乙型肝炎E抗原阴性慢性乙型肝炎和肝硬化患者病毒基因型及丙氨酸氨基转移酶水平分析.pdf

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1、中华肝脏病杂志2 0 0 5 年7 月第1 3 卷第7 期C h i n J H e p a t o l , J u l y 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 7 4 91 j漫 性 乙 型 肝 炎 乙型肝炎e 抗原阴性慢性乙型肝炎和肝硬化 患者病毒基因型及丙氨酸氨基转移酶 水平分析 李俊茜庄辉杜琦王小红段学章 【 摘耍】目的观察乙型肝炎e 抗原 ( HB e A g )阴性慢性乙型肝炎( C HB ) 及肝硬化患者的乙型肝炎病毒 ( HB V) 基因型及丙氨酸氨基转移酶 ( AL T)水平。 方法采用酶联免疫吸附法检测6 2 例 C HB和4 1 例肝硬 化患者HBV标

2、志物和血清AL T水平，用聚合酶链反应法检测其 HB V基因型。 结果C HB患者中，2 1 例 ( 3 3 . 9 % )为HB e A g阴性， 4 1 例 ( 6 6 . 1 % ) 为HB e A g阳性; 肝硬化患者中，2 8 例 ( 6 8 . 3 %)为H B e A g阴 性，1 3 例 ( 3 1 . 7 %)为HB e A g阳性。C HB患者中，5 3 例 ( 8 5 . 5 %)为C基因型，9 例 ( 1 4 . 5 %)为B基因型; 肝硬化患者中3 9 例 ( 9 5 . 1 %)为C基因型， 2 例 ( 4 . 9 %)为B基因型。HB e A g阴 性C H B患

3、者A L T 4 0 U / L 者的比例低于HB e Ag阳性组 ( 分别为4 7 . 6 %和8 5 . 4 %) ，差异有统计学意义 ( P G 0 . 0 1 ) o HB e A g阴性肝硬化 患者A L T 4 0 U / L者的比例低于H B e A g阳性组 ( 分别为6 4 - 3 %和9 2 . 3 %)但差异无统计学意义。 结论C H B 和肝硬化患者中，HBe Ag阴性者的比例较高，此类患者的AL T水平较低，以C基因型占优势。 【 要娜词1肝炎、乙型，慢性: 肝炎e抗原，乙型; 基因型; 丙氨酸氨基转移酶 H e p a t i t i s B v i r u s g

4、 e n o t y p e s a n d a l a n i n e a mi n o t r a n s f e r a s e l e v e l s i n H B e Ag n e g a t i v e p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d l i v e r c i r r h o s i s L I J u n - g i a n , Z HU A N G H u i , DU H e n g , W A N G X i a o - h o n g , DU A N X u e - z

5、h a n g . D e p a r t - m e n t o f Mi c r o b i o l o g y , P e k i n g U n i v e r s i ty H e a l t h S c i e n c e C e n t e r , B e ij i n g 1 0 0 0 8 3 , C h i n a E - m a i l : z h u a n g h u p u b l i c a . b j . c n i n f o . n e t A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e

6、 g e n o t y p e s o f t h e h e p a t i t i s B v i r u s ( H B V ) a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) l e v e l s o f H B e A g n e g a t i v e p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d l i v e r c i r r h o s i s . Me t h o d s H B V s e r o l o g

7、i c a l ma r k e r s a n d A L T l e v e l s w e r e d e t e c t e d i n 6 2 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d 4 1 c a s e s w i t h l i v e r c i r r h o s i s , u s i n g e n z y m e l i n k e d a b s o r b e n t i m m u n o a s s a y s a n d a n e n z y m e m e t h o

8、 d , r e s p e c t i v e l y . A p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n o f S r e g i o n w a s u s e d f o r H B V g e n o t y p i n g . R e s u l t s O f t h e 6 2 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B , 2 1 ( 3 3 . 9 % ) w e r e H B e A g n e g a t i v e , a n d 4 1 ( 6

9、 6 . 1 % ) H B e A g p o s i t i v e . A m o n g 4 1 c a s e s w i t h l i v e r c i r r h o s i s , 2 8 ( 6 8 . 3 % ) w e r e H B e A g n e g a t i v e , a n d 1 3 ( 3 1 . 7 % ) H B e A g p o s i t i v e . O f t h e s e 6 2 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B , 5 3 ( 8 5 . 5 %

