SV40LT抗原基因肝细胞——理想的肝细胞来源.pdf

《SV40LT抗原基因肝细胞——理想的肝细胞来源.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SV40LT抗原基因肝细胞——理想的肝细胞来源.pdf（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第1 5 卷第7 期 2 0 0 7 年7 月 中国医学工程 C h i n a M e d i c a l E n g i n e e ri n g V o L 1 5 N o . 7 吐 2 0 0 7 文章编号:1 6 7 2 - 2 0 1 9 ( 2 0 0 7 ) 0 7 - 0 5 6 7 - 0 3 。 论著 5 瑞L T 抗原基因肝细胞 理想的肝细胞来源 周少波， 刘会春， 李宗 狂， 周 磊， 鲁贻民 ( 蚌 埠医 学院附属医 院 肝胆外 科， 安 徽 蚌 埠 2 3 3 0 0 4 ) 摘要: 目 的 制备并初步评佑一种理想的肝细胞来源 -S V , L T 抗原基因 永

2、生化肝细胞。方法 将S V 4 0 L T 杭原基因 在逆转录 病毒介导下转入原代培养的大鼠 肝细胞， 获得能 在体外 增殖的 肝细 胞。 通过绘制生长曲线了 解转染 肝细胞的 体外生长 特性， 细胞冻存复苏 试验评佑转染 肝细 胞的冻 存价值并与原代肝细胞和大鼠肝癌细 胞C B R H 7 9 1 9 比 较。 结果 S V 话T 杭原基因 转 入原代 培养的 大鼠 肝细 胞能 在体外 增殖a S V 40 L T 抗原基因 转染 肝细胞比 原代肝细 胞生长速度快( P 0 .0 5 ) 。复苏 后冻存 的S V 0L T 抗原转染的肝细胞的细胞活率为( 7 4 1 4 ) % ， 原代肝细

3、 胞的细 胞活率为( 7 2 1 6 ) % 。 两者差异无显著 性( P 0 .0 5 ) 。结论 肝细 胞经S V 40 L T抗原基因 转染 后获得永生 化特性， 冻 存复苏 后获得满意的细胞活率， 是 一种理想的肝细胞来源。 关键词: 猿病毒4 0 大T杭原基因; 肝细胞冻存; 生长曲线 中图分类号: R - 3 3 2文献标识码:A a n t i g e n g e n e h e p a t o c y t e - a n i d e a l h e p a t o c y t e Z H O U S h a o - b o , L I U H u i - e h u n , I

4、I Z o n g - k u a n g , Z H O U L e i , L U Y i - m i n (D e p a r t m e n t of H e p a t o b i l i a r y S u r g e r y , A f f i l ia t e d H o s p it a l of B a n g b u M e d i c a l C o ll e g e , B a n g b u , A n h u i 2 3 3 0 0 4 , P .R . C h i n a ) A b s t r a c t : ( O 场 e c t i v e T o p r

5、e p a r e a n d p r i m a r i l y e v a l u a te a h e p a to c y t e -S V , o L T a n t i g e n g e n e i m m o r t a l iz e d h e p - a to c y te . M e t h o d s S V , pL T a n t i g e n g e n e w a s t r a n s f e c t e d i n to t h e p r im a r il y c u l t u r e d r a t h e p a t o c y te t o g

6、 e t i n v i t r o ， i m m o r ta l iz e d h e p a t o c y t e . W e a s s e s s e d i ts i n v i tr o g r o w th p r o p e rt ie s b y d r a w i n g g r o w th c u r v e , a n d e v a l u a t e d t h e c ry - o p r e s e r v a t i o n m e th o d a n d c o m p a r e d w i th p r i m a r i l y c u l

7、t u r e d h e p a t o c y te a n d li v e r t u m o r c e l l l i n e C B R H 7 9 1 9 . ( R e - s a l t s P r i m a r il y c u l t u r e d r a t h e p a to c y te c o u l d p r o l if e r a t e i n v i t r o a ft e r S V , o L T a n t i g e n g e n e t r a n s f e c t io n . S V ,e ,L T a n t i- g e

8、 n g e n e t r a n s f e c t e d h e p a t o c y t e g r e w m u c h m o r e f a s te r th a n t h e p r i m a r i l y c u l tu re d h e p a to c y t e in v i t ro ( P 0 . 0 5 ) . ( 7 4 1 4 ) % o f t h e c ry o p r e s e r v e d S V 4 o L T a n t i g e n g e n e i m m o r t a l i z e d h e p a t o c

