《NY-T 680-2003 禽白血病病毒p27抗原 酶联免疫吸附试验方法.pdf.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY-T 680-2003 禽白血病病毒p27抗原 酶联免疫吸附试验方法.pdf.pdf（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、I CS 1 1 . 2 2 0 R 41 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 6 8 0 -2 0 0 3 禽 白 血 病 病 毒 p 2 7抗 原 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 方 法 E n z y me - l i n k e d i mmu n o s o r b e n t a s s a y f o r a v i a n l e u k o s i s v i r u s p 2 7 a n t i g e n 2 0 0 3 - 0 7 - 3 0发布2 0 0 3 - 1 0 - 0 1 实施 中华人民共和国农业部发 布 N Y / T 6
2、 8 0 -2 0 0 3 前言 本标准的附录 A为规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位: 农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人: 陈西钊、 苏敬良、 王宏伟、 田克恭、 吴清民、 王传彬 N Y / T 6 8 0 -2 0 0 3 禽 白 血 病 病 毒 p 2 7抗 原 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 方 法 范 围 本标准规定了禽白血病病毒( AL V ) p 2 7 抗原酶联免疫吸附试验方法 本标准适用于检测鸡蛋蛋清以及鸡胚组织细胞培养物中的 AL V p 2 7 蛋白抗原口 2 p 2 7 抗原酶联免疫吸附试验 2 . 1 试验材料 2 . 1 . 1
3、 试剂 2 . 1 . 1 . 1 抗 p 2 7蛋白抗体: 应用提纯的禽成髓细胞性白血病病毒 p 2 7蛋自免疫家兔制备。 2 . 1 . 1 . 2 阳性抗原: 含鸡白血病/ 肉瘤病毒群特异性p 2 7 蛋白抗原的鸡蛋清 2 . 1 . 1 . 3 阴性抗原: 无鸡白血病/ 肉瘤病毒群特异性 p 2 7 蛋白抗原的S P F鸡蛋清。 2 . 1 . 1 . 4 酶结合物: 辣根过氧化物酶标记的抗 p 2 7 蛋白抗体 2 . 1 . 1 . 5 磷酸盐缓冲液( P B S ) : 配制见第 A . 1 章 2 . 1 . 1 . 6 包被液: 配制见第A . 2 章 2 . 1 . 1 .
4、 7 洗涤液: 配制见第 A . 3 章。 2 . 1 . 1 . 8 样品稀释液: 配制见第 A . 4章 2 . 1 . 1 . 9 底物溶液: 配制见第 A . 6 章。 2 . 1 . 1 . 1 0 终止液: 配制见第A . 7 章 2 . 1 . 2 器材 a ) 酶联检测仪; b ) 聚苯乙烯板; c ) 微量加样器， 容量 5 0 川 - 2 0 0 p 工 ; d ) 3 7 恒温培养箱 2 . 1 . 3 样品 2 . 1 . 3 . 1 鸡蛋样品: 将待检鸡蛋小的一端朝上放置， 打碎蛋壳， 用移液器无菌吸取蛋清， 密装于灭菌小 瓶内。 2 . 1 . 3 . 2 细胞培养
5、物: 用移液器无菌吸取细胞培养物， 密装于灭菌小瓶内， 1 0(或一3 0 保存或立即送 检。试验前将送检样品统一编号， 试验时不做稀释口 2 . 2 操作方法 2 . 2 . 1 用包被液将抗 p 2 7 蛋白抗体作4 0 0 0 倍稀释， 每孔 1 0 0 川 加入9 6 孔聚苯乙烯板中， 4 过夜。 2 . 2 . 2 取出包被好的聚苯乙烯板， 将液体倒弃， 每孔加2 5 0川_ 洗涤液漂洗 三 次， 每次2 m i n ， 甩干。 2 . 2 . 3 每孔加 1 5 0阿_ 质量浓度为1 %的明胶封闭液, 3 7 反应6 0 m i n 2 . 2 . 4 重复 2 . 2 . 2 2
6、 . 2 . 5 在A , , A : 孔各加 1 0 0 p L标准阴性对照， A , A 孔各加 1 0 0川 标准阳性对照 2 . 2 . 6 将待检样品加人其他各孔， 每个待检样本加两孔， 每孔7 0 0 川 , 3 7 0( _ 反应6 0 m i n , 2 . 2 . 7 重复 2 . 2 . 2 e 2 . 2 . 8 每孔加 1 0 0沁 工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗 p 2 7 蛋自抗体 3 7 反应 6 0 m i n e N Y / T 6 8 0 -2 0 0 3 2 . 2 . 9 重复 2 . 2 . 2 2 . 2 . 1 0 衍孔加 1 0 0川 新配制的
7、底物溶液， 室温， 避光反应 1 0 m i n 2 . 2 . 1 1 征孔加 1 0 0 p 1终止液口 2 . 2 . 1 2 置酶联检测仪于 4 5 0 n m测定各孔吸光度( O D ) 值。 2 . 3 结果判定 2 . 3 . 1 阻性对照 ( ) D均值等于( A , 孔 O D值+A : 孔 ( ) D值)2 ; 阳性对照 O D均值等于( A : 孔 O D 值+A 孔 ( ) D值) / 2 2 . 3 . 2 阴性对照 (O D均值小于。 . 1 5 ， 阳性对照 O D均值减去阴性对照 0 1 ) 均值大于。 . 3时试验成立， 否则重做。 2 . 3 . 3 S /
8、 I 等于( 样品孔 ( ) D均值一阴性对照 ) D均值) 一( 阳性对照 ( ) D均值一阴性对照 O D均值) 待检样本 S / P小于等于。 . 2 判为阴性， 表示待检样品中无 A L V , p 2 7蛋白抗原 待检样本 ，I 大于。 . 2 判为阳性， 表示待检样品中有 A I . Vs p 2 7蛋自抗原 N Y / T 6 8 0 -2 0 0 3 附录A ( 规范性附录) 试剂的配制 A . 1 磷酸盐缓冲液( P B S , 0 . 0 1 m o l / L p H 7 . 4 ) 氯化钠 氯化钾 磷酸二氢钾 于 一 二水磷酸氢二钠 蒸馏水 8g 0 . 29 0 .
9、2 g 2 . 8 3 g 加至 1 0 0 0 ml A . 2 包被液( 0 . 0 5 m o l / L p H 9 . 6 ) 碳酸钠 碳酸氢钠 蒸馏水 加 至 飞 5 9 g 9 3 g 0 0 0 ml A . 3 洗涤液 PBS Twe e n - 2 0 1 0 0 0 0 5m l,m I. A . 4 样品稀释液 含体积分数1 0 %新生牛血清的洗涤液。 A . 5 磷酸盐一 柠檬酸缓冲液( p H 5 . 0 ) 柠檬酸 十二水磷酸氢二钠 蒸馏水 3 . 2 6 g 1 2 . 9 g 7 0 0 - I A . 6 底物溶液 用二甲基亚矾将3 1 3 1 5 1 5 1 四甲基联苯胺( T M B ) 配成1 %的浓度. 1 1( 保存 使用时按下列配方配制 底物溶液 。 磷酸盐一 柠檬酸缓冲液9 . 9 ml , I Y , 3 3 5 5 - 四甲基联苯胺0 . 1 ml . 3 0 %双氧水1 川 A . 7 终止液 硫酸 蒸馏水 m l,n il,