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1、中华肝脏病杂志2 0 0 5 年7 月第1 3 卷第7 期C h i n J H e p a t o l , J u l y 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 7 4 91 j漫 性 乙 型 肝 炎 乙型肝炎e 抗原阴性慢性乙型肝炎和肝硬化 患者病毒基因型及丙氨酸氨基转移酶 水平分析 李俊茜庄辉杜琦王小红段学章 【 摘耍】目的观察乙型肝炎e 抗原 ( HB e A g )阴性慢性乙型肝炎( C HB ) 及肝硬化患者的乙型肝炎病毒 ( HB V) 基因型及丙氨酸氨基转移酶 ( AL T)水平。 方法采用酶联免疫吸附法检测6 2 例 C HB和4 1 例肝硬 化患者HBV标
2、志物和血清AL T水平,用聚合酶链反应法检测其 HB V基因型。 结果C HB患者中,2 1 例 ( 3 3 . 9 % )为HB e A g阴性, 4 1 例 ( 6 6 . 1 % ) 为HB e A g阳性; 肝硬化患者中,2 8 例 ( 6 8 . 3 %)为H B e A g阴 性,1 3 例 ( 3 1 . 7 %)为HB e A g阳性。C HB患者中,5 3 例 ( 8 5 . 5 %)为C基因型,9 例 ( 1 4 . 5 %)为B基因型; 肝硬化患者中3 9 例 ( 9 5 . 1 %)为C基因型, 2 例 ( 4 . 9 %)为B基因型。HB e A g阴 性C H B患
3、者A L T 4 0 U / L 者的比例低于HB e Ag阳性组 ( 分别为4 7 . 6 %和8 5 . 4 %) ,差异有统计学意义 ( P G 0 . 0 1 ) o HB e A g阴性肝硬化 患者A L T 4 0 U / L者的比例低于H B e A g阳性组 ( 分别为6 4 - 3 %和9 2 . 3 %)但差异无统计学意义。 结论C H B 和肝硬化患者中,HBe Ag阴性者的比例较高,此类患者的AL T水平较低,以C基因型占优势。 【 要娜词1肝炎、乙型,慢性: 肝炎e抗原,乙型; 基因型; 丙氨酸氨基转移酶 H e p a t i t i s B v i r u s g
4、 e n o t y p e s a n d a l a n i n e a mi n o t r a n s f e r a s e l e v e l s i n H B e Ag n e g a t i v e p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d l i v e r c i r r h o s i s L I J u n - g i a n , Z HU A N G H u i , DU H e n g , W A N G X i a o - h o n g , DU A N X u e - z
5、h a n g . D e p a r t - m e n t o f Mi c r o b i o l o g y , P e k i n g U n i v e r s i ty H e a l t h S c i e n c e C e n t e r , B e ij i n g 1 0 0 0 8 3 , C h i n a E - m a i l : z h u a n g h u p u b l i c a . b j . c n i n f o . n e t A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e
6、 g e n o t y p e s o f t h e h e p a t i t i s B v i r u s ( H B V ) a n d a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ( A L T ) l e v e l s o f H B e A g n e g a t i v e p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d l i v e r c i r r h o s i s . Me t h o d s H B V s e r o l o g
7、i c a l ma r k e r s a n d A L T l e v e l s w e r e d e t e c t e d i n 6 2 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d 4 1 c a s e s w i t h l i v e r c i r r h o s i s , u s i n g e n z y m e l i n k e d a b s o r b e n t i m m u n o a s s a y s a n d a n e n z y m e m e t h o
8、 d , r e s p e c t i v e l y . A p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n o f S r e g i o n w a s u s e d f o r H B V g e n o t y p i n g . R e s u l t s O f t h e 6 2 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B , 2 1 ( 3 3 . 9 % ) w e r e H B e A g n e g a t i v e , a n d 4 1 ( 6
9、 6 . 1 % ) H B e A g p o s i t i v e . A m o n g 4 1 c a s e s w i t h l i v e r c i r r h o s i s , 2 8 ( 6 8 . 3 % ) w e r e H B e A g n e g a t i v e , a n d 1 3 ( 3 1 . 7 % ) H B e A g p o s i t i v e . O f t h e s e 6 2 p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B , 5 3 ( 8 5 . 5 %
