SIRNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对鼻咽癌细胞VEGF表达的影响.pdf

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1、现代中西医结合杂志M o d e mJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u l ，1 8 ( 2 1 ) 2 4 9 9 蘩! 每肇系戮 s i R N A 沉默H I F 一1 仅在缺氧状态下对鼻咽癌细胞 V E G F 表达的影响 曾伟，张建国 ( 广州医学院第二附属医院，广东广州5 1 0 2 6 0 ) 摘要】目的观察体外乏氧培养条件下鼻咽癌细胞系C N E I I 中缺氧诱导因子一1 d ( H I

2、F 一1 a ) 和血管内皮生长因子( V E G F ) 的表达，探讨H I F h 在低氧条件下对鼻咽癌血管 生成的调控作用。方法C o C l 2 化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，R T P C R 、免疫印迹法 ( W e s t e r nb l o t ) 分别检测缺氧状态下H I F 一1 a 和V E G F 在m R N A 和蛋白水平的表达。采用化 学合成小干扰R N A ( s i R N A ) 介导的R N A 干扰技术( R N A i ) 转染C N E 一细胞。观察转染后 H I F 一1 d 沉默效果。结果低氧条件下，C N E 一细胞H I F l am R N

3、 A 水平稳定，蛋白表达 显著升高，而V E G Fm R N A 和蛋白的表达均显著升高。s i R N A 转染C N E 一后能够显著下 调H I F h 的基因表达，同时V E G F 基因的表达也受到明显抑制。结论缺氧促使C N E 一 细胞H I F 一1 a 在蛋白水平表达升高，并通过转录激活V E G F 的机制调控鼻咽癌血管生成。 关键词】鼻咽癌；乏氧诱导因子一l a ；血管内皮生长因子；小干扰R N A ；R N A 干扰 中图分类号】R 一3 3 2 文献标识码】A【文章编号】1 0 0 8 8 8 4 9 ( 2 0 0 9 ) 2 1 2 4 9 9 0 5 I n

4、f l u e n c eo fs i l e n c i n gH I F 一1 ab ys i R N Ao ne x p r e s s i o no fv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r i nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ac e l lu n d e rH y p o x i a Z e n gW e i Z h a n gJ i a n g u o ( T h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t

5、 a lo fG u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ，G u a n g z h o u5 1 0 2 6 0 ，G u a n g d o n g ，C h i n a ) A b s t r a c t ：O b j e e t i v eI ti st oo b s e r v et h ee x p r e s s i o no fh y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r - 1 a ( H I F 一1 a ) a n dv a s c u l a re n d o t h e l i a l

6、 g r o w t hf a c t o r ( V E G F ) i nh u m a nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m ac e l l l i n eC N E 一u n d e rh y p o x i ai nv i t r o ，a n da p p r o a c ht h ee f f e e to fH I F l ao nh y p o x i a - a c t i v a t e da n g i o g e n e s i sr e g u l a t i o np a t h w a yi nn a s o

7、p h a r y n g e a lc a r c i n o m a M e t h o d sC o C L 2w a su s e d a sac h e m i c a lh y p o x i a - i n d u c i b l er e a g e n tt Om i m i ct u m o rh y p o x i cm i c r o e n v i r o n m e n t T h ee x p r e s s i o no fH I F l aa n dV E G F o nR N Aa n dp r o t e i nl e v e l sw e r ed e

8、t e c t e db ys e m i q u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( R T P C R ) a n dw e s t e l T lb l o t T h eC N E I Ic e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t hR N A i n t e r f e r e n c e ( R N 舢) o r i g i n a t e db ys m a l li

9、 n t e r f e r e n c eR N A ( s i R N A ) T h ec h a n g eo fV E G Fg e n ee x p r e s s i o nw a so b s e r v e da f t e rH I F l ag e n es i l e n c e R e s u l t sU n d e rh y p o x i a 。t h em R N Al e v e l so fH I F l aw a ss t a b l e w h i l ei t sp r o t e i nl e v e lW a si n c r e a s e d

