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1、三氧化二砷对体外人胶质瘤细胞株U 2 5 1的影响 王洪光1， 武俏丽2， 黄慧玲2 （1 .天津市环湖医院， 天津3 0 0 0 6 0； 2 .天津市神经外科研究所， 天津3 0 0 0 6 0） 摘要 目的目的探讨三氧化二砷 （A s 2O3） 对体外培养的人类成神经胶质瘤细胞株U 2 5 1 MG的作用及其机制。方法 方法应用倒置相差显微镜、 四甲基偶氮唑蓝法、 流式细胞仪， 分别对不 同浓度加药组及对照组U 2 5 1细胞的存活、 形态学改变、 细胞D N A含量的分布进行观察和测定。 结果结果 0 . 5 4m o l L的A s 2O3可明显抑制U 2 5 1的增殖。流式细胞仪分
2、析显示， 加药组在G1 期细胞前均出现亚二倍体峰， 且G 0 G 1期细胞减少， 诱导细胞凋亡。结论 结论 A s2O3能抑制体外 人胶质瘤细胞株U 2 5 1的增殖， 有望用于神经胶质瘤的治疗。 关键词 三氧化二砷； 人类成神经胶质瘤细胞株； 细胞凋亡； 细胞周期 中图分类号R- 3 3文献标识码A文章编号1 0 0 8 - 8 8 4 9（2 0 0 5） 1 4 - 1 8 2 9 - 0 2 I n f l u e n c e o fA s2O3o nh u L a ng l i o b l a s t o L a c e l l l i n eU 2 5 1 i nv i t r o
3、 WA N GH o n g - g u a n g 1，WUQ i a o - l i2， H U A N GH u i - l i n g 2 （1 . T i a n j i nH u a n h uH o s p i t a l，T i a n j i n3 0 0 0 6 0，C h i n a；2 . T i a n j i nN e u r o s u r g i c a l I n s t i t u t e，T i a n j i n3 0 0 0 6 0，C h i n a） A b s t r a c t：O b j e c t i v e I t i s t od i
4、s c u s s t h e a c t i o n a n dm e c h a n i s mo fA s 2O3o nh u m a ng l i o b l a s t o m a c e l l l i n eU 2 5 1c u l t i v a t e d i nv i t r o .M e t h o d sT h e s u r v i v o r s h i p，m o r p h o l o g y c h a n g e，d i s t r i b u t i o no f c e l lD N Ac o n t e n t o fU 2 5 1c e l l s
5、i n t h e g r o u p s g i v e n m e d i c i n e o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o na n d c o n t r o l g r o u pw e r eo b s e r v e da n dm e a s u r e dw i t h i n v e r t e dp h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p e， M T Tm e t h o da n d f l o wc y t o m e t r y . R e s u l t sT h
6、 e c o n c e n t r a t i o no f 0 . 5 4m o l Lo fA s 2O3c o u l do b v i o u s l y i n h i b i t t h e p r o l i f - e r a t i o n o fU 2 5 1 .F l o wc y t o m e t r ys h o w e dt h a tt h ep e a ko fh y p o d i p l o i do c c u r r e db e f o r eG 1s t a g ei ne v e r yg r o u pg i v e n m e d i c
7、i n e，a n d c e l l s d e c r e a s e dw i t h a p o p t o s i s o f i n d u c t i o n c e l l s i nG0G1s t a g e . C o n c l u s i o nA s 2O3c a n i n h i b i t t h e p r o l i f e r a t i o n o f h u m a ng l i o b l a s t o m a c e l l l i n eU 2 5 1 i nv i t r o . I t c a nb e u s e d t o t r e
