三种建立小鼠乳腺癌移植模型方法的比较.pdf

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1、 第2 7卷 第3期 2 0 0 6年5月 武汉大学学报 ( 医学版) M e d i c a l J o u r n a l o fWu h a nU n i v e r s i t y V o l . 2 7N o . 3 M a y,2 0 0 6 课题来源: 湖北省自然科学基金资助项目( 编号:3 0 1 1 3 0 8 5 1) 作者简介: 孙金中, 男,1 9 8 0 -, 医学硕士生, 主要从事乳腺疾病的微创治疗研究 通讯作者: 孙圣荣, 男,1 9 5 8 -, 教授, 硕士生导师, 主要从事乳腺甲状腺肿瘤的诊治研究 三种建立小鼠乳腺癌移植模型方法的比较 孙金中1 孙圣荣1 金

2、化民2 姚 峰1 涂 毅1 魏 文1 姚晓莉1 张 冰1 武汉大学人民医院 1乳腺甲状腺外科,2泌尿外科 武汉 4 3 0 0 6 0 摘要 目的: 用MA 7 8 2细胞建立稳定的小鼠乳腺癌模型, 选择最佳的模型制作方法。方法:6 0只B A L B/c小 鼠随机分为3组, 每组2 0只, 分别采用小鼠左腋窝皮下细胞悬液注射法、 组织块悬液注射法、 组织块种植法制作小 鼠乳腺癌模型, 比较各组的种植成活率、 肿瘤生长率, 并观察肿瘤的生物学形态。结果: 组织块悬液注射法操作简 便, 经济, 成瘤率高,肿瘤大小均一, 肿瘤呈浸润性生长, 增殖旺盛; 细胞悬液注射法操作复杂, 价格昂贵; 组织块

3、种 植法操作复杂, 成瘤率较低, 大小相差较大。结论: 三种方法中, 组织块悬液注射法是最佳的模型制作方法。 关键词 乳腺癌; 动物模型;MA 7 8 2细胞株;B A L B/c小鼠; 组织块悬液注射 中图分类号 R - 3 3 1 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 1 - 8 8 5 2(2 0 0 6)0 3 - 0 3 3 5 - 0 3 C o m p a r i s o no fM i c eM o d e l so fMA 7 8 2B r e a s t C a n c e rE s t a b l i s h e db yT h r e eD i f f e r e n

4、tM e t h o d s S U NJ i n z h o n g 1, S U NS h e n g r o n g 1, J I NH u a m i n 2, Y A OF e n g 1, T UY i 1,WE IW e n1, Y A OX i a o l i 1, Z H A N GB i n g 1 1D e p t .o fG e n e r a lS u r g e r y, 2D e p t .o fU r o l o g y,R e n m i nH o s p i t a l o fWu h a nU n i v e r s i t y, Wu h a n4 3

5、0 0 6 0,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e:T os e l e c tab e t t e rm e t h o dt oe s t a b l i s has t a b l em o u s em o d e lo fMA - 7 8 2b r e a s t c a n c e r .M e t h o d s:S i x t ym i c ew e r ed i v i d e d i n t ot h r e eg r o u p s r a n d o m l y,w i t h2 0 i ne a c h. I n j

6、 e c t i o n o f t u m o rc e l l ss u s p e n s i o n,i n j e c t i o no ft u m o rt i s s u em a s ss u s p e n s i o na n di m p l a n t a t i o no ft u m o r t i s s u ew a sd o n eh y p o d e r m a l l yr e s p e c t i v e l y i nt h e l e f ta x i l l ao fm i c e i nt h et h r e eg r o u p s .