9、 y t e c o u l d b e re c o v e re d , s i m il a r ( P 0 .0 5 ) to t h a t fr o m re c o v e re d p r i m a r il y c u lt u r e d h e p a to c y t e 似均% ， C o n c l u s i o n S V , oL T a n t i g e n g e n e tr a n s f e c t e d h e p a t o c y te i s i n v it ro i m m o r ta li z e d . T h e re c

10、o v e ry r a te o f t h e c ry o p re s e r v e d i m m o r ta li z e d h e p - a t o c y t e w a s g o o d . T h e s e c h a r a c te rs e n a b l e S V , o L T a n t ig e n g e n e tr a n s f e c t e d h e p a t o c y t e a n i d e a l s a u c e o f h e p a t o c y t e . K e y w o r d s : S V , DL

11、 T a n t i g e n g e n e ; h e p a t o c y t e c ry o p re s e r v a t io n ; g r o w t h c u r v e 肝脏细胞广泛应用于肝脏毒理学等基础研究， 肝细胞移植近年 来也日 益成为治 疗急性肝衰及肝脏 代谢性疾病的 有利武器。 然而 肝细胞却因 为增殖能 力差的 特点， 极大地限 制了 其临 床应用。 本研究将 S V 4 0L T 抗原基因 转人肝细胞使之能在体外传代、 增 殖， 成为“ 永生化” 肝细胞。 并且冻存复苏后能获得 满意的活细胞率， 可以作为一种理想的肝细胞来源。 1 . 1 材料与方法

12、 材料 1 . 1 . 1 实验动物选用雄性W is ta r 大鼠，体重 2 5 0 一 3 0 0 g 。 主 要试剂及工具酶: 限制性内 切酶 E c o R I , L ip o f e c ta m in ( G I B C O B R L 公司， 美国) 、 胶原 酶I V 、 胰酶、 Q I A G E N P l a s m i d M i n i P u ri f i c a t io n K i t s ( Q I A G E N 公司， 德国) 。 C B R H 7 9 1 9 大鼠 肝癌细胞 收稿日 期: 2 0 0 7 - 0 4 - 2 0 5 6 7 万方数据

13、中国医学工程第 1 5 卷 系， 逆转录病毒载体， 内含3 . 5 k b 的S V 4 0 大T 抗原 基因( 病毒滴度1 x 1 0 6 C F U / m L ) ， 由 湘雅医学院劳 学军博士惠赠。 1 .2 方法 1 .2 . 1 原代肝细 胞培养 参照1 9 7 6 年改良S E G L E N 澎” ， 有少许修改， 具体如下: 大鼠 麻醉固 定后开腹， 门 静脉置 人2 0 号静脉 插管， 下腔静脉肝 下段置 人1 8 号 管， 结扎肝后上段下腔静脉。 用3 7 含有0 .0 9 %的 E D T A的D - H a n k s 溶液以 每m i n 3 0 m l , 速度持

14、续灌 洗， 1 0 m in 后改用3 7 9 0 ， 按照S e g l e n 方法配制的 胶 原酶缓冲液继续灌注3 0 m in 后， 切下肝脏并剔除结 缔组织， 将肝脏剪碎成大小约 I m mx I m m的组织 块， 于3 7 胶原酶缓冲液继续消化2 0 m i n ， 过2 0 0 目 钥网。用含 1 0 % F C S 的D M E M培养基洗涤， 于 4 9 C , 5 0 g 离心3 m in ， 得到 分离的 肝细 胞悬液。 根 据 肝实质细胞及K u ff e r 细胞和I t o 细胞的 不同 密度， 将 梯度分离液P e r c o ll 配成终比 重为1 .0 9

15、6 g / m L 后， 取 3 0 m L 加人离心管中， 再加人2 0 m l , 细胞悬液， 8 0 0 r m p , 4 C , 1 5 m i n 后， 在中间 层有肝实质细 胞富 集， 用毛细吸管收集肝实质细胞， 加8 m L 培养基混悬后 移人5 0 m L 培养瓶培养。取少许样品用0 .4 %台盼 蓝溶液染色后进行肝细胞计数， 并计算肝细 胞活率。 1 . 2 .2 肝细胞的基因转染分离的肝细胞悬液 8 m L中 加人激素限定液 ( 终浓度为 1 0 -8 M胰岛素、 1 0 M地塞米松、青霉素 1 0 0 u / M L 、链霉素 1 0 0 u / m L 、 卡那霉素1

