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1、2 0 0 8 年8 月 第2 0 卷上半月第1 5 期 中国民康医学 M e d i c a lJ o u r n a lo fC h i n e s eP e o p l e gH e a l t h A u g ，2 0 0 8 V 0 1 2 0F H MN o 1 5 【临床研究】 不同固定方法对新生大鼠脑组织切片的影响 陈广斌1 ，谢玲2 ，林坚涛 ( 1 广东医学院附属医院药学部，广东湛江5 2 4 0 0 1 ；2 广东医学院组胚教研室；3 广东医学院中药研究所) 【摘要】 目的：观察应用与不应用多聚甲醛心脏灌注这两种不同固定方法对新生大鼠脑组织切片的影响。方法：2 0 只新生
2、大鼠随机 化分为灌注组与非灌注组，每组各l O 只。灌注组经麻醉后经左心室插入灌流针，先灌注冰冻无菌生理盐水再灌注4 多聚甲醛，灌注同时切 开小部分肝脏断头取脑，多聚甲醛浸泡固定2 4 小时，再经7 0 、8 0 、9 5 、1 0 0 乙醇及二甲苯浸泡，石蜡包埋。非灌注组新生大鼠经麻醉后 直接断头取脑，其它固定方法同灌注组。进行石蜡切片H E 染色观察鼠脑组织结构。结果：灌注组脑组织切片组织结构清晰，无共染现象，组 织切片完整均匀，皮层及海马区组织、细胞形态正常，未见扩张的毛细血管。非灌注组大脑皮层及海马区组织水肿，细胞周围间隙增宽，胞体肿 胀，有些细胞境界模糊不清，核着色不良，部分视野可见
3、扩张的毛细血管，血管内有血细胞样物。结论：应用多聚甲醛心脏灌注对新生大鼠脑 组织的固定效果较好，是应用动物脑组织切片进行形态学研究实验的必不可少的步骤。 【关键词】新生大鼠；大脑；组织固定；组织切片 中图分类号】R 一3 3 2 文献标识码 B 新生大鼠脑组织切片是观察新生大鼠脑组织病理损伤 的主要实验方法之一。在进行脑组织切片之前，需对处死的 新生大鼠鼠脑进行固定。有文献表述直接把处死的鼠脑浸 泡在4 多聚甲醛溶液中固定，也有文献介绍应用在体心脏 灌流术经心脏灌注4 多聚甲醛后再浸泡固定方法。为 对比这两种方法对新生大鼠脑组织切片的影响，我们在进行 新生大鼠实验中分别应用这两种方法，观察直接
4、固定与在体 心脏灌流术后固定对新生大鼠脑组织切片的影响。 l 材料和方法 1 1 材料多聚甲醛由广州化学试剂厂生产，4 多聚甲醛 临用前配制，配制后过滤去除小的杂质，配制后放置到冰箱 中，冷却到4 后使用。M o t i cM e d 6 0 数码医学图像分析系 统及O l y m p u sC H C 一2 1 2 生物显微镜为日本公司生产。 1 2 动物分组7 日龄新生S D 大鼠性别不限，体重1 0 一1 5 g ，共2 0 只，由广东医学院实验动物中心提供。实验动物编 号，采用随机数字表进行随机化分为灌注组与非灌注组，每 组各1 0 只。 1 3 新生大鼠大脑组织固定与样本准备灌注组新
5、生大鼠 经乙醚吸人麻醉后固定于自制的手术木板上，置于解剖盘 中，开胸暴露并游离出心脏，切开右心房，经左心室插入灌流 针并固定，灌注同时切开小部分肝脏，先灌注冰冻无菌生理 盐水( 4 ) 3 0 5 0m L 直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出 液澄清，后再灌注冰冻( 4 ) 4 多聚甲醛3 0 5 0m L ，断头 取脑，多聚甲醛浸泡固定2 4 小时，再经7 0 、8 0 、9 5 、 1 0 0 乙醇及二甲苯浸泡，石蜡包埋。非灌注组新生大鼠经 乙醚吸人麻醉后直接断头取脑，多聚甲醛浸泡固定2 4 小时。 其它固定方法同灌注组。 1 4 样本切片与H E 染色切片自视交叉冠状平面开始， 切至出现海