7、T u m o r - t a k e r a t e a n d t u m o rg r o w t hr a t eo f t u m o r - b e a r i n gm i c ew e r e c o m p a r e d,a n d t h eb i o l o g i c a l f e a t u r e s o f t u m o rw e r eo b s e r v e d . R e s u l t s:M o d e l sw e r e e s t a b l i s h e dm o r e e a s i l y,e c o n o m i c a l

8、l ya n ds u c c e s s - f u l l yb y i n j e c t i n g t i s s u em a s s s u s p e n s i o n,a n d t u m o rp r o l i f e r a t e dr a p i d l ya n dc o n f o r m e d t o t h eb i - o l o g i c a l f e a t u r eo fm a l i g n a n tt u m o r .T h ep r o c e s sw a si n t r i c a t ea n de x p e n s

9、i v eb yi n j e c t i o no f t u m o rc e l l s u s p e n s i o n.A n db yt h em e t h o do ft u m o rt i s s u ei m p l a n t a t i o n,t h ep r o c e s sw a s i n t r i - c a t e,t u m o r - t a k er a t ew a s l o w,a n dt h e t u m o rs i z e sw e r ev a r i o u s . C o n c l u s i o n:I n j e c

10、 t i o no f t i s s u e m a s ss u s p e n s i o n i s t h eb e s tw a y i nt h e t h r e em e t h o d s . K e yW o r d s B r e a s tC a n c e r;A n i m a lM o d e l;MA 7 8 2C e l lL i n e;B A L B/cM i c e;I n j e c t i o no f T u m o rT i s s u eM a s sS u s p e n s i o n 武汉大学学报( 医学版)第2 7卷 乳腺癌是一种严重

11、危害妇女健康的恶性肿瘤, 在西方发达国家已成为妇女的第一位死亡原因, 在 对其生物学行为的认识及发展新的治疗方法上, 乳 腺癌动物模型起着举足轻重的作用 1,2。乳腺癌移 植动物模型的建立目前常报道有细胞悬液注射法、 组 织 块 悬 液 注 射 法、组 织 块 种 植 法 三 种 方 法。 MA 7 8 2肿瘤细胞是一种小鼠乳腺癌细胞系, 由武汉 大学生命科学院李文鑫教授等人建株 3, 是建立小 鼠乳腺癌模型较常用的一种细胞株。但目前研究者 都采用细胞悬液注射法建立MA 7 8 2小鼠乳腺癌模 型 4,5,6。我们采用三种不同的方法建立了 MA 7 8 2 小鼠乳腺癌模型, 并比较其优劣, 现

12、报告如下, 希望 能给以后的研究者提供参考。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 细胞株 小鼠乳腺癌MA 7 8 2 /5 S - 8 1 0 2细胞 购 于 武 汉 大 学 中 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 3 (C C T C C) 。 1. 1. 2 主要试剂 DMEM/F 1 2培养基( 美国G i b - c o公司生产) , 胎牛血清( 杭州四季青公司生产) , 0. 2 5%胰蛋白酶溶液,D - H a n ks液( 自配) ,1 0%水 合氯醛, 甲醛等。 1. 1. 3 实验动物 B A L B /c小鼠, 6 5只, 雌性,6 - 8 周龄, 体重(

13、2 02)g, 购自湖北省卫生监督中心实验 动物室。 1. 2 方法 1. 2. 1 细胞培养和荷瘤传种小鼠制备 细胞株买 回后进行传代培养扩增, 制成浓度约为21 0 1 0/ L 的细胞悬液( t r y p a nb l u e染色计数, 细胞活力9 0% 以上) , 在小鼠腋窝皮下用1. 0m l注射器接种, 每只 小鼠接种0. 3m l的细胞悬液, 共接种5只小鼠。于 第5天小鼠腋下均可触及黄豆大小结节, 第1 4天后 长出了( 1 22)mm大小的肿块, 至此, 荷瘤传种小 鼠制成。 1. 2. 2 组织悬液和组织块制备 无菌条件下切取4 只传种荷瘤小鼠实体瘤, 生理盐水冲洗后,

14、放置于盛 有DMEM/F 1 2液的玻璃皿中, 取瘤体中旺盛的鱼 肉样组织,约1c m1c m1c m, 共2块, 用眼科剪 尽量剪碎, 加入少量胎牛血清, 制成1 0m l组织块悬 液; 另2块瘤体用眼科剪剪成直径约2mm大小的 组织块, 共2 0枚, 供手术种植用。 1. 2. 3 小鼠乳腺癌模型制作 6 0只小鼠随机分成 3组(G1,G2,G3) , 各组采取不同的模型制作方法。 G1组: 抓取小鼠, 直视下, 在小鼠左腋窝皮下用1. 0 m l注射器接种, 每只小鼠接种0. 3m l的细胞悬液( 浓度约为21 0 1 0/ L) ;G2组: 同样条件下, 用2m l注 射器1 2号针头