10、 ) w e r e i n f e c t e d w i t h H B V g e n o t y p e C , a n d 9 ( 1 4 . 5 % ) w i t h g e n o t y p e B . T h i r t y - n i n e ( 9 5 . 1 % ) o f t h e 4 1 p a t i e n t s w i t h l i v e r c i r r h o s i s w e r e i n f e c t e d w i t h g e n o t y p e C , a n d 2 ( 4 . 9 % ) w i t h g e n o

11、 t y p e B . T h e p r o p o r t i o n o f H B e A g n e g a t i v e c h r o n i c h e p a t i t i s B p a t i e n t s w i t h A L T l e v e l 4 0 U / L w a s l o w e r t h a n t h a t o f t h e H B e A g p o s i t i v e g r o u p ( 4 7 . 6 % a n d 8 5 .4 %, r e s p e c t i v e l y ) ( P4 0 U / L o

12、f t h e n e g a t i v e p a t i e n t s w i t h l i v e r c i r r h o s i s w a s a l s o l o w e r a s c o m p a r e d t o t h a t o f t h e H B e A g p o s i t i v e p a t i e n t s , b u t t h e r e w a s n o s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s , b e c

13、a u s e o f t h e s m a l l s a m p l e s i z e ( P0 .0 5 ) . C o n c l u s i o n T h e p r o p o r t i o n o f H B e A g n e g a t i v e p a t i e n t s i s h i g h i n t h e g r o u p o f c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d l i v e r c i r r h o s i s . T h e s e p a t i e n t s h a v e r e l

14、a t i v e l y l o w A L T l e v e l s , a n d m a i n l y h a v e H B V g e n o t y p e C i n f e c t i o n . K e y w o r d s H e p a t i t i s B , c h r o n i c ; H e p a t i t i s B e a n t i g e n ; G e n o t y p e ; A l a n i n e a 而n o t r a n s f e r a s e 基金项目: 北京市科委课题 ( 1 4 0 2 0 9 2 0 0 2 0

15、 1 9 0 ) 作者单位:1 0 0 0 8 3 北京大学医学部病原生物学系 通讯作者: 庄辉， E - m a i l : z h u a n g h u p u b l i c a . b j . c n i n f o . n e t 在乙型肝炎病毒 ( H B V)自 然感染过程中， 血清 H B e A g 转阴， 抗一 H B e 转阳， 常伴随H B V复制的终 止和肝脏病变减轻， 但在一些H B e A g 阴性J漫 性乙型肝 中华肝脏病杂志2 0 0 5 年7 月第1 3 卷第7 期C h i n J H e p a t o l , J u l y 2 0 0 5 , V

16、o l 1 3 , N o . 7 炎 ( C H B ) 患者中， 血清H B V D N A持续阳性并伴有 肝脏病变。 在此类患者中， 常可检测到H B V D N A第 1 8 9 6 位核普酸G 被A置换， 从而导致前C 区基因出现 终止密码子A T G ， 导致H B e A g 不表达， 但H B V 仍持 续复制 。近年来H B e A g 阴 性C H B 患者的数量有上 升趋势。 本研究对北京解放军第三0 二医院收治的1 0 3 例C H B 和肝硬化患者的临床特征、 血清丙氨酸氨基转 移酶 ( A L T ) , H B V标志物及基因型进行分析。 资料与方法 1 .血清标

17、本来源:1 0 3 例乙型肝炎表面抗原和 H B V D N A阳性血清采自2 0 0 3 年6 一8 月在北京解放 军第三0 二医院就诊的肝病患者， 其中C H B 6 2 例， 肝 硬化4 1 例， 按2 0 0 0 年病毒性肝炎防治方案标准诊断2 10 2 . 主要试剂和引物: H B V标志物和A L T 试剂盒 均购自 上海荣盛生物技术有限公司。核酸提取采用美 国P r o m e g a 公司的D N A 提取试剂盒。 T a q p l u s D N A 聚合酶和d N T P 购自 上海生工生物工程公司。琼脂糖 为美国P r o m e g a 公司产品。 D N A分子量标

