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1、S拍 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 2 2 4 -2 0 0 3 鸡败血支原体感染抗体检测方法 快速血清凝集试验 T h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t My c o p l a s m a g a l l i s e p t i c u m i n i n f e c t e d c h i c k e n s -P r o t o c o l o f a r a p i d s e r u m a g g l u t i n a t i o n t e s t 2 0 0 3 -
2、 0 5 - 2 8 发布 2 0 0 3 - 1 2 - 0 1实施 中华人民共和国 国家 质 量 监 督检 验 检 疫 总 局 发 布 S N/ T 1 2 2 4 -2 0 0 3 前言 本标准的附录A是规范性附录， 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 陈书现、 叶奕优、 骆德海。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 S N / T 1 2 2 4 -2 0 0 3 鸡败血支原体感染抗体检测方法 快速血清凝集试验 1 范围 本标准规定了鸡败血支原体( My c o p l a s ma g a l
3、l i s e p t i c u m, MG) 感染快速血清凝集试验的操作方 法。本标准同时也规定了火鸡 MG感染快速血清凝集试验的操作方法。 本标准适用于鸡、 火鸡 MG感染血清抗体的检测。 原理 MG感染鸡或者火鸡后， 感染动物即可产生特异性的免疫球蛋白 M ( I g M) 抗体。I g M与细胞膜抗 原结合的活性较强， 并能对细胞起调理作用。因此， I g M在体外与抗原结合后主要表现为凝集反应。 一般在感染七天后， 受染动物的血清中就可检测到快速血清凝集( R S A) 试验抗体。由于R S A试验具有 操作简便、 快速、 灵敏等优点， 所以它是目前血清学检测禽支原体感染的最常用的
4、方法。 试剂与器材 1 1 . 1 1 . 2 1 . 3 3 . 2 3 . 2 . 1 3 . 2 . 2 3 . 2 . 3 3 . 2 . 4 3 . 2 . 5 3 . 2 . 6 试荆 R S A抗原: 可以从成都药械厂或中国兽药监察所等单位购买， 于 2 0 C -8 保存， 避免冻融。 MG阳性血清: 向R S A抗原提供单位购买。 MG阴性血清: 向R S A抗原提供单位购买。 器材 一次性使用塑料注射器( 规格 1 mL用于小鸡， 或者 2 . 5 mL用于中鸡或成年鸡) 。 灭菌的 1 . 5 mL微量离心管和0 . 5 mL微量离心管。 2 0 0 t, L可调移液器。
5、 2 0 0 K L灭菌的滴头。 干燥灭菌白瓷反应板或者载玻片 7 5 %的酒精棉球。 3乳东几乙 4 操作方法 4 . 1 采血 4 . 1 . 1 用 7 5 %的酒精棉球对欲采血的鸡或者火鸡的一侧翅静脉所在部位的皮肤进行消毒， 然后用 1 m L 注射器( d 、 鸡) 或 2 . 5 m L注射器( 中鸡或成年鸡) 从翅静脉中抽取 0 . 5 mL - - - 1 . 0 mL血液， 置 1 . 5 m L 微量离心管中， 盖上管盖， 于环境温度下尽快带回实验室 4 . 1 . 2 分离血清: 待血清析出后( 若环境温度过低， 可将血液样品置 3 7 培养箱3 0 mi n ， 以便血