10、o b v i o u s l y ；b o t hm R N Aa n dp r o t e i nl e v e l so fV E G F w e r eu p - r e g u l a t e d A f t e rs i R N At a r g e t i n g ，t h eH I F l ag e n ew a sd o w n r e g u l a t e de f f i c i e n t l yi nC N E I Ic e l l s ，a n dV E G F g e n ew a sd o w n r e g u l a t e d 嬲w e l l C o

11、n c l u s i o nH y p o x i ac a ni n c r e a s ep r o t e i nl e v e lo fH I F l ai nC N E 一H I F l ac a nu p - r e g u l a t e st h eg e n ee x p r e s s i o no fV E G Fw h i c hp r o m o t e sa n g l o g e n e s i si nh u m a nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a K e yw o r d s ：n a s o p

12、h a r y n g e a Ic a r c i n o m a ；h y p o x i a i n d u c i b l ef a c t O r 一1a l p h a ：v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ；s m a l li n t e r f e r e n c eR N A ；R N Ai n t e r f e r e n c e 恶性肿瘤快速生长和肿瘤内部血液供应相对不足常常导 致肿瘤内部形成缺氧微环境，因此，肿瘤细胞对缺氧的适应和 血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤，且与肿瘤的生长和

13、扩散密切相关【1 。在此过程中缺氧诱导因子一l a ( H I F l a ) 【作者简介】曾伟( 1 9 8 l 一) 。男。硬士，研究方向为头颈部肿瘤的 诊治。 通信作者】张建国，就职于广州医学院第二附属医院耳鼻喉 科E m a i l ：i n t z j g y a h 0 0 t o m c I l 起到中枢纽带作用；H I F h 是调节肿瘤细胞缺氧反应的主 要转录因子，其在许多肿瘤中高表达，其与肿瘤高度侵袭性、 易转移、对放化疗不敏感和预后不良密切相关。血管内皮生 长因子( V E G F ) 是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，对血 管形成具有重要作用；同时，V E G F 的活

14、性亦受到多种因素的 调控；近年研究发现，V E G F 在缺氧组织中的转录活化主要受 H I F l a 调节，并保持其m R N A 的稳定性。因此，以H I F a 和V E G F 为靶点的基因治疗将为有效抑制肿瘤的生长提供 新途径。本研究以鼻咽癌细胞系C N E 一为研究对象，通过 万方数据 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n MC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u l ，1 8 ( 2 1 ) 体外模

15、拟缺氧微环境，以R N A 干扰为基础，采用脂质体介导 的转染方法，研究H I F l a 小干扰R N A ( s i R N A ) 对缺氧诱导 的C N E 一细胞转染前后低氧条件下H I F l q 和V E G F 的 表达，初步探讨H I F 一1 a 在缺氧条件下对鼻咽癌血管生成的 调控作用。 1 实验资料 1 1 材料和仪器鼻咽癌细胞C N E 一购自中山大学细胞 库；1 6 4 0 细胞培养基购自H y c l o n e 公司，标准胎牛血清和含 E D T A 的胰蛋白酶均购自天津T B D 公司；氯化钴( C 0 c l ，) 购 于广州威佳科技公司；T R I Z O

16、L 试剂、逆转录试剂盒和P C R 试剂盒均购于T i a n g e n 公司。P C R 引物由上海博尚公司合成； s i R N A 干扰片段序列由广州锐博公司设计及合成；脂质体 L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 购自I n v i t r o g e n 公司；兔抗H I F 一1 a 多 克隆抗体购自S a n t aC r u z 公司，兔抗V E G F 多克隆抗体购于 N e o m a r k e r s 公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I g O 二抗购 于博士德公司；P V D F 膜购自P A L L 公司，E C L 显色试剂盒

17、购 于T i a n g e n 公司。c c h 培养箱为美国S H E L L A B 公司产品，生 物安全柜购自T h e r m o 公司，相差倒置荧光显微镜为C a r l Z e i z z 公司产品，G e n e A m p9 7 0 0 型P C R 仪为美国A B I 公司产 品，蛋白电泳及转膜系统为B i o R a d 公司产品。 1 2 方法 1 2 1 细胞培养鼻咽癌细胞C N E 一用含1 0 胎牛血 清，1 0 0I U m L 青霉素，1 0 0u g L 链霉素的R P M I l 6 4 0 培养 液，在3 7 、5 0 3 2 培养箱中培养，细胞贴壁生长

