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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 2 4 7 . 2 -2 0 0 3 猪繁殖和呼吸综合征免疫 过氧化物酶单层试验 P r o t o c o l o f i mm u n o p e r o x i d a s e mo n o l a y e r a s s a y f o r p o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e 2 0 0 3 - 0 5 - 2 8发布 2 0 0 3 - 1 2 - 0 1 实 施 中华人民共和匡 国家 质 量
2、监 督 检 验 检 疫 总 , W t S N/ T 1 2 4 7 . 2 -2 0 0 3 .占 J 曰. 月 吐舌 本标准根据世界动物卫生组织( O I E ) ( 哺乳动物、 禽和蜜蜂 A和 B类疾病诊断试验和疫苗标准手 册 ( 第四版, 2 0 0 0 ) 第三部分 X . 1 2的内容编写。 本标准的附录A、 附录B和附录C为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 苏永生、 孙颖杰、 简中友、 孙延峰、 潘凤城. 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N / T 1 2 4 7 .
3、 2 -2 0 0 3 猪繁殖和呼吸综合征免疫过氧化物酶单层试验 范围 本标准规定了应用免疫过氧化物酶单层试验检测猪繁殖和呼吸综合征抗体的操作方法。 本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的流行病学调查、 诊断、 检疫和疫情监测。 2规范性 引用 文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2分析实验室用水规格和试验方法 缩略
4、语 下列缩略语适用于本标准。 3 . 1 AE C 氨乙基咔哇。 3 . 2 HP RO 辣根过氧化物酶。 3 . 3 I P MA 免疫过氧化物酶单层试验。 3 . 4 P R RS 猪繁殖和呼吸综合征。 4检验检疫 4 . 1原理 免疫过氧化物酶单层试验是将抗原吸附于固相载体上， 加人被检样品形成抗原抗体复合物， 在加人 酶标记的抗抗体， 在底物的参与下而显色， 底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。 本标准的反应原理就是在 9 6 孔细胞培养板上培养接种猪繁殖和呼吸综合征病毒的细胞， 固定后加 人按一定比例稀释的待检血清， 反应结束后， 加人用 H P R O标记的抗猪免疫球蛋白抗体.
5、反应完成后， 加人底物并检测反应结果。 4 . 2采样 采集被检猪血液， 分离血 清， 血清必须新鲜透 明不溶血无污染， 密装于灭菌小瓶内， 4 或 一2 0 0C一3 0 冰箱保存或冷藏条件下立即送检。试验前将被检血清统一编号。 4 . 3 设备和材料 4 . 3 . 1 仪器设备 微量移液器; 保湿 盒; 普通恒温箱及二氧化碳恒温箱; 普通冰箱和低温冰箱; 倒置显微镜; S N/ T 1 2 4 7 . 2 -2 0 0 3 量筒、 烧杯等。 4 . 3 . 2 材料和试剂 - M A R C - 1 4 5 或H S z H细胞由国 家质检总局指定单位提供; -P R R S美洲标准株
6、A T C C VR - 2 3 3 2 或欧洲标准株 L V标准毒由国家质检总局指定单位提供; -P R R S病毒标准阳性血清和标准阴性血清由国家质检总局指定单位提供; - H P R O标记的兔抗猪 抗抗体， 由 国家质检总局指定单位提供， 使用前按说明书规定用血清稀 释液稀释至工作浓度; 洗涤液、 血清稀释液、 乙酸钠缓冲液、 细胞分散液、 P B S 液和A E C溶液( 见附录A ) ; I P MA诊断板的制备( 见附录B , 附录C ) , 4 . 4 免疫过氛化物酶单层试验操作方法 4 . 4 . 1 在空白的9 6 孔板的A和E排各孔加 1 8 0 K L血清稀释液， 其余
7、各孔加 1 2 0 p L血清稀释液。在 A和E排孔内加人被检血清或对照血清2 0 K L ( 为 1 / 1 0稀释) ， 摇动。从 A到D排， 从 E到 H排把血 清依次做四倍稀释， 则四个孔的血清稀释分别为 1 / 1 0 , 1 / 4 0 , 1 / 1 6 。和 1 / 6 4 0 , 4 . 4 . 2 从血清稀释板每孔取 5 0 I L加人已固定的I P MA诊断板相应孔内， 封板并于 3 7 条件下孵 育1h 4 . 4 . 3 弃去板中液体， 用洗涤液洗板三次， 每孔 1 0 0 T L ， 每次1 mi n -3 min ， 最后倒置在吸水纸上轻轻 拍干。 4 . 4 .