6、纤维蛋 白收缩从而使血清析出) ， 将盛有血液样品的微量离心管置微量台式离心机中， 以3 5 0 0 r / mi n离心 1 0 mi n ， 然后用2 0 0 p L微量移液器把血清转移至0 . 5 mL微量离心管中， 置 4 冰箱保存( 但不得超过 7 2 h ) , 4 . 2 快速血清凝集( R S A) 试验 4 . 2 . 1 该试验必须在血清采集后的7 2 h内于室温下进行。 4 . 2 . 2 在干燥灭菌的白瓷反应板上或者载玻片上滴上 2 0 I L待检血清 接着滴加2 0 p L的染色抗原， I S N/ T 1 2 2 4 -2 0 0 3 转动白瓷反应板或者载玻片以使之
7、混合均匀。鸡血清或者火鸡血清在 2 m i n内出现凝集 4 . 2 . 3 用已知的阳性血清和阴性血清作对照试验， 方法与4 . 2 . 2 相同。 4 . 2 . 4 把在2 mi n 内发生凝集反应的血清置 5 6 水浴中加热 3 0 m i n ， 然后用灭菌的P B S ( 见附录A) 将其稀释成 1 : 2 , 1 ， 4和 1 ， 8 ， 并重新进行试验， 方法与4 . 2 . 2 相同。 5结果判断 5 . 1 阳性结果 当血清被稀释成 1: 4 或以上仍发生凝集反应， 则判为阳性。 5 . 2可疑结果 当血清被稀释成 1: 2发生凝集反应， 但 1 : 4稀释不再发生凝集反应
8、时， 则判为可疑。 5 . 3阴性结果 当血清经 5 6 加热处理后不再发生凝集反应， 或者未经 5 6 加热处理的血清也不发生凝集反应， 则判为阴性 。 5 . 4 MG感染阳性禽群 当一个禽群中出现高比例的阳性( 1 0 %或以上) 时， 说明该禽群中存在MG感染， 特别是在经 H 工 试 验( 见附录A) 或者E L I S A试验证实后更加证明该禽群为 MG感染阳性群。 5 . 5 确证试验 为了确证 MG感染， 应在一个月内采血重新进行检测。可疑结果应用关节液支原体( My c o p l a s m a s y n o v i a e , MS ) 抗原进行试验予以证实， 因为 M
9、S 感染有时引起交叉反应。 6替代方法 本试验还可以用卵黄液代替血清进行 即首先用 P B S ( 见附录 A) 将卵黄液稀释成 1， ， 8 ， 其结果与用血清做R S A试验时一致。 S N/ T 1 2 2 4 -2 0 0 3 附录A ( 规范性附录) MG感染微f红细胞凝集抑制( H D试验 A . 1 试荆与器材 A . 1 . 1 稀释液: p H7 . 0 - 7 . 2 磷酸缓冲液( P B S ) 氯化钠( N a C D 1 7 . 0 0 g 磷酸二氢钾( K H , P O , ) 1 . 3 6 g 氢氧 化钠( N a O H ) 0 . 3 0 g 溶于约 8
10、0 mL蒸馏水中， 移人 1 0 0 mL容量瓶中， 定容至刻度。然后转移至试剂瓶中， 高压灭菌 ( 1 2 1 0C , 2 0 mi n ) , 4 0C保存， 使用时作2 0 倍稀释。 A . 1 . 2 抗原: 应该选择生长好而且血凝活性可靠的菌株。该抗原既可以是新鲜的肉汤培养物， 也可以 是浓缩的洗涤过的MG的P B S悬浮液。 A . 1 . 3 新鲜的。 . 5 %红细胞( R B C ) 悬液: 采成年鸡血或火鸡血( 鸡血清用鸡红细胞， 火鸡血清用火鸡红 细胞) ， 用2 0 倍量 P B S洗涤四次， 每次以2 0 0 0 r / mi n 离心5 mi n ， 用P B S
11、配成 0 . 5 0 0 悬液。 A . 1 . 4 标准阳性血清、 阴性血清: 与R S A试验相同。 A . 1 . 5 被检血清; R S A试验呈阳性反应的血清。 A. 1 . 6微量 d型血凝板 : 9 6孔。 A . 1 . 7 5 0 u L单头移液器， 5 0 A L八通道或 1 2 通道移液器及灭菌过的滴头。 A. 2试验步骤 A . 2 . 1 HA滴度测定 A . 2 . 1 . 1 于微量血凝板( AI - AI 2孔、 B I - - B I 2孔、 C I -C 1 2孔、 D I - D I 2 孔) 的每孔中滴加 5 0 t L P B S ， 共四排 A .