8、a t g l i o m a . K e yw o r d s：A s2O3；h u m a ng l i o b l a s t o m a c e l l l i n e；c e l l a p o p t o s i s；c e l l c y c l e 作者简介 王洪光 （1 9 6 8） ， 男， 从事神经外科工作。 三氧化二砷 （A s 2O3） 是中药砒石的主要成分， 近年来国内 外学者应用其治疗急性早幼粒细胞白血病 （A P L） 取得显著疗 效 1 - 2 。笔者观察了A s 2O3对体外脑胶质瘤细胞株U 2 5 1生 长的影响， 以期为临床应用提供实验基础。 1 材料与
9、方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 细胞株人类成神经胶质瘤细胞株U 2 5 1MG为日 本关西医科大学赠送。 1 . 1 . 2 主要试剂及配制 A s2O3 （浓度5m m o lL） 由哈尔滨 医科大学第一临床医学院药剂科赠送， 用磷酸盐缓冲液 （P B S） 配制成1m m o lL， 4保存， 临用前稀释至所需浓度。 D M E M培养基购自G I B C O公司， 四甲基偶氮唑蓝 （M T T） 、 碘 化丙啶 （P I） 、 R n a s e均为美国S I GM A公司产品， 鼠抗人、 兔抗 鼠非特异性二抗购于迈新公司。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 细胞培养以含
10、1 0 %胎牛血清的D M E M培养基， 在 3 7、5 %C O2培养箱培养U 2 5 1细胞， 实验时取对数生长期 细胞。 1 . 2 . 2 药物诱导接种细胞于培养瓶或培养板中， 2 4h后待 细胞处于对数增长期时分组， 对照组不加药， 实验组A s 2O3终 浓度分别为0 . 5， 1 . 0，2 . 0，4 . 0m o l L， 作用不同时间后分别 去细胞悬液或附壁生长于9 6孔板上的细胞进行测定。 1 . 2 . 3 M T T测定U 2 5 1细胞增殖率 参照司徒镇强等 3介 绍的方法稍加改良。9 6孔培养板， 每孔加入浓度为1*1 0 8 L - 1的U 2 5 1细胞1
11、0 0 L， 3 7、5 %C O2培养2 4h后， 实验组 依次加入终浓度为0 . 5， 1 . 0，2 . 0，4 . 0m o l L的A s 2O3， 继续 分别培养1， 2，3，4，5，6 d后每孔加入2 0LM T T （5gL） ， 继 续培养4 h， 快速翻板法弃去上清， 每孔加入1 5 0LD M S O， 震 荡混匀， 1 0m i n后在酶联免疫测定仪上测定波长为5 4 0 n m的 吸光度A值， 然后计算细胞增殖率。细胞增殖率E实验组吸 光度A值 对照组吸光度A值* 1 0 0 % 1 . 2 . 4 形态观察在倒置显微镜下观察不同浓度的A s 2O3 作用不同时间的U
12、 2 5 1细胞的形态学改变， 观察细胞的凋亡 过程。 1 . 2 . 5 流式细胞仪检测 （碘化丙啶银光染色法） 收集经不 同浓度A s 2O3作用的细胞和对照组细胞， 离心 （10 0 0 r m i n， 1 0m i n） ， 弃上清， 冷P B S （p H7 . 07 . 4） 漂洗2次 （10 0 0r m i n，5m i n） ， 以去除细胞碎片， 加入0 . 5m L冰冷的7 0 %乙醇 中， 4冰箱保存。将制备好的单细胞悬液固定液弃去 （1 0 0 0 r m i n， 1 0m i n） ， 冷P B S漂洗2次 （1 0 0 0 r m i n， 5m i n） ，
13、调整细 9281 现代中西医结合杂志M o d e r n J o u r n a l o f I n t e g r a t e dT r a d i t i o n a l C h i n e s e a n dW e s t e r nM e d i c i n e 2 0 0 5J u l，1 4（1 4） 胞为1 * 1 0 9L- 1， 加入P I染液1 . 0m L， 避光染色3 0m i n， 上机 分析， 资料由M o d F i t软件收集、 贮存和分析。 2 结果 2 . 1 A s2O3对U 2 5 1细胞增殖的影响 结果发现随培养基中 A s2O3浓度的升高和作用时间
14、的延长，U 2 5 1细胞增殖明显受 抑。U 2 5 1细胞受0 . 5， 1 . 0，2 . 0，4 . 0m o l LA s 2O3影响3 5 d这一时期细胞生长明显减慢，6d后细胞数骤然减少， 其中 1 . 0m o l L、 2 . 0m o l L的A s 2O3组分别于第5，6天达到 L D5 0， 提示A s2O3对U 2 5 1细胞增殖的抑制呈剂量和作用时 间依赖关系， 见图1。 图1 A s 2O3对U 2 5 1细胞增殖的影响 2 . 2 细胞形态的变化在0 . 5m o lLA s 2O3的作用下， 细胞 的形态无明显变化， 胞体折光性较好， 细胞突起明显。浓度达 1
15、. 0m o l L时细胞开始固缩， 细胞突起减少， 胞体折光性减 弱， 胞浆内可见有颗粒。当浓度达到2 . 0m o lL时细胞轮廓 变模糊， 细胞变圆离壁， 突起减少、 变短， 胞浆内颗粒明显增 多， 部分细胞胀大破裂。 2 . 3 流式细胞仪检测结果在应用A s 2O3后，G1期前出现 凋亡峰， 低浓度的A s 2O3出现较晚。对照组细胞的凋亡率为 9 . 2 9 %；0 . 5m o l L A s 2O3 实 验 组U 2 5 1细 胞 凋 亡 率 为 1 5 . 5 1 %， 与对照组相比无显著性差异；1 . 0，2 . 0，4 . 0m o l L A s2O3实验组U 2 5