18、准D L 2 0 0 0 为日 本T a K a R a 公司产品。 引物根据H B V D N A p r e - S 到S 基因区保守序列设计， 见表1 . H B s A g , H B e A g , 抗一 H B e 、抗一 H B c 检测采用上海荣盛生物技术有限 公司生产的试剂盒， 按说明书操作。 血清A L T检测: 采用7 1 7 0 A 型自 动分析仪 旧 本日 立公司) 测定。 H B V 血清D N A的提取: 取血清1 0 0 贝， 按试剂盒说明书提 取血清D N A， 提取物溶解在4 0川无R N A酶的双蒸 水中，置一 2 0 保存备用。 3 . H B V 基因

19、型的聚合酶链反应 ( P C R ) 法分型: P C R引物序列见表1 。 第一轮P C R引物 ( 外引物) 和 第二轮P C R引物 ( 内引物) 根据S 基因 保守序列设计。 正义链和反义链为通用外引物。 混合体系A组的引物 为: B 2 , B A l R , B B l R及B C I R ， 其中B 2 为共同引 物 ( 正义链) ， 其他为型特异引物 ( 反义链) 。混合体 系B 组的引物为: B 2 R , B D 1 , B E l 和B F I ， 其中B 2 R 为共同引物，其他为型特异引物。第一轮P C R反应 体系总体积为5 0 p 1 ， 其中1 0 x P C

20、R反应液5 u l , 2 5 m mo l / L d N T P s 0 . 2 p 1 , 2 5 u mo l / L 正义链和反 义链引物各0 . 4 u 1 , T a q p l u s D N A聚合酶 ( 5 U / u 1 ) 0 . 2 A l , D N A提取液5 u 1 ， 补足灭菌双蒸水至5 0 p l o 循环参数为: 首先9 4 预变性3 m i n ，然后按9 4 1C 4 0 s , 5 3 C 4 0 s , 7 2 C 4 5 s ，扩增3 5 个循环， 最后延 伸7 m i n 。 第二轮P C R 分混合体系A组和混合体系B2 组进行， 每组样品反

21、应体系为3 0 P 1 。 混合体系A组的 组成如下 : 1 0 x P C R 反应液3 d , 2 5 m m o l / L d N T P s 0 . 1 2 u 1 ， 2 5 u mo l / L B 2 0 . 3 风， 2 5 u mo l / L B AI R、 B B I R和B C I R各0 . 2 4 u l , T a q p l u s D N A聚合酶 ( 5 U / u 1 ) 0 . 2 u 1 ， 第一轮P C R扩增产物5 u 1 ， 补足 灭菌双蒸水至3 0 风。 混合体系B 组的组成为:1 0x P C R反应液3 P I , 2 5 mmo l /

22、 L d N T P s 0 . 1 2 p 1 , 2 5 u mo l / L B 2 R 0 . 3 u 1 , 2 5 u mo l / L B D 1 、B E 1 和 B F 1 各0 . 2 4 u l , T a q p l u s D N A聚合酶 ( 5 U / u 1 ) 0 . 2 贝， 第一轮P C R扩增产物5 川， 补足灭菌双蒸水 至3 0 a 。 循环参数为: 9 4 预变性3 m i n ， 按9 4 1C 4 0 s , 5 5 0C 4 0 s , 7 2 1C 4 0 s ，扩增2 0 个循环后， 再按9 4 C 4 0 s , 7 2 1C 4 0 s

23、 ，扩增2 0 个循环， 最后延伸7 m i n , 反应结束后， 分别取混合体系A , B 的扩增产物1 0 贝， 并加至3 0 g / L 琼脂糖凝胶中 进行电 泳， 嗅化乙锭染色， 凝胶成像仪下观察结果并照相。 为确证本法可靠性， 曾 用本法和S 区序列测定法对1 0 份C H B 患者的血清 ( 包 括1 株A型、1 株B , C 混合型， 2 株B型和6 株C 型) 进行了基因分型， 两法分型结果完全一致3 1 0 结果 1 . H B e A g 阳性与阴性C H B 患者特征比较: 6 2 例 表1 聚合酶链反应分型法的引物序列 引物 第一轮聚合酶链反应 第二轮聚合酶链反应混合体

24、系A 混合体系 B 正 义 链 反 义 链 B2 BAI R BBI R BCI R B2 R BDI BEI BFI 序 列 5 - A A C A AG A G C T AC A G C A T G G G - 3 ( 通用引物) 5 - T T AA AC G C C G C A G AC AC A T C C - 3 ( 通用引物) 5 - G GC T C MAG T T C MG G AAC AG T - 3 ( A, B和C型通用引物) 5 一 C T C G C G G A G A T T G AC G A G A T G T - 3 ( A型特异性) 5 一 C A G G