12、2 . 1 . 2 吸取 MG抗原滴加于第一列孔， 每孔 5 0 W L ， 共四孔( AI , B I , C I , D 1 ) ， 然后由左至右顺序倍 比稀释至1 1 孔， 再从第 1 1列孔中各吸取 5 0 I L弃之。最后一列不加抗原作对照。 A . 2 . 1 . 3 于 上述各孔中加人0 . 5 %红细 胞悬液5 0 I L e A . 2 . 1 . 4 轻轻摇动微量板， 以使孔内容物完全混合， 于室温下( 1 8 0C - 2 5 0 C ) 放置大约 5 0 mi n ， 根据血 凝图像判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复， 以几何均 值
13、表示结果。 A . 2 . 1 . 5 计算出含 8 个 HA单位、 4 个 HA单位的抗原浓度。按式( A . 1 ) 、 式( A . 2 ) 计算: 8 个 H A单位=HA滴度/ 8 ( 抗原应稀释的倍数) (A . 1 ) 4 个 HA单位=HA滴度/ 4 ( 抗原应稀释的倍数) ( A . 2) A . 2 . 2 HI 试验 A . 2 . 2 . 1 每一被检血清需要一列八孔， 向每一列的第一孔加人 5 0 p L P B S A . 2 . 2 . 2 向每一列的第二孔加人 5 0夙. 8 个 HA单位的抗原。 A . 2 . 2 . 3 向每一列的第三孔至第八孔各加人 5
14、0 I L 4 个 HA单位的抗原。 A . 2 . 2 . 4 将5 0 L已经 制备好的1 : 5 稀释的被检血 清加人到第一孔， 混匀。转移5 0 P L 到第二孔， 依 次类推。从最后一孔中移去 5 0 p L ， 弃之。第一孔为血清对照孔。 A . 2 . 2 . 5 每次试验都应使用标准阳胜血清和阴性血清作对照。 A . 2 . 2 . 6 抗原对照需要六孔。向第二孔至第六孔各加人5 0 I L P B S ， 向第一孔和第二孔各加人5 0 t L S N/ T 1 2 2 4 -2 0 0 3 8 个 HA单位的抗原。混合第二孔中的内容物， 并转移 5 0 p L到第三孔， 混合
15、， 重复操作至第六孔。最 后从第六孔中移去5 0 y L ， 弃之。 A . 2 . 2 . 7 R B C对照需要两孔。向每一孔中加人 5 0 y L P B S . A . 2 . 2 . 8 向 上述每一孔中 加人5 0 y L 0 . 5 % R B C s 悬液( 鸡血清用鸡R B C s ， 火鸡血清用火鸡R B C s ) e A . 2 . 2 . 9 轻轻摇动微量板， 以使孔内容物混合。于室温下放置大约5 0 mi n 后进行判读， 或者当抗原滴 度判读为4个 HA单位时进行判读。 A . 2 . 2 . 1 0 判读结果时， 应将微量板倾斜， 只有那些孔中的R B C s
16、流动与仅含 R B C s 和稀释液( P B S ) 的 孔( 即R B C对照孔) 以相同速度流动的， 才被认为是血凝被抑制。血清对照孔应显示一清晰的 R B C s 扣 状物( a c l e a r b u t t o n ) ， 而其他对照孔应出现预期的反应。H I 滴度为显示 HA完全抑制的血清的最高稀 释倍 数。 A . 2 . 2 . 1 、 出现非特异性 HA活性的血清， 必须进行吸附处理， 以除去所有的非特异性血凝素， 使没有 HA抗原的对照孔出现清晰的 R B C s 扣状物。吸附处理: 1 mL血清， 滴加 6 滴8 滴洗涤过的鸡或者火 鸡R B C s ， 于3 7 下温育 1 0 mi n 后离心除去细胞， 对上清液进行 HA活性测定。