15、于小鼠左腋窝皮下接种组织块悬液, 每只小鼠接种0. 5m l;G 3组: 按3m l / k g 体重腹腔 注射1 0%水合氯醛, 麻醉成功后, 动物仰卧、 消毒后 在同样部位剪开皮肤, 取准备好的组织块1枚置于 皮下, 缝合切口。 1. 2. 4 观察指标 接种后每天观察其小鼠生活进 食情况及接种部位肿块生长情况, 第1 - 8周每周测 量瘤体长径(A)和短径(B),计算肿瘤体积V= ( 4 /3) (A+B) / 4 3( =3. 1 4) 及肿瘤生长率 (T u m o rg r o w t hr a t e,T G R) ,T G R = V第( n+1) 周/ V第n周1 0 0%,

16、 记录小鼠荷瘤生存时间, 小鼠死亡后 即进行解剖, 肿块及可疑器官做病理检查。 1. 2. 5 统计处理 表格数据以均数标准差( x s) 表示。用S P S S1 3. 0统计软件行统计分析, 各组 接种成瘤率间用卡方检验, 各组间肿块平均体积差 异比较用单因素方差分析, 以P 0. 0 5) ,G3较G1、G2 组成瘤率低( P0. 0 5) 。肿瘤具体生 长情况见表1。 2. 3 细胞形态学观察 低倍镜下见癌细胞巢状排 列, 组织异形性大, 向周围肌肉组织浸润生长, 间质 内有淋巴细胞、 浆细胞散在分布, 新生毛细血管丰富 ( 插页2, 图1) , 较大瘤体中心有片状坏死, 坏死灶周 围

17、有大量淋巴细胞浸润; 高倍镜下见癌细胞大小形 态不一, 胞质丰富, 淡红染色, 核分裂相多见( 插页2, 图2) ; 肝肺均有广泛转移( 插页2, 图3, 4)。 633 第3期 孙金中, 等.三种建立小鼠乳腺癌移植模型方法的比较 表1 小鼠植瘤后不同时间的肿瘤体积(V) 及肿瘤生长率(T G R) T a b . 1 T u m o rv o l u m e(V)a n dg r o w t hr a t e(T G R)i nd i f f e r e n t t i m e i nt h e t u m o r - b e a r i n gm i c e i nt h e t h r

18、e eg r o u p s P e r i o d(w e e k) G*1G2G3 V(c m 3) T G R(%)V(c m 3) T G R(%)V(c m 3) T G R(%) 1 s t0. 1 1 30. 0 0 9-0. 1 1 80. 0 0 5-0. 1 3 20. 1 3 2- 2 n d0. 9 0 80. 0 5 28 0 3. 50. 9 5 80. 0 4 58 1 1. 90. 8 2 90. 9 5 26 2 8. 0 3 r d2. 1 4 80. 9 7 42 3 6. 62. 2 3 40. 8 4 52 3 3. 21. 8 6 42. 8 32

19、2 4. 8 4 t h4. 7 2 32. 1 3 22 1 9. 95. 1 6 31. 9 6 82 3 1. 13. 8 1 53. 6 12 0 4. 7 5 t h7. 5 7 43. 2 6 41 6 0. 47. 8 3 62. 1 6 71 5 1. 85. 6 3 94. 4 61 4 7. 8 6 t h9. 8 3 53. 9 5 31 2 9. 89. 7 9 42. 6 8 11 2 5. 07. 7 6 35. 5 71 3 7. 7 7 t h1 0. 1 9 44. 3 1 21 0 3. 71 0. 3 4 33. 2 6 41 0 5. 68. 8 4 1