16、 0 0 u / M L ) , 3 7 9 0 , 5 % 二氧 化碳培养 箱中孵育6 h 后，改换终浓度为表皮生长因子 1 n g / m L 、 转换蛋白5 w g / m L 的1 0 % F C S 的D M E M培 养基继续培养， 并根据细胞生长情况随时换液。 原 代肝细胞培养4 8 h 后， 加人含S V O LL T 抗原 基因的 逆 转录病毒悬液 1 m L( 滴度为 I x 1 0 6 C F U / m L ) , 3 7 OC , 5 %二氧化碳条件下培养， 2 周后可见阳性细 胞克隆， 待克隆长到一定大小， 吸弃培养基， P B S 缓 冲液洗涤1 次， 在倒置显微

17、镜下用吸有5 0 w L 0 .2 5 % 胰蛋白 酶的 移液器对准克隆轻轻吹吸几次， 将细胞转人 新的 培 养瓶中， 进行 传代扩大培 养。 1 . 2 .3 肝细胞的冻存及复苏 取生长良 好的S V 4 0 L T 抗原基因转染肝细胞， 在冻存前2 4 h 更换培养液， 然 后 用0 .0 2 5 % 的 胰 酶 消 化 后 制 成 细 胞 悬 液 ， 计 数 军 细胞密度达到5 x 1 0 6 个/ m L ， 离心去上清， 将0 .9 M L 培养基和0 . 1 m L D M S O 加人冻存管， 贴标签， 置 4 冰箱4 - 5 h 后， 移至一 2 0 冰箱2 h ， 再悬于液

18、氮罐颈口1 h ， 最 后浸人液氮中。 复苏时 从液氮中 取 出 冻存管迅速于3 7 水浴中， 管中 液体接近 全融时 移至冰 上。 于 超净工作台 中 将管中 细 胞 悬液 逐滴 加 人3 7 培养基中， 离心去上清后重悬细胞， 取部分 细胞计数存活率。 1 . 2 .4 转染肝细胞的生长曲线用 1 x 1 0 5 个/ m L C B R H 7 9 1 9 细胞、 转染后肝细 胞及原代肝细 胞悬液 各I m L ， 放人2 4 孔培养板中， 每种细胞放3 0 孔， 每 天取3 孔计数 ( 未计数的细 胞作半量换液处理) 求 平均值， 结 果标记于坐标纸上共l o d ， 将各点连 成曲

19、线， 描绘出生长曲线。 1 . 5 统计学方法 所得实验数据用均数土 标准差土 8 ) 表 示， 取 检验显著性水准 。 = 0 .0 5 ， 用S P S S 统计软件进行统 计学分析. 用多组样本两两比较的L S D法检验。 2 实验结果 2 . 1 肝细胞的分离与纯化 肝细胞经S E G L E N法分离后，除肝实质细胞 外， 仍有少量非实质细胞， 其中以 红细胞为主。 经 P e r c o ll 梯度液离心纯化后， 可见肝实质细胞位于离 心管中部。镜下见红细胞及肝非实质细胞已排除。 、 2 .2 转染肝细胞的培养 S V 4 0 L T 基因 转染肝细胞2 周后， 挑选阳 性克隆，

20、进行扩大培养; 将转染肝细胞以5 x 1 0 5 接种于5 0 m L 培养瓶中， 总体积8 m L ， 视培养情况保存细胞或 进行下一步实验。经传代培养的 肝细胞， 贴壁生长 良 好， 细胞有伪足伸出， 勃附于培养瓶底。 2 .3 冻存肝细胞的复苏 冻存肝细胞复苏后用0 .4 %台盼蓝溶液染色 后 进行肝细胞计数， S V 40 L T 抗原转染的肝细胞的细 胞 活率为 ( 7 4 1 4 ) %， 原代肝细胞的细胞活率为 ( 7 2 1 6 ) % 。两者差别无显著性( P 0 . 0 5 ) 。 2 . 4 生长曲 线 大鼠 肝细 胞体 外原代培养较困 难， 在加人各种 促生长因 子的