25、T T G G T G A G T G AC T G G A G A- 3 ( B型特异性) 5 一 G G T C C T AG G A A T C C T G A T G T T G - 3 ( C型特异性) 5 - G G AG GC G G A T Y T G C T G GC A A - 3 ( D, E和F型通用引物) 5 一 G C C A AC A A G G T A G C T 一 3 ( D型特异性) 5 一 C AC C AG AA A TC C G A G T T G G A AC C A 一 3 ( E型特异性) 5 一 AT G GG AC T G AAT C TC

26、 / T TC T G TG 一 3 ( F型特异性) 中华肝脏病杂志2 0 0 5 年7 月第1 3 卷第7 期C h i n J H e p a t o l , J u l y 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 7 C H B患者中， 2 1 例 ( 3 3 . 9 % )为H B e A g 阴性， 4 1 例 ( 6 6 . 1 % ) 为H B e A g 阳性; 4 1 例肝硬化患者中， 2 8 例 ( 6 8 . 3 % ) 为H B e A g 阴 性， 1 3 例 ( 3 1 . 7 % ) 为H B e A g 阳 性。在C H B 患者中， H B

27、e A g 阴性组的平均年龄为 3 9 . 2 岁， H B e A g 阳 性组为2 7 . 9 岁， 差异有统计学意 义，t = 2 . 2 3 1 , P 4 0 U / L ; 4 1 例H B e A g阳性 C H B患者中，3 5 例 ( 8 5 . 4 % ) A L T4 0 U / L ， 差异有统计学意义， 、 z =8 . 1 2 3 ， PG 0 . 0 1 。 2 8 例H B e A g 阴 性肝硬化患者 中， 1 8 例 ( 6 4 . 3 % ) A L T 4 0 U / L ; 1 3 例H B e A g阳 性肝硬化患者中，1 2 例 ( 9 2 . 3

28、 % ) A L T 4 0 U / L , 差异无统计学意义，、 “ 二2 . 6 8 8 , P 0 . 0 5 0 讨论 H B e A g 阴 性C H B 分布与地域有关。 地中 海地区、 意大利、日 本和我国香港H B e A g 阴性C H B 患者的比 例较高1 , 4 , 5 j ， 但美国却极少发现H B e A g 阴性C H B 患 者6 。本研究检测6 2 例C H B和4 1 例肝硬化患者，其 H B e A g阴性者的比例分别占3 3 . 9 %和6 8 . 3 %，提示 H B e A g 阴性可能与乙型肝炎慢性化有关。 在HB e A g阴性 C H B和肝硬

29、化患者中，A L T升 高者的比例低于H B e A g阳性组 ( 分别为4 7 . 6 %和 8 5 . 4 % , 6 4 . 3 %和9 2 . 3 % ) ， 提示H B e A g 阴性C H B 和 肝硬化患者伴有不同程度的肝损害，但其活动程度低 于H B e A g 阳 性组。 有报道应用干扰素治疗H B e A g 阴 性C H B 患者， 可有效抑制H B V 复制， 使A L T 正常化， 但停药后易引起复发il l a 感染C 基因型H B V后易发展成C H B 、肝硬化和 肝癌18 1 。许军等19 1报道 C H B患者的C基因型比例明显 高于H B V慢性携带者。

30、本研究表明， H B e A g 阳性和 阴性的C H B 和肝硬化患者均以C 基因型为主， 提示C 基因型感染可能与乙型肝炎慢性化有关，但尚需对感 染C 基因型与其他基因型的乙型肝炎患者进行前瞻性 研究加以证实。 参考文 献 1 Y o o B C , P a r k J W, K i m H J , e t a l . P r e c o r e a n d c o r e p r o m o t e r m u t a - t i o n s o f h e p a t i t i s B v i r u s a n d h e p a t i t i s B e a n t i g e

31、 n - n e g a t i v e c h r o n i c h e p a t i t i s B i n K o r e a . J H e p a t o l , 2 0 0 3 , 3 8 : 9 8 - 1 0 3 . 2 C h i n e s e S o c i e t y o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s a n d P a r a s i t o l o g y a n d C h i n e s e S o c i e t y o f H e p a t o l o g y o f C h i n e s e Me d