20、5. 9 41 1 3. 9 8 t h1 0. 2 1 94. 5 9 31 0 0. 21 0. 5 6 94. 2 3 11 0 2. 89. 2 9 26. 1 31 0 5. 1 *G1,G2a n dG3w e r e t h r e em o d e l g r o u p sm a d eb yd i f f e r e n tm e t h o dr e s p e c t i v e l ya s i n j e c t i o no f c e l l ss u s p e n s i o n,o f t u m o r t i s s u em a s sa n d i

21、 m p l a n t a t i o no f t u m o r t i s s u e 3 讨论 目前 研 究 者 多 采 用 细 胞 悬 液 注 射 法 建 立 MA 7 8 2小鼠乳腺癌模型, 而且方法介绍均不详细, 报道结果也不尽相同 3 - 5。 本研究中采用细胞悬液接种法的成瘤率与其它 文献报道一致, 但早期肿块生长速度较其它报道要 快, 其原因可能为本实验接种细胞数量( 约每只6 1 0 6个) 较其它实验( 约每只51 06个) 大。说明接种 细胞数量越大, 成瘤所需时间就越短。 组织剪碎后加入少量胎牛血清是本实验的一个 特点, 在预实验中, 组织碎片未加胎牛血清其成瘤率

22、 不高, 分析其原因可能为组织悬液注入皮下后其生 成营养血管需要一段时间, 在这个过渡期血清中的 营养成分起了重要作用。组织块种植法成瘤率不高 可能为在生长营养血管期, 部分组织块因无营养供 应而坏死导致成瘤率下降。在实验中, 所取组织块 必须为新鲜组织是一个值得我们注意的问题。 在几种模型制作方法中, 细胞悬液接种法做一 定数量的动物模型要大量的细胞, 而细胞的培养传 代是一个操作较复杂、 成本较高的过程; 组织块种植 法需小鼠麻醉下切开皮肤行包埋, 该操作费时也较 复杂, 且成瘤率不高。故比较而言, 对于小鼠乳腺癌 MA 7 8 2/5 S - 8 1 0 2细胞系, 用组织块悬液注射法可

23、在 短时间内提供性质稳定、 生长迅速的移植性小鼠乳 腺癌模型, 且操作简便、 成本低、 成瘤率高, 为理想的 模型制作方法。 参考文献 1 H u t c h i n s o nJ N,M u l l e rW J .T r a n s g e n i cm o u s em o d e l s o fh u m a n b r e a s tc a n c e rJ.O n c o g e n e,2 0 0 0,1 9: 61 3 0 - 61 3 7. 2 P e a c eB E,T o n e yE a r l e yK,C o l l i n s MH,e ta l .R o n

24、r e c e p t o rs i g n a l i n ga u g m e n t sm a mm a r yt u m o r f o r m a t i o n a n dm e t a s t a s i s i nam u r i n em o d e lo fb r e a s tc a n c e rJ. C a n c e rR e s,2 0 0 5,6 5(4) :12 8 5 - 12 9 3. 3 王桂英,胡解郁,黄佩霞,等.小鼠乳腺癌MA 7 8 2/5 S - 8 1 0 2细胞系的建立及其特征J.武汉大学学报( 自然 科学版) , 1 9 8 5,1:1 1

25、 1 - 1 1 7. 4 阮晓峰, 周云峰.端粒酶抑制剂联合放射治疗对小鼠乳 腺癌作 用 的 实 验 研 究 J.癌 症,2 0 0 1,2 0(3) :2 4 9 - 2 5 4. 5 陈道祯,张丽珊,唐秋莎,等.H S V - T K/G C V自杀基 因系统治疗小鼠乳腺癌的研究J.南京医科大学学报 ( 自然科学版) , 2 0 0 4,3(2 4) :2 6 7 - 2 7 4. 6 罗翔, 董长垣,郭淑芳,等.蓝舌病毒H b C株靶向性杀 死小鼠荷MA 7 8 2肿瘤的研究J.武汉大学学报( 医学 版) ,2 0 0 4,4(2 5) :3 7 2 - 3 7 9. (2 0 0 5 - 1 0 - 2 0收稿) 编辑 张 峻 733