8、 4 每孔加人用洗涤液稀释的工作浓度的用 H P R O标记的兔抗猪抗抗体 5 0阿 ， 封板后放在保湿 盒内于3 7 恒温箱中感作 1 h . 4 . 4 . 5 弃去板中液体， 洗涤三次， 方法同4 . 4 . 3 , 4 . 4 . 6 每孔加人 A E C溶液5 0 p L ， 封板闭光于室温( 1 8 0C -2 4 0C) 下感作 3 0 m i n . 4 . 4 . 7 弃去板中A E C溶液， 洗涤一次， 方法同4 . 4 . 3 。再加人乙酸钠缓冲液5 0 I L待检， 4 . 5 结果判定与解释 4 . 5 . 1 判定方法 将 I P MA诊断板置于倒置显微镜下判读。
9、4 . 5 . 2 判定标准 试验血清内如果存在抗体( 包括标准阳性对照血清、 阳性血清) ， 则孔内约有 3 0 0/ a -5 0 %细胞的胞 质被底物染成深红色 阴性试验血清则可见胞质未被染色。血清非特异性反应使整孔染色， 可与阳性对照血清相比较。 血清滴度以5 0 %或 5 0 %以上的孔染色的最高稀释度的倒数表示。血清滴度小于 1 0为阴性， 1 0或 4 0 为弱阳性， 非特异性染色常在此范围内， 滴度大于或等于 1 6 0 为阳性。 S N/ T 1 2 4 7 . 2 -2 0 0 3 附录A ( 规 范性附 录) I P MA试验中试荆的配制 本附录中试验用水须符合 G B
10、6 6 8 2 -1 9 9 2 的要求。 A . 1 洗涤液 0 . 1 5 mo l / L氯化钠、 0 . 5 %吐温- 8 0 ,置4 保存。保存期 3 0 天. A . 2 显色/ 底物溶液 A . 2 . 1 A E C贮存液 称取氨乙基咔畦( 3 - a mi n o-9 - e t h y l - c a r b a z o l e ) 4 m g 溶于二甲基甲酞胺( N, N - d i me t h y - f o r m a mi d e ) 1 mL中， 充分溶解。 A . 2 . 2 乙酸钠缓冲液 乙酸钠( C H3 0 0 0 Na ) 4 . 1 g 二级水加至1
11、 0 0 0 m L 用 1 0 0 %乙酸调整至 p H 5 . 0 0 , A . 2 . 3 A EC溶液( AE C - H 2 OZ ) 乙酸钠缓冲液1 9 m L A E C贮存液1 mL 3 0 %过氧化氢( H , 0 , ) 1 0 g L 充分混合后用 5 p m滤纸过滤后装于褐色玻璃瓶内避光存放， 现用现配。 A . 3 血清稀释液 。 . 5 mo l / L氯化钠、 4 %马血清、 。5 %吐温- 8 0 , p H7 . 2 。现用现配。 A . 4 细胞分散液 胰蛋白酶( 1 ， 2 5 0 ) 0 . 5 g 乙二胺四乙酸二钠( E D T A ) 0 . 2
12、g 抓化钠8 . 0 g 氯化钾。 . 4 9 葡萄 搪1 . 0 g 碳酸氢钠0 . 5 8 g 青霉 素2 X 1 0 I U 链霉素1 0 0 mg 酚红0 . 0 2 g 二级水加至1 0 0 0 mL 用 0 . 2 2 k m滤器过滤除菌分装后一2 0 保存， 保存期一年。 A . 5 细胞营养液 用商品 ME M按说明书配制， 用 0 . 2 2 gy m滤器过滤除菌分装后， 置4 保存。使用前加人小牛血清 3 S N / T 1 2 4 7 . 2 -2 0 0 3 或胎牛血清、 双抗， 使其含 1 0 %小牛血清或胎牛血清、 青霉素 1 0 0 I U / m L , 链霉素