21、情况下， 肝细胞很难贴壁生长， 而且不 传代生长。 培养至1 0 d 左右， 肝细胞开始大片死亡， 2 周左右即 死亡殆尽。 1 0 d 平均细胞数为4 .加x I O s a 大鼠 肝癌细胞C B R H 7 9 1 9 ， 贴壁生长迅速， 细胞增殖 极快， 在培养基足够的情况下， 可以不停顿的增殖。 1 0 d 平均细胞数为1 .0 8 x 1 0 7 , S V , oL T 抗原基因 转 染 肝细胞比 原代肝细 胞生长速度 快， 但又不象肿瘤细 胞那 样生 长 迅速。 1 0 d 平均 细 胞 数为3 .0 x 1 0 6 。 通 过 生 长曲 线观 察， 可以 看到S V 4 0 L

22、 T 抗原基因 转染肝细 5 6 8 万方数据 第7 期 周少波， 等: S V O L T 抗原基因肝细胞理想的肝细胞来源 胞与 正常肝细胞相比， 生长曲线差异有显著性( P 0 .0 5 ) 。 统计结 果如附 表。 附表 培养1 0 d 后3 种细胞的平均细胞数 细胞类型M E A N S E C B R H 7 9 1 9 细胞 原代肝细胞 转染肝细胞 1 . 0 8 x 1 0 4 . 2 8 x I 护 3 . 0 3 x I 护 1 . 2 7 x H r 1 . 1 7 x 1 0 2 . 1 2 x 1 护 3 讨论 肝细胞移植可替代受损的肝脏功能。降低急性 肝脏衰竭实验动物

23、的死亡率。 并可用于治疗肝脏先 天性代谢疾病冈 。但肝细胞的来源方面受到很多制 约， 如供肝不足; 肝细胞在体外只能进行短期培养， 不能传代增殖。 怎样才能找到一种最理想的方式来 解决这一间题呢。世界各国的学者都在积极探索， 目 前较为成功的就是将特定的基因转人肝细胞内， 使之在不丧失自 身功能的前提下还能够在体外进行 不断的传代、 增殖。 使之成为所谓“ 永生化肝细胞” 。 ，习 0 文献报道S V I L T 抗原基因 可以 使人类气管上 皮细胞、 成纤维细胞获得增殖和永生化， 转染后细胞 体外生长快， 且对血清和激素的需求度大大降低15 1a 也有不少将S V 4 0 1 A . 抗原基

24、因转人肝细胞使之成为 “ 条件永生化” 问 的肝细胞的报道。所谓“ 条件永生 化” 即对温度依赖性强， 在3 3 左右可以长期生长、 增殖。 S V J .T 抗原基因 使细胞增殖和 永生化的 机制 尚 不完全清楚。据认为其可能的机制是: 作为一种 早期蛋白 结合到 病毒复 制的 起始位点， 启动病毒的 D N A复制及晚期基因的表达外， 还可以激活某些细 胞基因的表达并启动宿主D N A的合成; 可以与细胞 内抑癌基因产物P 5 3 和R B 基因产物形成复合物。 阻断后两者的生物活性叭具有A T P 酶和激酶活性， 可与某些蛋白紧密结合造成细胞内 蛋白的磷酸化; 与特异性的 抑癌基因S E

25、 N 6 和端粒酶有相互作用(s . 91。 另据文献报道: S V 泌T 抗原基因 使增殖和 永生化 的细胞在转染后保留 或部分保留 其分化功能， 如上 皮细胞保留了 分泌细胞外基质的能力网 、 肾上皮细 胞具有离子转运功能阴 ， 肝细胞具有代谢胆红素及 分泌白 蛋白 功能(12 .131 。 所以S V 砂 ,T 抗原基因转染肝 细胞可以得到体外具有强增殖性的工程细胞， 同时 该细胞株拥有 肝脏的大 部分功能。 使该细 胞成为肝 细胞移植的理想供体细胞。 将目 的基因转到肝细胞内 常见的 方法有两种， 即用病毒类或非病毒类载体。 逆转录病毒为R N A 病毒， 具有整合到肝细胞的 基因 组

