al. Prognostic values of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in bladder cancer J . Cancer， 1998； 82 （7） ： 1359-66. 8 Detric
27、k B， Nagineni CN， Grillone LR， et al. Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression J . Biochemistry， 2002； 41 （14） ： 4503-10. 9 Paul CP，Good PD，Winer I. Effective expression of small interfering RNA in human cells J . Nat Biotechnol， 2002； 20 （5） ： 505-8. 10 Br
28、ummelkamp TR，Bernards R，Agami R. A system for stable expres- sion of short interfering RNAs in mammalian cells J . Science，2002； 296 （5567） ： 550-3. 2005-09-14 收稿 2005-10-10 修回 （编辑 胡国义） 改良成骨细胞体外培养和鉴定方法 胡 静 郑洪新 （辽宁中医学院基础医学院， 辽宁 沈阳 110032） 摘 要 目的 探讨理想的成骨细胞培养和鉴定方法。方法 同时采用多次胶原酶消化法及骨片贴附法获得成骨细胞， 应用 Gomori
29、 改良钙 钴法和在此基础上苏木精复染法做成骨细胞鉴定， 通过做成骨细胞动态形态学观察和生物学鉴定， 比较不同细胞培养法和鉴定法。结果 多次胶原 酶消化法获得的成骨细胞数量更多， 纯度更高， 密度更均匀一致， 多数细胞处于同一个生长周期； 在改良钙钴法基础上做苏木精复染， 成骨细胞结构 更清楚， 棕黑色颗粒分布位置更清晰可见， 和阴性对照比较差异更显著。结论 多次胶原酶消化法获得的成骨样细胞更适于做体外实验研究模型； 采用苏木精复染法做成骨细胞鉴定更有效。 关键词 成骨细胞/ 生理学； 形态学； 碱性磷酸酶； 酶消化法； 鉴定； 细胞培养 中图分类号 R813. 1 文献标识码 A 文章编号 1
30、005-9202 （2006） 01-0076-03 作者简介： 胡 静 （1975-） ， 女， 博士， 主要从事骨质疏松症等老年病机 理的研究。 成骨细胞体外培养技术不仅是研究成骨细胞生物学特性 及功能调节的重要工具， 而且常用来研究代谢性骨病的发病机 制及防治问题。成骨细胞包绕在硬组织中， 致使取材困难， 虽 然用骨组织块法、 酶消化法、 骨膜组织块法、 骨髓培养法以及薄 层骨片经 EDTA 处理并经胶原酶消化， 均可分离培养出成骨细 胞 1， 但是成骨细胞纯度不一。我们选用新生大鼠头盖骨做实 验材料， 同时采用多次胶原酶消化法和骨片贴附法培养， 应用 Gomori 改良钙钴法和在此基础
31、上苏木精复染法鉴定成骨细胞， 并进行互相比较， 期望找到更可靠的成骨细胞培养和鉴定方 法。 1 材料与方法 1. 1 动物 新生 Wester 大鼠 （出生 24 h 以内） 15 只。购自中 国医科大学实验动物中心。动物合格证号： SCXK （辽） 2003- 0009 号。 1. 2 方法 1. 2. 1 试剂与仪器 D-MEM 培养基 （高糖）（Gibco） ， 胰蛋白 酶 （Gibco） ， 型胶原酶 （Gibco） ， MTT （SIGMA） ， HEPES （Hy- clone） ， 胎牛血清 （中国科学院天津血液研究所） ， Hank s （SIG- MA） ， 大扶康 （辉瑞）
32、 ， -甘油磷酸钠 （FlukaAG） ， 巴比妥纳、 无 水氯化钙、 硫酸镁、 硫化胺、 NaHCO3、 DMSO 等均为分析纯。120 目不锈钢网筛过滤器、 311 型 CO2培养箱 （Forma， 美国） ， CK- 40F200 倒置显微镜 （OLYMPUS， 日本） ， 超净工作台 （苏州净化 设备厂） ， 离心机， 显微镜， 6 孔、 96 孔培养板 （NUNC， 丹麦） ， 培 养瓶， 15 ml 离心管， 解剖器具等。主要液体配制：（1） 碱性磷酸 酶染色孵育液： 3% -甘油磷酸钠 10 ml， 2% 巴比妥纳 10 ml， 2%无水氯化钙 20 ml， 2% 硫酸镁 1 m
33、l， 蒸馏水 5 ml， pH 9. 4。 （2） MTT： 取 5 mgMTT 3- （4， 5-二甲基噻唑-2） -2， 5-二苯基-四唑 氢溴酸盐 ， 溶于 1 ml 生理盐水中， 抽滤备用。 1. 2. 2 新生大鼠成骨细胞的分离培养 大鼠成骨细胞原代培 养方法参照文献 1并略作修改。将 15 只新生的 Wester 大鼠放 入 75%酒精中浸泡消毒 15 min， 无菌操作取下颅盖骨， 除去附 着的血管及结缔组织， 用 Hank s 溶液清洗 3 次， 剪成 1 mm3大 小的碎块。用 Hank s 溶液清洗 3 次， 加入 8 倍于骨碎块体积 的 0. 25%胰蛋白酶， 于 37水浴中预消化 30 min （其间不时摇 动） ， 然后以 1 000 r/ min 离心 5 min， 弃去消化液， 用 Hank s 溶 液清洗干净后， 弃去上清， 再加入 8 倍于骨块体积的 0. 02% 67中国老年学杂志 2006 年 1 月第 26 卷