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1、书书书 短篇论著 基金项目： 浙江省自然科学基金资助项目 （M303194） 作者单位： 310006 杭州， 浙江省血液中心输血研究所 卫生部血 液安全研究重点实验室 通讯作者： 严力行， Email：ylx zjb. org. cn 一例 RhD 弱表达突变体的血清学和分子生物学研究 吴俊杰 许先国 洪小珍 姜侃 傅启华 严力行 位于人类 1 号染色体上 （1p34-36） 的 RHD 和 RHCE 基因分别编码 Rh 血型系统的核心蛋白 RhD 和 RhCE 1。其中 D 抗原因为具有强烈的免疫原性 而具有重要的临床意义。目前， 对弱 D 表型的分子 机理及频率分布等研究大部分集中在欧洲
2、人群中， 中国人群中这方面的研究还很少 2-7。我们对 1 例 D 突变体进行了研究， 发现了一种新的 RHD 等位基 因， 现报道如下。 一、 对象与方法 1. 对象： 先证者系本中心无偿献血员， 男， 20 岁， 汉族； 先证者及家系成员均为浙江人， 身体健 康， 均非近亲结婚； 随机选取 354 名 Rh 阳性和 188 名Rh 阴性浙江籍无偿献血员作为等位基因频 率的调查对象， 年龄 18 50 岁。 2. Rh 表型血清学鉴定： 采用常规盐水平板法或 试管法。RhD 鉴定使用加拿大 Dominion 公司的混 合单克隆抗 D 试剂， 根据试剂说明， RhD 阴性表型 用间接抗人球蛋白
3、试验 （IAT） 进一步确认。抗人球 蛋白试剂为美国 Immuco 公司的兔源抗 IgG。RhC、 Rhc、 RhE 和 Rhe 鉴定试剂为加拿大 Titus 公司的单 克隆抗体。 3. 基因组 DNA 制备： 采用 PUREGENE!DNA 纯化试剂盒（Gentra 公司产品， 美国 Minneapolis） ， 从枸橼酸钠抗凝的外周血中制备基因组 DNA。 4. RHD 基因序列分析： 参照 Wagner 等 7和 Legler 等 8的方法， 并略作修改。 5. 等位基因特异-聚 合 酶 链 免 疫 反 应 （ AS- PCR） ： 根据 RHD 基因和 RHD 286A 等位基因相关
4、序列设计一组特异扩增 RHD 286A 等位基因的引 物：上 游 引 物5 GGCAATCCTGCTGGACA3 （U66341， 1460-1475， 下划线碱基为突变碱基） ， 下 游引物 5 TGGGCAACAAAAGTGAAA 3 （U66341， 1943-1926） 。PCR 反应总体积 10 “l， 其中含模板 DNA 0. 2 “l （约含 DNA 5 10 ng） ， 特异性引物终浓 度 250 nmol/ L， MgCl2终浓度 1. 5 mmol/ L， dNTP 终 浓度 200 mmol/ L， Taq DNA 聚合酶 0. 2 U （日本 TaKaRa 公司） 。P
5、CR 扩增条件： 95 预变性 5 min， 然后 94 变性 30 s、 61 退火 30 s 和 72 延伸 50 s， 循环 30 次， 最后 72延伸 5 min。特异性扩增 产物为 484 bp， 产物通过 2% 琼脂糖电泳， 用凝胶成 像仪 （美国 SYNGENE 公司） 观察结果。DNA 标准 参照物为 DL 2000 （日本 TaKaRa 公司） 。 6. D 杂合性检测： 参照 Perco 等 9的方法， 用特 异性引物 u1-s 和 rnb31 PCR 检测 Rh 杂合盒。如果 可以扩增得到 2778 bp 的特异性片段， 表明存在 Rh 杂合盒， 有 RHD 基因的缺失，
6、 反之， 则不存在 Rh 杂 合盒， 没有 RHD 基因的缺失。 二、 结果 1. 先证者及其家系成员血清学表型： 先证者红 细胞与抗 D 试剂在盐水反应 （试管法） 中呈阴性， IAT 检测结果呈阳性， 属弱 D 表型； 先证者祖父、 祖 母、 父亲和母亲都是 Rh 阳性表型， 其中先证者祖父 和父亲的红细胞与抗 D 试剂在盐水反应中 （试管 法） 的凝集强度约 2 + ， 只有正常对照 （4 + ） 的一半 左右。先证者及其家庭成员的 Rh 表型分别为先证 者 Cc 弱 Dee、祖 父 CCDee、祖 母 CCDee、父 亲 CCDee、 母亲 ccDEe （图 1） 。 2. RHD基因
7、序列分析结果： 测序结果表明， 先 图 1 RHD 286A 等位基因的家系遗传图 D （286A） / d 复合杂合子的男性携带者； D （ 286A） / D 复合杂合子的男性携带者； 携带正常 RHD 基因的女 性； 箭头所指为先证者 8361中华医学杂志 2005 年 6 月 22 日第 85 卷第 23 期 Natl Med J China，June 22， 2005， Vol 85，No. 23 证者 RHD 基因外显子 2 有 286G A 的改变 （图 2A） ， 在其余 9 个外显子及侧翼序列中未发现有其 他核苷酸改变。先证者祖父和父亲则为 286 G/ A 杂合子 （图 2