26、的能力， 其重组病 毒完全不具备复制能力， 最大可插人8 k b 基因片 段， 产生稳定、 高效地表达， 安全性强和不易引 起免 疫炎性反应U 1。 但是逆转录病毒载体转染需要靶细 胞处于分裂增殖状态， 而原代大鼠 肝细胞体外增殖 能力有限， 使逆转录 病毒载体转染效率低下。 近年 来人们采用生长因子来刺激肝细胞增殖， 取得了 较 好效梁1s a 6 1。 应用含S V .,O .T 抗原基因的 逆转录病毒 载体， 转染培养在表皮生长因 子刺激下的原代肝细 胞， 将S V , O L T ， 抗原基因整合到肝细胞的基因组中 去， 使其获得增殖能力。 本研究对转染的细胞进行细胞生物学特性的检 测

27、描绘生长曲 线， 转染的 肝细胞生长特点与原 代肝细胞相比， 生长速度较快， 平均细胞数也较多， 差异有显著性( P 0 .0 5 ) ， 结果表明转染肝细胞在 体外培养有较快的 生长速度。 从生长曲线上看， 原 代肝细胞在体外增殖困 难， 转染肝细胞生长速度快 于原代肝细胞， 寿命延长， 能较快地增殖。肿瘤细胞 在培养基充足的情况下， 能快速不断增殖。细胞经 历冻存复苏过程不可避免的会造成一些细胞死亡， 尤其像肝细胞这样结构复杂、 分化能力差的细胞。 肝细胞较理想的 复苏活率为7 0 % 左右。 本研究制备 的 转基因 肝细胞可获得7 0 % 以 上的冻存复苏活率。 本研究使用改良的S E

28、G L E N法分离大鼠肝细 胞， P e r c o ll 分离液密度梯度离心纯化， 可获得高度纯 化的1 2 x 1 0 8 个肝细胞/ 鼠。S V , 0 L T 抗原基因经 逆转录病毒载体介导， 可成功转人大鼠 肝细胞， 使转 染肝细 胞获得体外增殖能 力。 转染肝细 胞冻存复苏 后可获得较高的细胞活率。 可以 作为理想的肝细胞 来源。 参考文献: 1 S E G L E N , P . P r e a r a t io n o f I s o l a t e d R a t l i v e r C d KM . 5 0 - 5 7 , 玩 P r e s c o t t , D M

29、: M e t h o d i n c e ll b io l o g y , V ol u m e X I I I , A c a d e m ic P r e s s , 1 9 7 & N e w Y o r k . 2 M U L L I N G A N K C . T h e b a s ic s c i e n ce o f g e n e t h e r p y J . S c ie n c e , 1 9 9 3 , 6 0 : 9 2 6 - 9 3 2 . 3 I S O M H C , W O O D W O R T H C D , M E N G Y , e t a l

30、 . I n t r o d u c ti o n of 阮 m e o n c o g e n e . T r a n s f o r m s a s i 而a n v i ru s 4 0 - i m u w r t a l i z e d h e p a t o c y t e ce l l li n e w i t h o u t】加 .o f e x p r e s s i o n试a l b u m in a n d o t h e r l iv e r s p e c i fi c S e n e s J I C a n ce r R e s , 1 9 9 2 , 5 4 2

31、( 4 Y 9 4 0 - 9 4 8 . ( 下转第5 7 3 页) 5 6 9 万方数据 第 7 期张 涛， 等: 血管内 皮生 长因子在大肠癌组织中的 表达及其临床意义 型中， 可以明显降 低V E G F 的 表达和 微血管密度， 显 著抑制 肿瘤生长， 抗V E G F 的中和 性 单抗具有广谱 的抗肿瘤作用， 对移植于裸鼠的 人体癌瘤有显著疗 效。 应用V E G F 单克隆抗体治疗甲 状腺癌发现， V E G F 单抗治疗6 周后， 治疗组裸鼠 体内 肿瘤的体 积明显小于对照组， 而治疗组裸鼠的体重明显高于 对照组ft气目 前， 由 于血管生成对肿瘤组织生长的 重 要性以 及当前

32、所取得的 显著进展， 因 此以V E G F 为 靶点的抗肿瘤治疗将具有广阔的前景。 参考文献: ( 1 J O N E S A , H A R R I S A L . N e w d e v e l o p m e n ts i n a n g ia g e n e s i s : a m a j o r m e c h a n i s m f o r t u m o r g r o w t h a n d t a r g e t f o r t h e r a p y J . C a n ce r J S c i A m , 1 9 9 8 , 州) : 2 0 9 - 2 1 7 . (