18、，每周传 代培养2 次，以保持细胞在对数生长期。低氧环境通过在培 养基中加入C o C I ：实现。本研究采用化学缺氧诱导剂C O C l 2 加入培养基的终浓度为1 0 0 t m o l L 来模拟肿瘤内部缺氧微 环境。 1 2 2s i R N A 的合成根据G e n B a n k 中H I F h 基因( N M 一 0 0 1 5 3 0 ) 的m R N A 序列设计s i R N A 作用靶点，其靶序列为 T A C G l v r G T G A G T G G T A T T A T T ( 1 3 0 2 1 3 2 2 ) ；并设计合 成无义对照序列：A A T T

19、C T C c G 从C G T G T C A C G T ( 广州锐博 生物公司) ；s i R N A 和无义对照序列都在G e n B a n kd a t a b a s e 进 行B L A S T 检索，所设计的s i R N A 序列仅与人H I F l a 序列 相配，而无义寡核苷酸对照链顺序不与任何人基因序列相配。 1 2 3 缺氧干预及R N A 干扰取对数期的细胞以( 2 5 ) 1 0 5 孔。1 接种至含2m LR P M l l 6 4 0 培养液的6 孔板中，置于 5 c c h 、3 71 2 空气培养箱中培养，待细胞培养至9 0 融合度 时按要求分为常氧组、

20、单纯缺氧组、反义寡核苷酸缺氧组 ( s i R N 蝻F l 。) 和无义寡核苷酸缺氧组( s i R N A H l F l 。) ；弃除培 养液，常氧组、单纯缺氧组：每孔加入2m L 含1 0 胎牛血清 的R P M l l 6 4 0 培养液；s i R N A 占I F l 。及s i R N A H I F l 。缺氧组：根 据细胞转染试剂L i p o f e c t a m i n e T M2 0 0 0 的转染操作说明每孔 分别加入5 0 0 “L 含反义寡核苷酸无义寡核苷酸的转染复合 物及15 0 0 肛L 无血清R P M l l 6 4 0 培养液；各组均置于5 c 0

21、 2 、3 7 1 2 空气培养箱中培养；培养6h 后，s i R N A 二l F - l 。及s i R N A 面F 一1 。缺氧组更换含1 0 胎牛血清的R P M l l 6 4 02m L ；转 染2 4h 后，单纯缺氧组、s i R N A 矗I F 一1 。及s i R N A f i I F - 1 。缺氧组更 换含化学缺氧诱导剂C O C l 2 的R P M I l 6 4 0 培养基2m L ；继续 置于5 c 0 2 、3 71 2 空气培养箱中培养，2 4h 及4 8h 后分别行 R T P C R 检测及W e s t e r nb l o t 检测。 1 2 4

22、 半定量R T P C R 检测m R N A 的表达T R I Z O L 法 提取各组细胞的总R N A 并定量；各样本取1 弘g 总R N A 。按 T i a n g e n 公司试剂盒说明进行逆转录；取e D N A 5 止样本，常 规P C R 反应，p a c t i n 为内对照。P C R 引物如下：p a c t i n 上游为5 一T C C A T C A T G A A G T G T G A C G T 一3 。下游5 一 T A C T C C T G C T T G C T G A T C C A C 一3 ( 2 4 5 b p ) ；H I F l a 上游

23、 5 一C A A A A C A C A C A G C G A A G C 一3 ，下游5 一T C A A C C C A G A C A T A T C C A C C 一3 ( 4 7 3 b p ) ；V E G F 上游5 一C C A T G A A C T T T C T G C T G T C 门1 G G 一3 。下游5 一C T C A C C G C C T C G G ( T G T C A C 一3 ( 7 0 2 b p ) 。反应条件为：H I F l a ：预 变性9 4 2m i n ；9 5 4 5s ，6 41 2lm i n ，7 2 1r a i