16、1细胞凋亡率与对照组相比均有显著性差 异， 见表1。 2 . 4 细胞周期分析 U 2 5 1细胞经0 . 5，1 . 0，2 . 0，4 . 0m o l L A s2O3作用后， 细胞周期出现明显变化， 表现为较早即出现 G2M阻 滞， 对 照 组 细 胞G0G1期 占6 2 . 8 9 %，S期 占 3 3 . 7 5 %； 与对照组细胞相比， 随A s2O3浓度的升高，G0G1期 细胞所占的百分比下降， S期细胞所占的百分比上升， 见表1。 3 讨论 异常增殖是肿瘤细胞的特征之一， 抑制肿瘤细胞生长是 治疗肿瘤的途径之一 1 ， 也是抗癌药治疗作用基本要求。本 实验A s 2O3与U
17、2 5 1细胞共同孵育16d， 结果显示0 . 5 2 . 0m o l L的A s 2O3对肿瘤细胞的生长均有明显抑制作用， 其中1 . 0， 2 . 0m o l L组与A s 2O3共同孵育5d后可降低G0 G1期细胞所占的百分比， 同时， 此期细胞凋亡率均较对照组 有明显升高， 说明1 . 0， 2 . 0m o l LA s 2O3对U 2 5 1细胞G0 G 1 期细胞作用明显。肿瘤细胞的G 0期细胞是肿瘤复发的根源， 表1不同浓度A s 2O3对U 2 5 1细胞凋亡率和 D N A含量的影响 （ x+s） 组别凋亡率 细胞周期百分比 % G0G1S 对照组 9 . 2 9 +
18、0 . 2 26 2 . 8 9 + 1 . 2 93 3 . 7 5 + 0 . 3 9 0 . 5m o l L 1 5 . 5 1 + 0 . 6 76 0 . 9 0 + 2 . 1 43 6 . 8 5 + 2 . 2 4 1 . 0m o l L 1 9 . 0 8 + 1 . 0 0 5 7 . 5 3 + 2 . 2 24 0 . 1 2 + 2 . 8 5 2 . 0m o l L 2 1 . 8 5 + 0 . 8 4 5 4 . 1 0 + 1 . 1 64 3 . 1 5 + 2 . 2 8 4 . 0m o l L 2 4 . 1 2 + 0 . 6 3 5 0 .
19、9 2 + 0 . 1 54 6 . 0 9 + 2 . 2 6 注：与对照组比较， P 0 . 0 5。 处理D N A复制前期阶段的G 1期细胞的减少会导致细胞增 殖的抑制， 提示1 . 0， 2 . 0m o l LA s 2O3对细胞生长抑制的影 响主要作用于G 0 G 1期细胞。本实验结果还表明， 实验组细 胞S期所占的百分比高于对照组， 提示A s 2O3若与作用于S 期细胞的抗肿瘤药物联合使用， 其抑制肿瘤细胞生长的作用 可能会更加显著 4 。 细胞凋亡是一个非常复杂的生理病理过程， 是细胞主动 参与的 “自杀” 机制。近年来的研究表明， 许多抗肿瘤药物均 可诱导肿瘤细胞凋亡，
20、可能是这些药物抑制肿瘤细胞生长的 机制之一。有学者报道： 在1 . 0m o lL培养体系中， N B4和 A P L原代细胞凋亡明显， 而正常人脑皮质神经细胞基本不受 影响 5 。较低浓度 （2m o lL） 的A s 2O3除了能抑制U 8 7 MG 细胞增殖以外， 也能诱导细胞凋亡 6 。本实验结果初步表明， 0 . 5，1 . 0，2 . 0，4 . 0m o l L的A s 2O3均对人胶质瘤细胞株 U 2 5 1细胞有抑制其生长、 增殖和诱导凋亡的作用， 而且肿瘤 细胞内药物浓度和凋亡率与药物持续作用时间之间存在时效 关系。促凋亡范围内的低浓度、 长时间作用比高浓度、 瞬间作 用的
21、促凋亡效果更显著。这提示A s 2O3可能会成为一种新的 治疗和辅助治疗人胶质瘤的药物。 参考文献 1 张鹏， 王树叶， 胡龙虎， 等.三氧化二砷注射液治疗7 2例急性早 幼粒细胞白血病 J.中华血液学杂志， 1 9 9 6，1 7 （2） ： 5 8 - 6 0 2 张鹏， 胡龙虎， 周晋， 等.三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血 病的机制研究 J.白血病， 1 9 9 6，5 （3） ： 1 3 1 - 1 3 4 3 司徒镇强， 吴军正.细胞培养 M.西安： 世界图书出版西安公 司， 1 9 9 6：1 8 6 - 1 8 7 4 高媛媛， 徐洪雨， 武俏丽， 等.亚砷酸体外对人肝癌细胞株
22、B E L- 7 4 0 2影响的初步研究 J.哈尔滨医科大学学报，2 0 0 1，3 5 （1） ： 2 2 - 2 4 5 周晋， 孟然， 宋学明， 等.恶性肿瘤与神经元胞内三氧化二砷浓 度与敏感性 J.中华医学杂志， 2 0 0 4，8 4 （1） ： 6 3 - 6 4 6 赵世光， 李力仙， 张建华， 等. A s 2O3对不同p 5 3表性的人胶质瘤 细胞系细胞周期蛋白B 1、D1表达的影响 J.中华神经外科杂 志， 2 0 0 4，2 0 （3） ： 2 0 2 - 2 0 6 收稿日期2 0 0 5 - 0 3 - 0 2 0381 现代中西医结合杂志M o d e r n J o u r n a l o f I n t e g r a t e dT r a d i t i o n a l C h i n e s e a n dW e s t e r nM e d i c i n e 2 0 0 5J u l，1 4（1 4）