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1、文章编号： ! “ “ # $ # % - 9 + ! # $ !经. , * ?诱导， 重组蛋白# $ !高效表达并纯化成功， 经0 1 2 3 1 4 56 7 8 3及9 : . $ )证实 重组蛋白# $ !可以被免疫血清和病人血清特异识别。结论 !型登革病毒非结构蛋白# $ !表达载体在大肠杆菌 ! A中高 效表达。纯化产物具有较强的免疫原性， 为进一步研究# $ !的生物学特性和血清学检测奠定了基础。 关键词： 登革病毒； 非结构蛋白； 克隆； 原核表达； 免疫原性 中图分类号： ) * + * 文献标识码： , $ % % 2 “ , 0A ! ?A = 9 #） 属黄病毒属成员
2、， 分V个 血清型， 均可引起登革热、 登革出血热和登革热休克 综合征。登革病毒广泛流行于全世界! 公司。其他 试剂均为进口分装或国产分析纯。 ! “ $ 血清标本临床确诊!型登革病毒首次感染 病人急性期血清( ,份由广州市! $ !提供， 并经澳 大利亚6 8 ? = . / 0试剂盒检测抗登革 病毒的/ A 抗体。 ! “ % 病毒培养 ! “ # “细胞在含( , B胎牛血清 + 细胞培养液中于C 2 D、 8 8 ? L ( Y% 3 + ; 8 ? L C Y- ( O 8 A 3 F L ? N # “ # 重组质粒的构建及鉴定 6 ! 5回收产物直接 克隆到) $ ( 2 3 4
3、载体中， 转化后挑选阳性菌落， 经 8 = (） ；3 4 5 6K：) / 0 + %- . $8 D E 6 ? 7 6 8 F D 7 G! “ #H! 4 5 8$ % = 7 8 D E 6 ? 7； 3 4 5 6M：) / 0 + %8 D E 6 ? 7 6 8 F D 7 G! “ # $! 4 5 8$ % 8 = (） ； ! “ # 重组质粒在大肠杆菌中表达与纯化 ) / 0 % - . $重组质粒转化的阳性克隆菌， 通过表达条件的 比较， 确 立 了 于N O培 养 体 系， 在$ I % : : ; 3N P ! * Q、 % R诱导条件下， 表达于K G达高峰。表
4、达蛋 白经. A . + ! , Q 0电泳示相对分子质量约为K $% % %， 与推测蛋白分子质量大小相符， 所表达的蛋白约占 总菌体蛋白的 % S。经分离证实表达产物以包涵 体形式存在， 经C B尿素裂解后， 用- D亲和层析树 脂进行纯化后获得较高纯度的重组蛋白， 见图。 ! “ $ 间接0 N P . ,检测兔血清中特异P E Q抗体用 - . $重组蛋白和全病毒建立的间接0 N P . ,检测兔 免疫血清， 结果表明在第一次免疫后兔血清即产生 特异的- . $ + P E Q和A T $ + P E Q抗体， 加强免疫数次 后， 该两种抗体滴度均逐步升高， 图K显示加强免疫 次后采血
5、分别测定的兔血清中抗A T $病毒和 A T $ - . $蛋白的抗体滴度。 ! “ % 免疫印迹鉴定用病毒免疫兔血清及$ %份登 革感染病人急性期血清分别与转至膜上的- . $蛋 白反应， U 6 ? 7 6 9 5O 3 ; 7结果显示免疫兔血清以及2份 病人血清在相对分子量约K $% % %处有一明显阳性 特异反应条带见图L， $ %份健康人血清在同样位置 未见任何阳性条带。与G D ?单抗结合作用后， 在相 应位置呈一致的特异显色带。结果表明， 重组蛋白 与免疫血清有良好的免疫反应性。 图-重组) * %蛋白的* $ * G / H I ,分析 2 3 4 5 -* $ * G / H
6、 I ,C 9 C D 8 E E 8 7C 9 7“ K 3 ; 3 8 7) * % “ : 8 3 9 N 4 5 6 $：3 ; F: ; 3 6 6 9；3 4 5 62： 9 6 ; : = 8 3 A A K 9 3 F 8 7 C B B 3 : E 8 C 图M N 8 E : 8 9B D :检测免疫血清与$ O % ) * %蛋白的结合反应 2 3 4 5 M N 8 E : 8 9B D : C 9 C D C B B 3 : E 8 CC 9 7$ O %“ C : 3 8 9 : E C G ? K : 8 E 8 C 8 E “ 9 E 8 E : ) * %“
7、: 8 3 9 $：D : : = 5 D W 6 89 4 ( ( D 7 ? 6 9 4；2：5 ; 9 : 4 3 9 4 ( ( D 7 ? 6 9 4；：5 ; 5 + 9 6 + 3 4 7 6 8: ; 5 ; ? “ = A“ 5 + 4 =!B C! D = + 5 D： =D E F G : = +H I : =A D = + 5 DA : + = : K C P F : =! : + = ; ( J J 5 = RK，O 4 =P %，, F F D I?，D G F CS F Q : Q : I 5 + D = : G W H D # = A : G H H F : E
8、 G : : K CKP F : =M : E I : =J : E D$ % #H I D U H I D : W G D J K CK, D =“ : I H D E : V : E = G : ; H D ：: G I : ; 5 G : D I : G 4 ! D = + 5 D V D Q D I = A! D = + 5 D4 D J : 6 D ! : + = G : E) = G : + D = K CKM D A“ : I H D G G I 5 E G 5 I F# W = G 4 D G : EH D H G : A D: =H G : D = G : G 4 A D =
9、 + 5 D V D Q D I = A A D = + 5 D 4 D J : ， A Q = E D = AE 4 F 0 F D = + D K C( = G K ( = V D E G! : ，- 3 3 8，1 （-） ： / 2 * 1 3 C # #% 4 56 7，P 4 D = Z，P 4 = +% S，D G F C! D = + 5 DQ : I 5 D I D A G I 5 E G 5 I FH I D I H D E : V : EE H G 5 I D : J J 5 = W （ W; E 5 F I D E I D : G = E DG D = E D H 4 F : G : K CK“ : I : = + D IK K，L I = A I : MB，B F 4 W : J J 5 = : T G : = G I 5 E G 5 I F + F W E D K D