24、n ，共2 7 个 循环；7 2 延伸1 5m i n ；V E G F ：预变性9 4 2m i n ；9 51 24 5 s ，6 3 3 0s ，7 2 1m i n ，共2 8 个循环；7 2 延伸1 5r a i n 。 2 琼脂糖凝胶电泳检测P C R 产物。B a n d l e a d e r 3 0 软件对成 像结果进行灰度扫描分析，每组检测5 个样本。应用8 一a c t i n 的光密度值作为内对照，得出H I F l am R N A 和V E G Fm R N A 表达的相对比值。R T P C R 产物比值= ( H I F l a ( V E G F ) m R

25、N A 灰度值内对照B a c t i n mR N A 灰度值) 1 0 0 。 1 2 5 细胞总蛋白提取及W e s t e r n B l o t 检测蛋白的表达分 别刮取各组细胞，离心去上清。以冷P B S 洗涤2 次。细胞沉 淀用0 5 m L 细胞裂解缓冲液( 组成：1m o l LT r i s H C I ( p H 8 0 ) ，0 1 5m o l LN a C I ，1 0 T r i t o n X 一1 0 0 ，1 0 0m g L P M S F ) 重悬，置冰上摇床3 0m i n 后，于4 1 20 0 0r m i n 离 心5m i n ，取上清。总蛋白

26、含量用B C A 蛋白测定试剂盒定量。 加入上样缓冲液。1 0 0 5m i n ，取2 5 耀蛋白样品经1 0 S D S - - - P A G E ，1 2 0V8 0m i n 电泳分离总蛋白，以半于式电转 仪1 0 0V8 0m i n 转移蛋白至P V D F 膜。膜用含5 脱脂奶的 P B S T 室温孵育1h 后，加入兔抗人多克隆H I F 一1 a 抗体 ( S a n t aC r u z 公司，稀释度1 ：2 5 0 ) ，B a c t i n 一抗( S a n t aC r u z 公 司，稀释度1 ：4 0 0 ) ，4 杂交过夜。次日洗膜3 次，每次1 5 r

27、a i n ，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I g G 二抗( 博士德公 司，稀释度I ：20 0 0 ) ，室温孵育1h ，T B S 漂洗，应用E C L 试剂 盒行发光反应。图像扫描分析。兔抗人多克隆V E G F 一抗稀 释度为1 ：3 0 0 ( N e o m a r k e r s 公司) ，其他步骤方法同上。 1 3 统计学处理A 值用叠5 表示，采用S P S s1 1 5 统计 分析软件对数据进行分析，不同组间比较采用单因素方差分 析，P 0 0 5 为有显著性差异。 2 结果 2 1R N A 干扰对鼻咽癌C N E 一细胞H I F l am R N A 表 达的抑制提

28、取未转染组( 常氧、低氧) 、转染组和阴性对照组 的鼻咽癌细胞的总R N A ，半定量R T P C R 法检测H I F 一1 a 基因m R N A 水平的表达。结果显示，在常氧条件下培养的 万方数据 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u l ，1 8 ( 2 1 ) C N E I I 细胞有H I F l am R N A 的表达；在C O C l 2 模拟的缺

29、 氧条件下，培养2 4h 后，其表达没有明显升高；转染H I F h S i R N A 后。C N E I I 细胞H I F l am R N A 的表达明显被抑 制，而无义s i R N A 组H 1 F l am R N A 表达没有变化，见图1 。 用B a n d i e a d e r3 0 软件进行灰度扫描分析，H I F h 正义 s i R N A 组C N E I I 细胞H I F l am R N A 的表达明显被抑制 ( 4 5 5 2 3 ) ，而无义s 承N A 组没有明显变化( 7 9 2 4 ) ，2 组比较有显著性差异( P 0 0 1 ，7 = 5 )

30、；显示H I F l as i m R N A 能有效降解H 1 F l am R N A ，抑制其表达。 M ：D N A M a r k e r D L 2 0 0 0 ，1 ：常氧组，2 ：低氧组，3 ：转染组，4 ：阴性 对照组 图l H I F I as i R N A 对细胞H I 卜l am R N A 表达的抑制 2 3R N A 干扰对鼻咽癌C N E 一细胞H I F l a 蛋白表达 的抑制提取未转染组( 常氧、低氧) 、阴性对照组和转染组的 鼻咽癌细胞的总蛋白，采用免疫印迹( W e s t e r n b l o t ) 定量分析 H I F l a 蛋白质的表达，结