6、马结构，片厚5p m ，每隔5 张取1 张，每个标本取 1 0 张，黏于多聚赖氨酸处理后的切片上，进行H E 染色观察 鼠脑组织结构。每张脑切片取左侧颞顶叶皮层及左侧海马 C A I 区中段随机各取6 个视野拍照。 2 结果 灌注组应用4 多聚甲醛灌注过程中观察到新生大鼠四 肢抽搐、四肢及尾巴僵硬、全身强直现象。灌注组新生大鼠 1 7 3 0 文章编号】0 3 6 9 ( 2 0 0 8 ) 1 5 1 7 3 0 0 2 大脑组织切片组织结构清晰，细胞核染色鲜艳，核无明显肿 胀，核浆对比度好，无共染现象，组织切片更加完整均匀，镜 下与石蜡切片相似，皮层及海马区组织、细胞形态正常。未 见扩张的
7、毛细血管。见图l 、图2 。非灌注组新生大鼠大脑 皮层及海马区组织水肿，细胞周围间隙增宽，胞体肿胀，有些 细胞境界模糊不清，细胞核着色不均，部分视野可见扩张的 毛细血管，血管内有血细胞样物。见图3 、图4 。 图1经多聚甲醛灌注后新生大鼠 大脑皮层( H E 4 0 0 ) 图2 经多聚甲醛灌注后新生大鼠 大脑海马C A l 区( H E 4 0 0J 万方数据 2 0 0 8 年8 月 中国民康医学 A u g ，2 0 0 8 第2 0 卷上半月第1 5 期 M e d i c a lJ o u r n a lo fC h i n e s eP e o p l e H e a l t h
8、V 0 1 2 0F H MN o 1 5 图3 未经多聚甲醛灌注的新生大鼠 大脑皮层( H E 4 0 0 ) 图4 未经多聚甲醛灌注的新生大鼠 大脑海马C A I 区( H E 4 0 0 ) 3 讨论 病理标本的制作和组织切片都必须先进行固定。如果 固定不佳，制片的其它程序将白费时间，没有很好的固定， H E 染色就难以进行。新生大鼠脑组织切片常用于对新生大 鼠脑形态学影响的研究，比如免疫组化、细胞凋亡等实验。 组织的固定是形态学研究中不可缺少的重要步骤。组织的 固定有以下作用：抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性，防止 自溶；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败，使细胞的蛋白 质、脂肪、糖等各
9、种成分凝固成不溶性物质，以防止物质扩散 并维持原有的组织形态结构；固定后的组织对染料有不同 的亲和力，染色后可产生不同的折射率，颜色更为清晰鲜明， 便于观察，硬化组织，便于切片旧1 。还可将抗原固定在原位。 保持其抗原性，使抗原能准确可靠地显示出来口1 。在进行动 物脑实验应用的固定剂中，最常用的是多聚甲醛H J 。有研 究认为应用4 的多聚甲醛磷酸缓冲液固定效果最好MJ 。 我们实验结果表明，应用4 多聚甲醛心脏灌注及脑标 本浸泡对新生大鼠脑组织的固定效果较好，组织切片组织结 构清晰完整，染色满意。而不用4 多聚甲醛心脏灌注仅脑 标本浸泡固定的效果就相对较差，组织水肿，细胞周围间隙 增宽，胞
10、体肿胀，有些细胞境界模糊不清，染色欠满意。说明 应用4 多聚甲醛心脏灌注这一步骤必不可少。我们分析认 为应用4 多聚甲醛心脏灌注可能有如下作用：标本血管 冲洗，减少血管内血液有形成分存留，影响切片形态学观察。 多聚甲醛经毛细血管快速渗入组织中起固定作用。而不 进行心脏灌注仅仅标本浸泡，多聚甲醛可能要经较长时间才 能渗入组织中起固定作用。尤其固定较大的标本时固定剂 需更长时间才能渗入组织中。我们应用的新生大鼠脑标本 远较大鼠小。减少组织细胞自溶现象。我们实验未观察 到明显的细胞自溶现象。但部分细胞肿胀，可能由于脑标本 尚小的原因，不排除对于较大标本会进一步发生细胞自溶现 象。 参考文献 1 刘乃
11、慧，张莉，邵颖。等在体心脏灌流术在大鼠脑组织切片观 察中的应用 J 实验动物科学与管理，2 0 0 5 ，2 2 ( 2 ) ：5 2 5 3 2 黄宏森，张超，郭晓珍，等不同固定液及固定时间对小鼠肝组 织结构的影响 J 广州医学院学报，2 0 0 7 ，3 5 ( 2 ) ：6 5 6 8 3 郁毅刚，徐如祥，姜晓丹，等固定方式对神经细胞膜N M D A R I 免疫细胞化学定位的影响 J 第一军医大学学报，2 0 0 4 ，2 4 ( 4 ) ：3 7 9 3 8 5 4 雷种，成丹丹，王百忍。等局灶性脑缺血再灌注后大鼠下丘脑 p S T A T 3 阳性神经细胞分布与局部微血管的关系 J