32、i c a l A s s o c i a t i o n . T h e p r o g a m me o f p r e v e n t i o n a n d c u r e f o r v i r a l h e p a t i t i s . Z h o n g h u a G a n z a n g b i n g Z a z h i , 2 0 0 0 , 8 : 3 2 4 - 3 2 9 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性 肝炎防治方案.中 华肝脏病杂志，2 0 0 0 , 8 :3 2 4 - 3 2 9 . 3 Wa n g X H , H e Z P

33、 , Z h u a n g H , e t a l . E s t a b l i s h m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f a g e n o t y p i n g m e t h e d f o r h e p a t i t i s B v i r u s u s i n g p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . Z h o n g h u a G a n z a n g b i n g Z a z h i , 2 0 0 3 , 1 1 : 3 1 0 - 3 1 1 . 王小红

34、，何忠平，庄辉，等. 乙型肝炎病毒聚合酶链反应基因 分型法的建立及应用.中 华肝脏病杂志，2 0 0 3 , 1 1 :3 1 0 - 3 1 1 . 4 H u n t C M, Mc G i l l J M, A l l e n MI , e t a l . C l i n i c a l r e l e v a n c e o f h e p a t i t i s B v i r a l m u t a t i o n s . H e p a t o l o g y , 2 0 0 0 , 3 1 : 1 0 3 7 - 1 0 4 4 . 5 G a e t a G B , S t

35、o r n a i u o l o G , P r e c o n e D F , e t a l . E p i d e m i o l o g i c a l a n d c l i n i c a l b u r d e n o f c h r o n i c h e p a t i t i s B v i r u s / h e p a t i t i s C v ir u s i n f e c t i o n . A m u l t i c e n t e r I t a l i a n s t u d y . J H e p a t o l , 2 0 0 3 , 3 9 : 1

36、 0 3 6 - 1 0 4 1 . 6 C h a n H L , H u s s a i n M, L o k A S . D i f f e r e n t h e p a t i t i s B v i r u s g e n o t y p e s a r e a s s o c i a t e d w i t h d i f f e r e n t m u t a t i o n s i n t h e c o r e p r o m o t e r a n d p r e c o r e r e g i o n s d u r i n g h e p a t i t i s B

37、e a n t i g e n s e r o c o n v e r s i o n . H e p a t o l o g y , 1 9 9 9 , 2 9 : 9 7 6 - 9 8 4 . 7 T a s s o p o u l o s N C , V o l p e s R , P a s t o r e G , e t a l . E f f i c a c y o f l a m i v u d i n e i n p a t i e n t s w i t h h e p a t i t i s B e a n t i g e n - n e g a t i v e / h

38、e p a t i t i s B v i r u s D N A - p o s i t i v e ( p r e c o r e m u t a n t ) c h r o n i c h e p a t i t i s B . L a m i v u d i n e P r e c o r e Mu t a n t S t u d y G r o u p . H e p a t o l o g y , 1 9 9 9 , 2 9 : 8 8 9 - 8 9 6 . 8 C h a n H L , T s a n g S W, L i e w C T , e t a l . V i r

39、a l g e n o t y p e a n d h e p a t i t i s B v i r u s D N A l e v e l s a r e c o r r e l a t e d w i t h h i s t o l o g i c a l l i v e r d a m a g e i n H B e A g - n e g a t i v e c h r o n i c h e p a t i t i s B v i r u s i n f e c t i o n . A m J G a s t r o e n t e r o l , 2 0 0 2 , 9 7 :

40、4 0 6 - 4 1 2 . 9 X u J , Wa n g Q X , J i a n g D , e t a l . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e g e n o t y p e s o f h e p a t i t i s B v i r u s a n d t h e s e v e r i t y o f l i v e r d i s e a s e s . Z h o n g h u a G a n z a n g b i n g Z a z h i , 2 0 0 3 , 1 1 : 1 1 一 1 3 . 许军， 王齐欣， 蒋栋， 等. 乙型肝炎病毒基因型与病情轻重 的关系.中 华肝脏病杂志，2 0 0 3 , 1 1 :1 1 一 1 3 . ( 收稿日 期: 2 0 0 4 - 0 8 - 1 6 ) ( 本文编辑: 袁平戈)