31、果显示，C N E 一细胞H I F 1 a 蛋 自在常氧条件下表达微弱；缺氧培养4 8h 后，H 1 F l a 蛋白表 达显著；H I F l as i R N A 组C N E 一细胞H I F 一1 a 蛋白的表 达明显下调，而对照组H I F l a 蛋白表达没有变化，见图2 。 提示H I F 一1 a 蛋白质表达受低氧诱导，而H I F hs i R N A 通 过降解H I F l am R N A ，从而有效抑制其蛋白合成。 1 ：常氧组，2 ：低氧组，3 ：转染组，4 ：对照组 图2H I F l as i R N A 对细胞H I F 一1 a 蛋白表达的影响 2 4 抑

32、制H I F l a 表达对v E G Fm R N A 表达的影响提取 未转染组( 常氧、低氧) 、阴性对照组和转染组的鼻咽癌细胞的 总R N A ，半定量R T P C R 法检测V E G F 基因m R N A 水平的 表达。结果显示，在常氧条件下培养的C N E 一细胞中， V E G Fm R N A 的表达较低；在C o C l 2 模拟的缺氧条件下培养 2 4h 后，其表达有明显升高；C N E I I 细胞转染H I F hs i R N A 并缺氧培养2 4h ，当H I F l am R N A 的表达被抑制后， V E G Fm R N A 的表达也明显下降；而无义s

33、i R N A 组V E G F m R N A 表达没有变化，见图3 。用B a n d l e a d e r3 0 软件进行灰 度扫描分析，H I F 一1 as i R N A 转染细胞在缺氧培养2 4h 后， V E G Fm R N A 的表达随H I F l a 显著下降( 5 7 6 4 8 ) ；而 无义s i R N A 组V E G F m R N A 表达变化不明显( 8 8 0 2 9 ) ， 二者有显著性差异( P 0 0 1 ，i t = 5 ) ，提示H I F l as i R N A 抑 制H I F - l a 的表达后，V E G Fm R N A 的表

34、达被有效下调。 M ：D N A M a r k e r D L 2 0 0 0 ，1 ：常氧组，2 ：低氧组，3 ：转染组，4 ：阴性 对照组 图3H I F 一1 nR N A 干扰对细胞V E G Fm R N A 表达的抑制 2 5 抑制H I F 一1 a 表达对V E G F 蛋白表达的影响 C N E 一 细胞缺氧后，V E G F 蛋白表达有明显的升高；转染H I F l a s i R N A 并缺氧培养2 4h ，H I F h 蛋白的表达被抑制后， V E G F 蛋白的表达也明显下降；而无义s i R N A 组V E G F 蛋白 表达没有变化，见图4 。显示H I

35、F l as i R N A 抑制H I F l a 的表达后，V E G F 蛋白水平被有效下调( 咒= 5 ，P 0 0 5 ) ，说 明缺氧条件下V E G F 的蛋白表达受H I F l a 的调控。 1 ：常氧组，2 ：低氧组，3 ：转染组，4 ：阴性对照组 图4 H I F l aR N A 干扰对C N E 一细胞V E G F 蛋白表达的抑制 3 讨论 鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，而广东省是鼻咽癌 的高发区 2 。放射治疗作为目前对鼻咽癌最有效的治疗手 段，但5a 生存率仅为3 2 5 6 ，且放疗后复发以及放疗的 各种并发症，都要求我们提出更好的治疗手段来解除患者的 痛苦

36、。作为生长迅速的实体肿瘤，鼻咽癌生长到一定体积时， 癌细胞常常处于缺氧微环境，为了维持肿瘤持续生长，必须依 赖新生血管形成，抑制肿瘤血管生成可阻止肿瘤的生长与转 移，因此抗肿瘤血管生成治疗为临床鼻咽癌治疗学开辟了一 条新途径。 H I F 一1 广泛参与哺乳动物细胞中缺氧诱导产生的特异 应答，在缺氧诱导的基因表达调节中起着关键作用。H I F 一1 由2 个亚基组成：H I F l a 和H I F 一1 0 。H I F l a 定位于1 4 号染色体( 1 4 q 2 1 4 ) ，而H I F 一1 B 定位于1 号染色体( 1 q 2 1 ) 。 H I F h 具有氧浓度依赖性功能域