8、B） 。先证者的祖母和母亲外显子 2 序 列未发现有改变 （图 2C） 。 图2 外显子2 的部分核苷酸序列分析图 箭头所指部 位是 286 位， A. RHD 286A 等位基因； B. RHD 286G 和 286A 杂合； C. 正常 RHD 基因 3. AS-PCR 结果： 在 354 名随机 Rh 阳性人群和 188 名随机 Rh 阴性人群中未发现 RHD 286A 等位 基因。先证者及其祖父、 父亲的 AS-PCR 结果阳性， 而先证者的祖母和母亲结果阴性 （图 3） 。 M. DNA 标准参照物； 1. 先证者祖父； 2. 先证者祖母； 3. 先证者父亲； 4. 先证者母亲； 5
9、. 先证者 图 3 RHD 286A 的 AS-PCR 结果 4. D 杂合性检测结果： 检测 Rh 杂合盒， 发现先 证者和母亲为阳性， 而先证者的祖父、 祖母和父亲是 阴性 （图 4） 。 三、 讨论 最近的研究表明， 单个核苷酸突变引起的氨基 M. DNA 标准参照物； 1. 先证者祖父； 2. 先证者祖母； 3. 先证者父亲； 4. 先证者母亲； 5. 先证者 图 4 D 杂合性检测 酸替换是产生弱 D 表型的主要分子机理 7。已经 发 现 43 种 弱 D 等 位 基 因 （ http： / / www. uni- ulm. de/ %7Efwagner/ RH/ RB/ ） ， 但
10、是在中国人群仅 有 10 例弱 D 表型、 6 种弱 D 等位基因的报道 4， 5。 本文先证者经 IAT 试验鉴定为弱 D 表型。 RHD 基因序列分析发现有外显子 2 的 286G A 的核苷酸改变， 该突变导致 RhD 蛋白第二胞外环 96Gly Ser 氨基酸的改变。在随机选取的 354 名 Rh 阳性和 188 名 Rh 阴性人群中均未发现 RHD 286A 等位基因， 检索文献和与 Genbank 中的数据比 对， 未发现 RHD 基因有 286A 突变的报道。说明 286A 不是单核苷酸多态性 （SNP） ， 而是 RHD 基因 的一个新的突变位点。在家系研究中发现先证者的 祖父
11、和父亲为该突变杂合子， 说明该突变遗传源于 先证者祖父。 D 杂合性的检测表明先证者和其母亲存在 RHD 基因的缺失。结合序列分析、 AS-PCR 的结果， 推测先证者、 先证者的祖父、 祖母、 父亲和母亲的 RHD 基因型分别为 D （286A） / d、 D （286A） / D、 D/ D、 D （286A） / D 和 D/ d。我们推测 D （286A） / d 复合 杂合子是引起先证者 D 抗原极弱表达的主要原因。 先证者祖父和父亲携带的杂合的 RHD 286A 等位基 因使得 D 抗原表达的强度减半， 因此， 我们推测除 了 RHD 基因表达的剂量效应外， RHD 286A 等位
12、基 因干扰正常 RHD 基因的表达可能也不能排除。 根据 Wagner 等 3的分析， 位于胞外和胞内的 氨基酸突变对 D 抗原量的表达影响比位于红细胞 膜上的氨基酸突变要小， 而靠近膜表面的氨基酸突 变对 D 抗原表达质的改变影响最大。286G A 突 变导致的氨基酸突变正好位于第二胞外环靠近膜的 位置。但是， 因为在极弱表达的 D 抗原中很难鉴定 D 表位的改变， 目前还不能确定 RHD 286A 等位基 因是否会产生部分 D 表型。 9361中华医学杂志 2005 年 6 月 22 日第 85 卷第 23 期 Natl Med J China，June 22， 2005， Vol 85，
13、No. 23 本文报道的 RHD 286A 是一种新的 RHD 等位 基因， 引起 D 抗原的弱表达。RHD 286A 的鉴定增 加了已知的 RHD 等位基因数目， 对 Rh 血型基因的 变异、 进化、 多态性和表达的研究、 临床输血策略的 制定和将来 RHD 基因分型准确性的提高有重要的 意义。 参考文献 1Avent ND，Ridgwell K，Tanner MJ，et al. cDNA cloning of a 30 kDa erythrocyte membrane protein associated with Rh（ Rhesus） - blood-group-antigen exp
14、ression. Biochem J， 1990， 271： 821-825. 2Shao CP，Xiong W. A new PCR method for direct determination of RHD zygosity. Natl Med J China， 2004， 84： 736-739. 邵超鹏， 熊文. 一种新的 RHD 合子型直接测定方法. 中华医学杂 志， 2004， 84： 736-739. 3Wagner FF，Frohmajer A， Ladewig B， et al. Weak D alleles express distinct phenotypes. Blo