33、 2 J O R E I L L Y M S , P I R I E - S H E P H E R D S , L A N EW S , e t a l . A n - 血啼o g e n ie a c t i v i t y成奴 c l e a v e d c o n fo r m a t io n成奴 s , r p u t a n t i th m m b in f刀 . S c ie n ce , 1 9 卯， 2 8 5 ( 5 4 3 5 ) : 1 9 2 6 - 1 9 2 8 . 【 习 F E R R A R A N . E x p r e s s i o n o f V

34、 E G F in c a r c i n o m a毋N a t u r e , 1 9 9 6 , 3 8 0 ( 6 5 7 3 ) : 4 3 9 - 4 4 2 . 间 N O R J E , C H R t S t t: N S E N J , M O O N E Y D J , et a l . V a s c u l a r e n - . d o t h e li a l g ro w th f a c to r ( V E G F ) - m e d i a te d a n g i o g e n e s i s i s a s s a c i s t- a d w i

35、t h a n h n o c e d e n d o t h e l i a l cell s u r v i v a l a n d i n d u c t i o n o f B c l - 2 e x p r e s s io n 田. A m J P a t h o l , 1 9 9 9 , 1 5 4 ( 2 ) : 3 7 5 - 3 8 4 . 5 P A P A P E T R O P O U L O S A , F U L T O N众 M A H B O U B I K , e t a l . A n g i o p i o e t i n - 1 i n h i b

36、i t s e n d o th e l i a l c e ll J l J B i d C h e m 2 0 0 o , 2 7 5 ( 1 3 9 1 0 2 - 9 1 0 5 . 6 K R I E G M A H O T K A C K R I E G T . E x p r e s s i o n成d i ff e r e n t s u r v i v i n v a r i a n ts玩g a s t r i c。 . 犯 切 。 皿 丝 . : f i rs t d t I“协盆ro l e试 s u r v i v i n - 2 B i n t u m o u r

37、p ro g r e s s i o n 切 . B r J C a n ce r , 2 0 0 2 , 8 6 ( 5 ) : 7 3 7 - 7 4 3 . 冈 A S A N U M A K , T S U J I N , E N D O H T , e t a l . S u r v i v i n e n h a n c e s 细 l ig a n d e x p r e s s i o n血 即- r e g u l a t io n试 s p e c 访 c i 妙P ro t e 加 I - m e d i a t e d g e n e t r a n s c r i p

38、 t i o n i n c o l o n c a n c e r c e l l s 仍.J 1 m - m u n o l , 2 0 0 4 , 1 7 2 问: 3 9 2 2 - 3 9 2 9 . 8 j K A W A S A K I 玫 A L T I E R I D C , 功 C D , e t a l . I n h i b i ti o n扭 户 岑 卜 t o s is场 s u r v iv in g p r e d ic t s s h o rt e r s ur v i v a l浏， i n c o lo r e e t 8 l c a n o e 叨. C

39、 a n ce r R e s , 1 9 9 8 , 5 8 (2 2 ) : 5 0 7 1 - 5 5 0 7 . 9 j S A R E L A A I , S C O T T N , R A M S D A L E J , e t a l . I m r m t n o h i s to - c h e m i 国 d e t e c t i o n 成阮 a n ti - s p o p to s i s p ro te i n , s t r v i v in , p r e d 恤 s u r v i v a l a ft e r c u r a t i v e r e s e

40、 c t i o n试 s t a g enc o 1 c r e c 囚 c a r c i n o m a s 田. A n n S u r g O n ce l , 2 0 0 1 , 8 ( 4 ) : 3 0 5 - 3 1 0 . 1 0 1 B R E D O W S , L E W I N M , H O F M A N N B , e t a l. I m a g i n g成t u - n e o v a s c u l a t u r e 场 ta r g e t in g 奴 T G F be ta b i n d i n g r e c e p to r e n d

41、o g l in 田 . E u r J C a n c e r , 2 0 0 0 , 3 6 ( 5 . 6 7 5 - 6 8 1 . 【 川 C O S I “E L L O氏 U C , D U F F S , e t a l. P e r f u s i o n o f 9 9 T c m - l a - b e l e d C D 1 0 5 M o b i n t o k id n e y s f r o m p a t i e n t s w i th r e n a l e a ro i - 二s u g g e s t s t h a t C D I 仍 i s a p

