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1、I C s 6 7 . 0 5 0 B 5 0 S公 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 水产品中己烯雌酚残留量的测定 酶联免疫法 D e t e r m i n a t i o n o f d i e t h y l s t i l b e s t r o l r e s i d u e s i n f i s h e r y p r o d u c t s E n z y me l i n k e d i m mu n o s o r b e n t a s s a y 2 0 0 4 一 0 1 一 0 7 发布 2 0
2、0 4 一 0 3 一 0 1 实施 中华 人 民共 和 国农 业 部 发布 S C A T 3 0 2 0 -2 0 0 4 前 ， ，月 口叫国 匀 本标准的附录P l 和附录B均为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准起草单位： 中国水产科学研究院长江水产研究所、 农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心。 本标准主要起草人： 艾晓辉、 刘长征、 邹世平、 徐忠法、 李荣。 S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 水产品中己烯雌酚残留量的测定酶联免疫法 范围 本标准规定了水产品中己烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。 本标准适用于水产品肌肉中己烯雌酚的测定。 2 规范性
3、引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件， 其随后所有 的修改单（ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应， 所有的免疫反应都在微孔中进行， 加人己烯雌酚标准 或样品溶液、 己烯雌酚酶标记物、 己烯雌酚抗体后， 己烯雌酚与己烯雌酚酶标记物相互竞争己烯雌酚抗 体的结合位点。 结合的己 烯雌酚酶标记物可以 将无色
4、的 发色剂转化为蓝色的产物， 在4 5 0 n m处检测， 吸收光强度与样品中的己烯雌酚浓度成反比， 按校正曲线定量。 4 试剂和材料 本标准所用试剂除标明外， 其他均为分析纯及其更高纯度， 试验用水符合G B / T 6 6 8 2一级水标准。 4 . 1 叔丁基甲基醚： 色谱纯。 4 . 2 石油醚。 4 . 3 二氯甲烷。 4 . 4 甲醇： 色谱纯。 4 5 氢氧化钠： 1 m o l / L . 4 6 磷酸： 6 m o l / L . 4 . 7 2 0 甲醇的2 0 m m o l / L 三经基甲 基氨基甲 烷（ T r is ） 缓冲液（ p H 8 . 5 ) , 4 0
5、 %, 7 0 0 6 , 8 0 的甲醇溶 液， 此溶液现用现配。 4 . 8 6 7 m m o l / L 磷酸盐缓冲液（ p H 7 . 2 ) : 9 . 6 1 g 磷酸氢二钠， 1 . 7 9 g 磷酸二氢钠溶解于蒸馏水， 定容至 1 0 0 0 M L ， 此溶液现用现配。 4 . 9 己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒， 参见附录Ao 5 仪器与设备 5 1 5 2 酶 标仪： 波长4 5 0 nn. 离心机： 转速4 0 0 0 r / m in a 氮吹仪。 电热恒温水浴锅。 高速匀浆机。 q斑月只 反J民J工气U S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 5 . 6