15、od， 2000， 95： 2699-2708. 4Lin LL，Shih MC，Hsieh MH，et al. Molecular basis of weak D in Taiwanese. Ann Hematol， 2003， 82： 617-620. 5Shao CP，Maas JH，Su YQ，et al. Molecular background of RHD- positive，D-negative，D （el）and weak D phenotypes in Chinese. Vox Sang， 2002， 83： 156-161. 6Zhou YY，Xiong W，Shao C
16、P. Whole exon 5 and intron 5 replaced by RHD/ CE in partial D phenotype DVa（Hus） . J Exp Hematol， 2005， 13： 140-142. 周一炎， 熊文， 邵超鹏. 部分 D 表型 DVa（Hus） 在第 5 外显子和第 5 内含子发生 RHD/ CE 基因交换. 中国实验血液学杂志， 2005， 13： 140-142. 7Wagner FF，Gassner C，Muller TH，et al. Molecular basis of weak D phenotypes. Blood， 1999，
17、93： 385-393. 8Legler TJ，Maas JH，Kohler M，et al. RHD sequencing：a new tool for decision making on transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis. Transfusion Medicine， 2001， 11： 383-388. 9Perco P，Shao CP，Mayr WR，et al. Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered Rhes
18、us boxes and a new weak D type. Transfusion， 2003， 43： 335-339. （收稿日期： 2005-03-17） （本文编辑： 李伟） 作者单位： 200025 上海第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学 研究所 通讯作者： 王鸿利， Email： wanghongli602163. com 抗凝血酶基因 C2757T 杂合突变致型遗传性 抗凝血酶缺陷症 周荣富 戴菁 傅启华 王文斌 谢爽 丁秋兰 胡翊群 王学锋 王鸿利 遗传性抗凝血酶 （antithrombin，AT） 缺陷症是 由 AT 基因突变引起， 可分2 型： 型主要表现为 AT 抗
19、原 （AT： Ag） 和活性 （AT： A） 水平的同步减低， 型由 AT 结构异常所致 1。国外已报道 300 余例， 基因突变种类超过 130 种； 但国内仅我们报道过 1 例 2。本文对另一个 AT 缺陷症家系进行研究， 发 现此家系为 I 型遗传性 AT 缺陷症， 由 AT 基因 C2757T 杂合突变引起。 一、 对象与方法 1. 家系资料： 先证者， 男，21 岁。2003 年 7 月 因头痛、 抽搐、 左侧肢体瘫痪入院， 经头颅 CT 诊断 为脑静脉血栓形成， 予以治疗后恢复； 1 个月后， 又 因左下肢肿胀、 疼痛就诊， 经彩色多普勒超声检查， 诊断为左下肢深静脉血栓形成。3
20、个月后， 患者再 次因腹痛、 便血就诊， 肝、 肾功能均正常， 剖腹探查发 现肠系膜血管血栓形成， 手术切除坏死肠管。现服 用 “华法令” 治疗。家系 3 代 8 人中， 除先证者外均 无类似病史。 2. AT 抗原、 活性及凝血像检测： 先证者和所有 家系成员分别静脉采血 1. 8 ml，加入含 0. 2 ml 129 mmol/ L 枸橼酸钠抗凝， 立即 4、 900 g 离心 15 min， 吸取上层血浆。AT 抗原 （AT： Ag） 检测采用免 疫比浊法 （美国 Beckman Coulter 公司， 美国 Array 360 仪器） ， AT 活性 （AT： A） 、 蛋白 C 活性
21、 （PC： A） 及 蛋白 S 活性 （PS： A） 检测采用发色底物法 （美国 Dade Behring 公司、 日本 Sysmex 1500 全自动血凝 仪） 。同时检测部分凝血活酶时间 （APTT） 、 凝血酶 原时间 （PT） 。 3. 基因组 DNA 抽提： 使用美国 Biosynthesis 公 司 DNA 抽提试剂盒， 按试剂说明书操作。 4. PCR 检测： 按文献 2 报道的序列合成 PCR 引物 （其中扩增 exon2 区域的引物序列： 上游 5 AATCCTCTGCTTTACTGGTG 3，下 游 5 TGCTCC- TAACAAGGTGGC 3） 。先扩增先证者 AT 基因各个 外显子及侧翼序列， 发现突变区域后， 再扩增家系其 他成员的相应片段。PCR 反应条件如文献 2 报道 （扩增 exon2 区域时， 退火温度为 52） 。PCR 仪为 美国 PE 公司 GeneAmp PCR System 9600。 0461中华医学杂志 2005 年 6 月 22 日第 85 卷第 23 期 Natl Med J China，June 22， 2005， Vol 85，No. 23