37、( O D D ) 。常氧条件下该功 能域与E 3 泛醌连接酶结合通过泛素一蛋白酶途径将H I F 一 1 a 迅速降解，半衰期不到5m i n 【3 1 ；而缺氧时，细胞内脯氨酸 万方数据 2 5 0 2 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n 丑lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u l ，1 8 ( 2 t ) 羟化酶( P H D s ) 受抑制，卜F h 泛素降解途径受阻，H I F 一1 a 在 核内聚

38、集，同时缺氧也可通过P 1 3 K 和M A P K 途径将 F h 磷 酸化，增加其稳定性，从而使H I F l a 蛋白表达增加，并与p 亚基形成有活性的异二聚体H I F 一1 ，再与下游靶基因上缺氧 反应原件( H R E ) 结合，调控下游6 0 余种靶基因转录，最终启 动各种生理病理过程H 】。在不同肿瘤组织中进行的研究表 明，H I F l a 不仅在肿瘤的局部和转移灶中高表达，而且与肿 瘤的良恶性、发生进展演进过程、侵袭、转移能力及预后状况 直接有关【5 1 ；此外，在基因治疗方面，K o u k o u r a k i s 等在早期 食管癌中进行的研究发现H I F 一1 a

39、 在早期癌组织中亦有明 显升高，高表达H I F l a 者完全缓解( C R ) 率低，同时这种升 高与癌肿对光动力治疗的敏感性呈正相关，S u n 等【7J 通过反 义H I F 一1 a 的作用完全而持久地消除了直径0 1c m 的肿瘤， 并诱导了N K 细胞依赖的杀瘤效应。业已证明，针对肿瘤多 种信号转导通路的抑瘤剂大多间接抑制了H I F 一1 的作 用i s 。H I F l a 在肿瘤的病理过程中起着“中心枢纽”和“最 后通路”的作用，进一步研究H I F 一1 a 在肿瘤细胞中的表达 及其功能将为其在肿瘤治疗、早期诊断和预后判断的应用奠 定基础。 V E G F 是H I F

40、一1 的下游调控基因，当细胞处于缺氧环 境时，H I F 一1 表达迅速上升，与靶基因如V E G F 基因的启动 子或增强子区域相结合，诱导其表达。V E G F 是目前已知作 用最强的血管形成促进因子，作为旁分泌因子增加微血管通 透性，诱导内皮细胞分裂、增殖、迁移，而促进血管形成【9 】。韩 庆旺等 1 0 j 研究表明V E G F 不仅作为旁分泌因子刺激血管内 皮细胞增殖，同时还作为自分泌因子直接作用于肿瘤细胞自 身的V E G F 受体而促进肿瘤细胞生长。一般认为缺氧是上 调V E G F 表达的主要原因；在此过程中，H I F 一1 发挥了重要 作用，目前认为H I F l 是调节

41、V E G F 转录最重要的核转录 因子之一 1 l 】。H I F 一1 对V E G F 的调控是通过与相应的 D N A 结合，进而激活H I F l a 的C 端转录活性区，激活的 H I F l a 又将转录信号转给V E G F ，从而促进V E G F 的转录 和表达。S t o e l t z i n g 等【1 2 l 证实，H I F 一1 a 可通过参与I G F I 、I G F 一和I G F R 的自分泌环促进肿瘤细胞V E G F 表达和 肿瘤的生长。本研究显示，缺氧培养后，鼻咽癌C N E 一细 胞V E G F 在转录和蛋白水乎都显著升高，这种作用可能是通 过

