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1、 + l 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 4 4 4 - 2 0 0 4 大鼠流行性出血热间接免疫荧光试验 I n d i r e c t i m mu n o f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e f o r e p i d e m i c h e mo r r h a g i c f e v e r o f r a t s 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布2 0 0 4 - 1 2 - 0 1实施 中华人民共和匡 国 家 质量 监 督检 验 检 疫 总 局 S N/ T 1 4 4
2、 4 -2 0 0 4 目 9吕 本标准的附录 A是规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 胡永强、 李树清、 王巧全、 徐红。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 4 4 4 -2 0 0 4 大鼠流行性出血热间接免疫荧光试验 1范围 本标准规定了间接免疫荧光试验检测大鼠流行性出血热抗体的方法 本标准适用于大鼠流行性出血热的检疫、 流行病学调查和免疫监测。 2 材料 2 . 1 试剂 2 . 1 . 1 磷酸氢二钠( N a HP 0 , 1 2 H 2 0 ) , 2
3、 . 1 . 2 磷酸二氢钾( KH 2 P 0 4 ) . 2 . 1 . 3 氯化钠( N a C l ) 。 2 . 1 . 4 伊文斯蓝。 2 . 1 . 5甘油。 2 . 1 . 6 0 . 0 1 m o t / L p H 7 . 4 磷酸缓冲液、 0 . 0 1 % -0 . 0 2 0 0 伊文斯蓝液和9 0 % 甘油缓冲盐水的配制见附 录 A。 注; 所有化学试剂均为分析纯 2 . 2 仪器设备 2 . 2 . 1 单通道可调移液器及加样头。 2 . 2 . 2 染色缸。 2 . 2 . 3 保湿盒。 2 . 2 . 4 盖玻片。 2 . 2 . 5 恒温箱。 2 . 2
4、. 6 低温冰箱。 2 . 2 . 7 酸度计 2 . 2 . 8 荧光显微镜。 2 . 3 标准试剂 2 . 3 . 1 多孔流行性出血热病毒抗原片( -2 0 保存) 。 2 . 3 . 2 流行性出血热阳性血清。 2 . 3 . 3 流行性出血热阴性血清。 2 . 3 . 4 异硫氰酸荧光黄( F I T C ) 标记的兔抗大鼠坛G荧光抗体。 3采样 被检大鼠 无菌采血0 . 5 m L -1 . 0 m L ， 待血液凝固 后， 以2 0 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n ， 分离血清。 血清 经5 6 C 3 0 mi n 灭活后， 置一2 0 保存备用。 4操作方
5、法 4 . 1 准备抗原片 从低温冰箱中取出流行性出血热病毒细胞抗原片， 冷风吹干。 S N/ T 1 4 4 4 -2 0 0 4 4 . 2 稀释血清 将被检、 阳 性及阴性血清1， 2 0稀释。分别取。1 m L加人0 . 0 l m o l / L p H 7 . 4 磷酸缓冲液 1 . 9 m工 一 ， 混匀。 4 . 3加样 抗原片编号后， 取 1: 2 0 稀释的被检血清 1 0 p L加人病毒抗原片孔内， 每张抗原片均设阴性血清、 阳性血清对照及标本自发荧光对照。阴性血清、 阳性血清也与被检血清同样取 1 0 p L加人病毒抗原片 孔内， 标本自 发荧光对照 在对照孔内 加人。
6、 . 0 1 m o l / L p H 7 . 4 磷酸缓冲 液1 0 p L a 4 . 4反应 抗原片置湿盒内， 3 7 0C恒温孵育3 0 m i n , 4 . 5 洗玻片 取出抗原片， 用0 . 0 1 m o l / I . p H7 . 4磷酸缓冲液( 中间更换一次) 振荡洗涤三次， 每次 5 min 。再用 蒸馏水漂洗一次， 冷风吹干。 4 . 6 稀释荧光抗体 用 0 . 0 1 %-0 . 0 2 %伊文斯蓝液稀释F I T C标记的兔抗大鼠坛G荧光抗体至工作浓度。 4 . 7 加荧光抗体 抗原片中每 孔加人1 0 川 工作浓度的 荧光抗体。 48反应 按 4 . 4 操
7、作。 4 . 9 洗玻片 按 4 . 5 操作。 4 . 1 0观察结果 在抗原片上滴加 9 0 %甘油缓冲盐水， 封片置荧光显微镜下观察结果。 5 结果判定 5 . 1 判定方法 在荧光显微镜下观察， 正常组织细胞被染成红色。细胞内病毒特异性免疫荧光为黄绿色颗粒， 分布 在感染细胞的胞浆内。出血热病毒的特异性荧光一般是散在的针尖大小的细颗粒， 但亦可为粗颗粒、 团 块， 甚至片状荧光。 5 . 2 对照 5 . 2 . 1 自发荧光对照: 无荧光， 细胞被染成红色。 5 . 2 . 2 阴性血清对照: 无荧光， 细胞被染成红色. 5 . 2 . 3 阳性血清对照: 细胞内病毒特异性免疫荧光闪
8、亮， 呈针尖状或片状。 5 . 3 检测样本判定 对照系统成立方可进行判定。被检样本细胞浆内无荧光， 细胞被染成红色判为阴性反应; 被检样本 细胞浆内出现明显黄绿色荧光颗粒， 判为阳性反应。 S N/ T 1 4 4 4 -2 0 0 4 附录A ( 规范性附录) 试荆配制 A . 1 1 / 1 5 m o l / L磷酸氢二钠的配制 称 N a , HP O , 1 2 H2 0 2 3 . 8 7 6 g ， 加蒸馏水溶解后定容至1 0 0 0 mL , A . 2 1 / 1 5 m o l / L磷酸二氢钾的配制 称 K H, P O , 9 . 0 7 4 g ， 加蒸馏水溶解后定
9、容至1 0 0 0 m L , A. 3生理盐水 的配制 称8 . 5 g N a C l 加蒸馏水溶解后， 定容至1 0 0 0 m L , A . 4 0 . 0 1 m o l / L p H 7 . 4 磷酸缓冲液的配制 1 / 1 5 m o l / L磷酸氢二钠 8 1 ml 1 / 1 5 m o l / L磷酸二氢钾 1 9 mL 生理盐水5 6 6 mL 用酸度计测定 p H， 并用 1 / 1 5 m o l / L磷酸盐液校正至p H7 . 4 e A . 5 0 . 0 1 m o l / L p H 7 . 2 磷酸缓冲液的 配制 1 / 1 5 m o l / L磷
10、酸氢二钠 7 3 mL 1 / 1 5 m o l / L磷酸二氢钾 2 7 mL 生理盐水5 6 6 mL 用酸 度计测定p H ， 并用1 / 1 5 m o l / L 磷酸盐 液校正至p H 7 . 2 , 1 2 1 高压灭菌1 5 m i n 备用。 A . 6 0 . 0 1 %-0 . 0 2 %伊文斯蓝液的配制 称0 . 1 g - - 0 . 2 g 伊文斯蓝溶解于1 0 0 mL 0 . 0 1 mo l/ L p H7 . 2 P B S中， 室温保存， 使用时再用同样 P B S作 1 0 倍稀释。 A . 7 9 0 %甘油缓冲盐水的配制 取纯甘油九份， 加0 . 0 1 m o l / L p H7 . 2 磷酸缓冲液一份， 混匀。