42、r o m is i n g v a s c u l a r t a r g e t 切 玩 J C a n c e r , 2 0 0 4 , 1 0 9 ( 3 ) : 4 3 6 - 4 4 1 . ( 张 曹 编辑) ( 上接第5 6 1 页) 川 张阳 德， 蔡家 娜.容允军， 阳离 子脂质 体及 其在 基因 转移和基因 治 疗中 的 应用 田 冲国 现代医 学 杂 志 ,2 0 0 1 , 1 1 ( 7 ) :2 8 - 3 0 . 4 Z H A N G Y D , C A I S N , L I A O Y J . P o s i ti v e io n li p o p l

43、 e tc e s a n d i t s a p p l i c a ti o n i n g e n e t r a n s #e c t i o n a n d g e n e t h e r a p y 皿 C h i n a J o u r - 耐 o f M o d e rn M e d i c i n e , 2 加1 , 1 1 价 2 8 - 3 0 . C h i n e s e 阎 S R I N I V A S A N人 M C C L E L L A N A , V A R T I K A R J , o f a l . T h e . 山 加 t e r m b 过

44、 t r a n s f o r m i n g r e g i o n o f s i m ia n v ir u s仍 l a r g eT a nd s mal l - t a n t i g e n s f u n c t i o n s. a d o m a i n毋M o t C e l l B i 碱 1 9 9 7 , 1 7 : 4 7 6 1 - 4 7 7 3 . (6 ) F O X I J , C H O WD H U L Y N R , G U P T A S , e t a l. C o n d i t i o n a l i m - m o r t a l i

45、r s t i o nG u n n皿 h 印 a t o e y te s : a n。v i v o m o d df o r e v a l - u a t i n g m e t h o d s ( 耳f l e p a to l o g y , 1 9 9 5 , 2 1 份 8 3 7 - 8 4 6 . 阴 P A U L D , H O H N E M , P I N K E N C , e t . a l . I m m o r t a l iz e d d iff e r e n t i - a t e xd卜 卿to c y t e l i n e sd 州v e d f

46、i v e t a n s 罗 n i t m i c e油阮 幼 昭 S V 4 0 T - t i g n g e n e s 田 ， E x p C e ll R e s , 1 9 9 8 , 1 7 5 : 3 5 4 - 3 6 2 . 8 B A N G A S S , K I M S , H U B B A R D K , e t a l . S E N 6 , a l o c u s fo r S V 4 0 - m e d i a t e d i m m o r t a l iio a o f h u m a n c e ll s , m a p s t o 6 9 2 6

47、 - 2 7 毋 O n c o g e n t, 1 9 9 7 , 1 4 : 3 1 3 - 3 2 1 . 例 B O D N A R A C , O U E L E T T E M , F R O L K I S M , e t a l . E x t e n s io n o f h f - p a n勿 i n t r o d u c t i o n o f te l o m e r a s e i n t o n o r m a l h u m a n ce ll s 琳 S c i e n c e , 1 9 9 8 , 2 7 9 : 3 4 9 - 3 5 2 . n 仍

48、 S T O N E R G D , K A I G H N M E , R E D D E L R R , e t a l . E s t a b l i s h - o f S V 4 0 T - a n t i g e n i m m o r t a li z e d h u - e p i t h e l ia l c e ll s毋 we n t a n d c h a r a c t e r i z a t i o n 皿 困 能e s o p h a g e a lC l a c e r R e s , 1 9 9 1 , 5 1 : 3 6 5 - 3 7 1 . K A I

49、G H N M E , R E D D E L R R , L E C H N E R瓜 c a l 成 T r a n s C o r m s - t i o n试 h u m a n n e o n a t a l p r o s t a t e e p i t h e l i a l t e l l s场 s t r o n t ia m p h o s p h a t e t r a r t s f e M i o n v e i t h a p l a s m i d c o n t a i n i n g S V 犯 e a r ly r e g io n g e n e s J . C a n c e r R e s , 1 9 8 9 , 4 9 : 3 0 5 0 - 3 0 5 6 . 1 2 K I M B 氏 S U N G S R , P A R K J K , e t a l . S u r v i v a l o f c o n d i t io n a l i m m o