6、 C j8 固 相提取柱： 长6 . 5 c m ， 内 径0 . 7 c m . 5 . 7 固相萃取器。 5 . 8 微M漩AN合仪。 5 . 9 振荡器。 5 1 0 微量加样器： 2 0 p L , 5 0 p L , 1 0 0 p L , 2 5 0 p L , 1 0 0 0 p L , 5 . 1 1微量多 通道加样器： 5 0 p L , 1 0 0 p L o 6 样品处理 6 . 1 试样提取 取出鱼、 虾、 蟹、 鳖等水产品肌肉部分， 除净脂肪和结缔组织， 样品切成不大于0 . 5 c mxo . s c mx 0 . 5 c m的小块后混匀， 置冰箱中冷冻备用。 将样
7、品 解冻， 取5 g （ 精确到0 . 0 1 g ） 样品于匀浆机的 玻璃管中， 加1 0 m L 6 7 m m o l / L磷酸盐缓冲 液 ( p H 7 . 2 ) ， 充分匀浆， 称取3 g （ 精确到0 . 0 1 g ） 匀浆 组织于2 0 m L 玻璃离心管中， 加人8 m L 叔丁基甲 基 醚， 强烈振荡2 0 m i n , 4 0 0 0 r / m i n 离心1 0 min ， 转移出上清液至2 0 m L玻璃离心管中， 再用8 M L 叔丁基 甲基醚重复提取沉淀物， 将两次提取的醚相合并， 7 0水浴蒸发至干。 取7 0 的甲醇1 M L溶解干燥的残留物， 加3
8、m L石油醚洗涤甲醇溶液， 漩涡混合1 m i n , 4 0 0 0 r / m i n 离心1 m i n ， 吸除石油醚， 置水浴锅中蒸发甲醇溶液， 用1 M L二氯甲烷溶解， 加1 m o l / L 氢氧化钠溶 液3 m L , 漩涡 振荡后静置， 取出上层氢氧化钠溶液， 加人6 m o l / L 磷酸3 0 0 p L中和提取液， 用q8 固相 提取柱进一步纯化。 6 . 2 样品纯化 将C 8 固 相提 取柱垂直固定， 用3 m L 无水甲 醇洗涤柱子， 再用2 m L 2 0 甲 醇的2 0 m m o l / L T r is 缓 冲 液（ 州 8 . 5 ) 平衡柱子，
9、紧接着将上述用磷酸中和 后的氢氧化钠提取液用1 0 0 0 p L 微量加样器全部加 入柱中， 过柱， 然 后用2 m L 2 0 甲醇的2 0 m m o l / L T ri s 缓冲液（ p H 8 . 5 ) 洗涤柱子， 接着用3 m L 4 0 的 甲醇洗涤柱子， 弃去过柱的溶液， 用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2 m i n 以干燥柱子。 用2 m L 8 0 的甲醇洗脱样品（ 以上溶液洗柱、 平衡柱和提取液过柱的流速皆为1 滴/ s 左右， 可用 固 相萃取器抽真空控制） ， 收集洗脱液， 向 洗脱液中加入2 m L 水， 取2 0 I .L 进行酶联免疫测定。 7 酶联
10、免疫测定 检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好（ 参见附录A ) 。控制室温至2 0 r -2 4 r - ， 取出足够数量的微 孔 条 插 人 微 孔 架中， 加 人2 0 IL L 的 标 准 液和 处 理好 的 样品 到 各自 的 微 孔 底 部， 记录 各 标准 液 和 样品 的 位 置， 标准和 样品 做两个平行实验。 每个微孔中加人5 0 p tL 稀释后的己烯雌酚抗体， 微旋振荡混合， 置 2 C - - 8 冰箱中 孵育 2 0 h o 取出微孔架， 回复到室温2 0 C -2 4 r - ， 洗板（ 甩出孔中的液体， 将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3 次， 以 保证完全除去孔中
11、的液体。 用2 5 0 p L 蒸馏水充人孔中， 再次倒掉微孔中 液体， 再重复 操作两次） ， 加人5 0 u L 稀释的酶标记物到微孔底部， 微旋振荡充分混合后， 置室温孵育1 h ， 再洗板后（ 同上述洗板 方法） ， 每个微 孔中加入5 0 t L 基质和5 0 p L 发色试剂， 充分混合， 并在室温暗处孵育3 0 m in ， 每个微孔 中 再加 人1 0 0 ) L 反应停止液， 混合后在6 0 m i n 内 测量并 记录每 个微孔4 5 0 二 处的吸光 度值。 8 结果计算 8 . 1 计算相对吸光度值 计算每个己烯雌酚标准液和样液的平均吸光度值， 按公式（ 1 ) 求出己