42、H I F 一1 a 途径介导的。 低氧环境中肿瘤细胞H I F h 的表达上升究竟是m R N A 的变化还是蛋白水平的变化，一直有不同的报道。本研 究结果表明，C N E 一细胞在常氧和低氧环境中H I F _ h 的 m R N A 水平没有变化；常氧下H I F l a 蛋白质表达微弱，而 缺氧环境下其表达显著上升，说明低氧是从蛋白质水平调控 H I F l a 的表达。常氧条件下，V E G F 的m R N A 和蛋白质表 达均处于很低的水平，低氧培养2 4h 后，V E G F 的m R N A 和 蛋白质表达均大幅上升，表明低氧环境促进V E G F 的表达。 目前，针对肿瘤血

43、管生成的治疗方法有不少报道【l 引。尤 其是抑制V E G F 基因表达的研究有不少报道，在抑制肿瘤细 胞的增殖和抗血管生成也有一定的效果 1 4 】。但肿瘤血管生 成是由一系列而非单一血管形成因子来调控，这些研究虽在 不同程度上取得了抑制肿瘤血管形成、抑制肿瘤生长和转移 的效果，但效果均欠理想。因此，探索能阻断多种血管生长因 子作用的靶点显然比以单一或数个血管生长因子为靶点更有 实际治疗意义，而H I F l a 可能是较理想的靶点。本实验通 过应用R N A i 技术对H I F 一1 a 基因的沉默，从而有效抑制了 H I F l a 的表达。当H I F h 基因被抑制后，缺氧激活的

44、V E G F 的m R N A 和蛋白质表达显著下调，低氧能通过H I F h 调控V E G F 的表达，这种调控是转录水平的调节。本研究 结果显示R N A 干扰技术能有效抑制鼻咽癌C N E l I 细胞 H I F 一1 a 的表达，进而下调V E G F 的表达，提示H I F 一1 a 的 R N A 干扰有可能在抗肿瘤血管生成的基因治疗中发挥作用； 从而可为鼻咽癌的治疗提供新靶点和新思路。 参考文 献】 1 J u n g - H y u nP a r k T a e 。Y o uK i m ，H y u n s 0 0 nJ o n g ，e ta 1 G a s t r i

45、 ce p i t h e l i a lr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sp r e v e n tn o r m o x i cd e g r a d a t i o no fh y p o x i a i n d u c i b l ef a c t o r l ai ng a s t r i cc a n c e rc e l l s J C l i n i c a lC a n c e rR e s e a r c h ，2 0 0 3 ，9 ：4 3 3 4 4 0 2 南方五省鼻咽癌防治研究协作组我国南方五省鼻咽癌流行病 学的初步调查研

46、究 J 】肿瘤防治研究，1 9 7 8 ，9 ( 3 ) ：2 4 3 2 3 】H u a n gL E ，A r a n yz ，L i v i n g s t o nD M ，e ta 1 A c t i v a t i o no fh y p o x i a - i n d u c i b l et r a n s c r i p t i o nf a c t o rd e p e n d sp r i m a r i l yu p o nr e d o x - s e n s i - t i v es t a b i l i z a t i o no fi t sa l p h as

47、 u b u n i t J JB i o lC h e m ，1 9 9 6 ，2 7 1 ： 3 2 2 5 3 3 2 2 5 9 4 M a z u r eN M ，B r a h i m i H o r nM C ，B e r t aM A ，e ta 1 H I F 一1 ：m a s t e r a n dc o m m a n d e ro ft h eh y p o x i cw o r l d Ap h a r m a c o l o g i c a la p p r o a c ht o i t sr e g u l a t i o nb ys i R N A s J B

48、 i o c h e mP h a n n a c o l ，2 0 0 4 ，6 8 ：9 7 1 9 8 0 5 S w i n s o nD E 。J o n e s J L ，C o xG ，e ta 1 H y p o x i a - i n d u c i b l ef a c t o r 一1 a l p h ai nn o ns m a l lc e l ll u n gc a n c e r ：R e l a t i o nt og r o w t hf a c t o r ，p r o t e a s ea n da p o p t o s i sp a t h w a y s J I n tJc a n c e r ，2 0 0 4 ，1 1 1 ：4 3 5 0 6 K o u k o u r a k i sM I 。G i a t r o m a n o l a k iA ，S k a r l a t o sJ ，e ta 1 H y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r ( H I F l aa n dH I F 一2 a ) e x p r e s s i o