13、 1 0 0 a 盯mL , A . 6 P B S 液( 0 . 0 1 m o l / L P B S , p H 7 . 2 ) 氯化钠( Na CU 8 g 抓化钾( K C D 0 . 2 g 磷酸氢二钠( N a t H P O , ) 1 . 1 5 g 磷酸二氢钾( K H , P 0 , ) 0 . 2 g 二级水加至1 0 0 0 mL 分装后保存于 4 备用， 保存期 3 0天。 S N / T 1 2 4 7 . 2 -2 0 0 3 附录B ( 规范性附录) I P MA诊断板的制备 用细胞分散液消化 MAR C - 1 4 5 或 H 几H细胞， 用细胞营养液把 M
14、A R C - 1 4 5 或 HS , H细胞稀释成 1 0 细胞/ mL的细胞悬液， 分别取细胞悬液 1 0 0 p L加入% 孔细胞培养板的各孔内， 把细胞培养板放在 3 7 -C, 5 %二氧化碳培养箱中培养 1 8 h -2 4 h 。取出细胞培养板， 将含 1 0 5 T C I D ;, / m L的P R R S美洲或 欧洲标准毒株的病毒悬液 5 0 y L接种每孔内， 留最后两孔不加病毒悬液作为对照。把细胞培养板放在 3 7 0C , 5 %二氧化碳培养箱中培养 1 8 h -2 4 h .弃去培养液， 用 P B S液( 1 0 0 f+ L / 孔) 洗一次， 将板在纸巾
15、 上拍干后每孔加一2 0 无水乙醇 1 0 0 p L , 4 0C固定 4 5 mi n .弃去固定液， 在纸巾上拍干， 放置室温下完 全干燥后一?7 0 保存备用。 S N/ T 1 2 4 7 . 2 -2 0 0 3 附录C ( 规范性附录) 猪资殖和呼 吸综合征病毒 T C I D s o 测 定 C . 1 稀释病毒 取洁净无菌的4 8 孔细胞培养板， 于第一孔加 ME M营养液 2 0 0 p L， 其余各孔加2 2 5 p L ; 换吸头， 再 于排头第一孔添加病毒液 5 0 p L ， 将混合液充分混匀。换吸头， 吸取 2 5 p L移于第二孔， 混合。更换吸 头， 再吸取2
16、 5 p L加人第三孔。连续如此操作至第 1 0 列， 作成 1 0 个连续 1 0 倍的稀释液， 使病毒稀释度 依次为 S X1 0 o 、 S X1 0 , 5 X1 0 , 5 X1 0 , 5 X1 0 “ , S X1 0 , 5 X1 0 6 , 5 X1 0 , 5 X1 0 , 5 X1 0 。用微量移液 器吸取每一稀释度的病毒液 5 0 Ia L移人另一块9 6 孔细胞培养板， 每个稀释度的病毒液平行接种四孔。 剩下的各孔加 5 0 p L ME M营养液， 留作细胞对照。 C . 2添加细胞 MA R C - 1 4 5 或 HS T H细胞经细胞分散液分散消化后计数， 用
17、 ME M营养液稀释至2 X1 0 细胞/ mL 的细 胞悬液， 于细胞培养板各 孔内添 加5 0 p L 。 此时， 病毒稀释度依次变为1 0 , 1 0 , 1 0 1 , 1 0 “ , 1 0 , 1 0 1 , 1 0 , 1 0 1 , 1 0 1 , 1 0 0 , C . 3培养 封板后， 放 3 7 C 5 %二氧化碳保湿恒温箱内培养。 C . 4 观察与 T C I D S 。 计算 在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用( C P E ) 。每天观察一次， 并将观察结果记人专用登记表 内。观察天数为直至出现C P E终点， 即看到能够引起病毒增殖的病毒最高稀释度。对照细胞应始终保 持良好形态和特征。 最后 ， 用 Re e d - Mu e n c h法或 Ka r b e r法计算 该病毒培养物 的 TCI Ds o / mL.