12、烯雌酚标准液和样液的相对吸 光度值。 S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 R z A ; / A o x 1 0 0 （ 1 ) 式中： R ;相对吸光度值， 单位为百分比（ ） ； A o 空白 标准的吸光 度值； A Z标准或样品的平均吸光度值。 8 . 2 绘制校正曲线 以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标， 以己烯雌酚浓度的对数为横坐标， 绘制出己烯雌酚标准液 相对吸 光度值与己 烯雌酚 浓度的 校正曲 线（ 参见附录B ) ， 校正曲 线在0 . 0 5 t g / L - - 0 . 4 ju g / L 范围内 应当 成为线性 ， 相对应每一个样品的己烯雌酚浓度可以从
13、校正曲线上读出。每次试验均应重新绘制校正曲 线。 8 . 3 结果计算 在8 . 2 绘制的校正曲线上读出的相对应每一个样品的己烯雌酚浓度乘以相对应的稀释系数（ 本标 准所采用的稀释系数为 4 ) ， 即为试样中的己烯雌酚残留量。 9 检测限、 回收率 9 . 1 检测限 本方法的检测限为0 . 6 t g / k g o 92 回收率 本方法的回收率）7 0 %. S C / T 3 0 2 0 -2 0 0 4 附录A （ 资料性附录） 己烯雌酚酶联免疫定t测定试剂盒 A . 1 己烯雌酚酶联免疫定t测定试剂盒 己 烯雌酚测定试剂盒由 德国R - B io p h a m i 公司制造 ）
14、 ， 可用于肌肉、 尿、 胆汁、 粪便及肝脏中的己烯 雌酚残留检测。试剂盒应保存在2 C - 8 的干燥避光环境中， 并在有效期内使用， 试剂变质应当弃 掉2 ) 。 所有试剂应达到室温2 0 一 2 4 后使用。每 个试剂盒包括： I x 框架， 孔板（ 1 2 条x 8 孔） 包被有兔抗己 烯雌酚的抗体（ 兔I g G 抗体） 。 6 x 标准液（ 1 . 3 m L / ) I& ) ， 为4 0 的己烯雌酚甲 醇水溶液： 0 p g / I0 . 0 2 5 fi g 几, 0 . 0 5 f e g 几、 0 1 ji g / L , 0 . 2 p g / L , 0 . 4 g
15、A . o l x己烯雌酚过氧化物酶标记物浓缩液（ 0 . 7 ml , ) . I x己烯雌酚抗体浓缩液（ 0 . 7 m L ) l x 酶基质（ 7 m L ) ： 含有过氧化脉。 1 x发色剂（ 7 m日： 四甲基联苯胺。 l x 反应停止液（ 1 4 m L ) ： 1 m o l / 1 _ 硫酸。 1 x 缓冲液（ 2 5 m L ) o A. 2 己烯雌酚酶标记物的稀释 用试剂盒提供的缓冲液以1 : 1 1 的比例， 在玻璃试管中稀释酶标记物浓缩液， 轻轻地振摇， 充分混匀 后使用（ 由于稀释的酶标记物稳定性不好， 所以只稀释实际需用量的酶标记物） 。 A . 3 己烯雌酚抗体
16、的稀释 用试剂盒提供的缓冲液以1 : 1 1 的比例， 在玻璃试管中稀释抗体浓缩液， 轻轻地振摇， 充分混匀后使 用（ 由于稀释的抗体稳定性不好， 所以只稀释实际需用量的抗体） 。 1 ) 德国R - B io p h a n n 公司生 产的己 烯雌酚测定试剂盒是适合的市售产品的实 例。 给出 这一信息是为了 方便本 标 准的使用者， 并不排除运用同等性能的其他产品。 2 ) 发色 试剂 有任何颜色， 表明 发 色剂已 变 质； 空白 标准的 吸 光度值小于0 . 6 个单 位（ A 4 5 。 二 0 . 6 ) 时， 表示试剂可 能变质 。 S C A T 3 0 2 0 -2 0 0 4 附录B 【 资料性附录） 己烯雌酚的标准曲线 009080706050403020100 次恻侧米督友年 0 .0 2 50 .0 5 0 . 1 己 烯雌酚 浓度， j g / L 图 B . 1 己烯雌酚的标准曲线