12、 中华麻 醉学杂志，2 0 0 7 ，2 7 ( 9 ) ：8 2 7 8 3 0 5 葛鹏飞，罗毅男，付双林，等缺血再灌注对大鼠海马C A I 及 I X ；神经元内1 9 S 蛋白酶体影响的激光扫描共聚焦显微镜研 究 J 中华神经医学杂志，2 0 0 6 ，5 ( 1 2 ) ：1 2 1 6 1 2 1 8 6 贺莉萍，郭毅，蒙艳斌，等固定剂和固定时间对石蜡包埋组织 R T P C R 检测病毒R N A 的影响 J 国外医学流行病学传 染病学分册，2 0 0 5 ，3 2 ( 1 ) ：1 1 1 5 ( 收稿日期：2 0 0 8 0 4 0 8 ) ( 上接第1 7 2 9 页) 相
13、同，许多研究发现S C H 合并有高胆固醇、高低密度胆固醇 血症者、高C 一反应蛋白血症远高于甲状腺功能正常人群。 S C H 亦与动脉粥样硬化有关MJ 。S C H 有可能通过增加心血 管的危险因素从而增加冠心病的发病率。而血脂升高对亚 临床甲状腺功能减退是否促使发生动脉粥样硬化，即对冠心 病、心肌梗死、脑梗死等发病率有无影响，在各研究中存在争 议。本研究结果亦发现S C H 患者T C 、L D L C 及T G 均有增 高，可能与心脑血管发病率上升有关。 对于S C H 患者的治疗，也有不同意见。关于治疗是否 会降低血T C 与L D L C 水平，目前尚无确切结论。目前，国 内亚l 临
14、床甲状腺功能减退的研究刚刚开始，对于发病率如此 之高的一种亚l 临床疾病，应该加强发病机制的研究，并且尽 早提出切合l 临床的治疗方案。 参考文献 1 C o o p e rD S C l i n i c a lp r a c t i c e S u b c l i n i c a lh y p o t h y r o i d i s m J N E 1 1 9 lJM e d ，2 0 0 1 ，3 4 5 ( 4 ) ：2 6 0 2 6 5 2 C a l l a r i 8G J ，M a n o w i t zN R ，M a y o rG ，e ta 1 T h eC o l o
15、r a d oT h y r o i d D i s e a s eP r e v a l e n c eS t u d y J A r c hI n t e r nM e d ，2 0 0 0 ，1 6 0 ：5 2 6 5 3 4 3 P a r l eJ V ，F r a n k l y nJ A C r o s sK W ，e ta 1 P r e v a l e n c ea n df o l l o w u po fa b n o r m a lt h y r o t r o p h i n ( T S H ) c o n c e n t r a t i o n si nt h e
16、e l d e r l yi n t h eU n i t e dg l o o m J C l i nE n d o c r i n o l ( 0 d ) ，1 9 9 1 ，3 4 ：7 7 8 3 4 R o d o n d iN ，A u j e s k yD V i t t i n g h o f fE ，e ta 1 S u b c l i n i c a lh y p o t h y r o i d i s ma n dt h er i s ko fc o r o n a r yh e a r td i s e a s e ：am e t a a n a l y s i s J T h eA m e r i c a nJ o u r n a lo fM e d i c i n e ，2 0 0 6 ，1 1 9 ：5 4 1 5 5 1 ( 收稿日期：2 0 0 8 0 4 0 3 ) 1 7 3 1 万方数据