10、 ) w e r e i n f e c t e d w i t h H B V g e n o t y p e C , a n d 9 ( 1 4 . 5 % ) w i t h g e n o t y p e B . T h i r t y - n i n e ( 9 5 . 1 % ) o f t h e 4 1 p a t i e n t s w i t h l i v e r c i r r h o s i s w e r e i n f e c t e d w i t h g e n o t y p e C , a n d 2 ( 4 . 9 % ) w i t h g e n o
11、 t y p e B . T h e p r o p o r t i o n o f H B e A g n e g a t i v e c h r o n i c h e p a t i t i s B p a t i e n t s w i t h A L T l e v e l 4 0 U / L w a s l o w e r t h a n t h a t o f t h e H B e A g p o s i t i v e g r o u p ( 4 7 . 6 % a n d 8 5 .4 %, r e s p e c t i v e l y ) ( P4 0 U / L o
12、f t h e n e g a t i v e p a t i e n t s w i t h l i v e r c i r r h o s i s w a s a l s o l o w e r a s c o m p a r e d t o t h a t o f t h e H B e A g p o s i t i v e p a t i e n t s , b u t t h e r e w a s n o s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s , b e c
13、a u s e o f t h e s m a l l s a m p l e s i z e ( P0 .0 5 ) . C o n c l u s i o n T h e p r o p o r t i o n o f H B e A g n e g a t i v e p a t i e n t s i s h i g h i n t h e g r o u p o f c h r o n i c h e p a t i t i s B a n d l i v e r c i r r h o s i s . T h e s e p a t i e n t s h a v e r e l
14、a t i v e l y l o w A L T l e v e l s , a n d m a i n l y h a v e H B V g e n o t y p e C i n f e c t i o n . K e y w o r d s H e p a t i t i s B , c h r o n i c ; H e p a t i t i s B e a n t i g e n ; G e n o t y p e ; A l a n i n e a 而n o t r a n s f e r a s e 基金项目: 北京市科委课题 ( 1 4 0 2 0 9 2 0 0 2 0
15、 1 9 0 ) 作者单位:1 0 0 0 8 3 北京大学医学部病原生物学系 通讯作者: 庄辉, E - m a i l : z h u a n g h u p u b l i c a . b j . c n i n f o . n e t 在乙型肝炎病毒 ( H B V)自 然感染过程中, 血清 H B e A g 转阴, 抗一 H B e 转阳, 常伴随H B V复制的终 止和肝脏病变减轻, 但在一些H B e A g 阴性J漫 性乙型肝 中华肝脏病杂志2 0 0 5 年7 月第1 3 卷第7 期C h i n J H e p a t o l , J u l y 2 0 0 5 , V
16、o l 1 3 , N o . 7 炎 ( C H B ) 患者中, 血清H B V D N A持续阳性并伴有 肝脏病变。 在此类患者中, 常可检测到H B V D N A第 1 8 9 6 位核普酸G 被A置换, 从而导致前C 区基因出现 终止密码子A T G , 导致H B e A g 不表达, 但H B V 仍持 续复制 。近年来H B e A g 阴 性C H B 患者的数量有上 升趋势。 本研究对北京解放军第三0 二医院收治的1 0 3 例C H B 和肝硬化患者的临床特征、 血清丙氨酸氨基转 移酶 ( A L T ) , H B V标志物及基因型进行分析。 资料与方法 1 .血清标
17、本来源:1 0 3 例乙型肝炎表面抗原和 H B V D N A阳性血清采自2 0 0 3 年6 一8 月在北京解放 军第三0 二医院就诊的肝病患者, 其中C H B 6 2 例, 肝 硬化4 1 例, 按2 0 0 0 年病毒性肝炎防治方案标准诊断2 10 2 . 主要试剂和引物: H B V标志物和A L T 试剂盒 均购自 上海荣盛生物技术有限公司。核酸提取采用美 国P r o m e g a 公司的D N A 提取试剂盒。 T a q p l u s D N A 聚合酶和d N T P 购自 上海生工生物工程公司。琼脂糖 为美国P r o m e g a 公司产品。 D N A分子量标
18、准D L 2 0 0 0 为日 本T a K a R a 公司产品。 引物根据H B V D N A p r e - S 到S 基因区保守序列设计, 见表1 . H B s A g , H B e A g , 抗一 H B e 、抗一 H B c 检测采用上海荣盛生物技术有限 公司生产的试剂盒, 按说明书操作。 血清A L T检测: 采用7 1 7 0 A 型自 动分析仪 旧 本日 立公司) 测定。 H B V 血清D N A的提取: 取血清1 0 0 贝, 按试剂盒说明书提 取血清D N A, 提取物溶解在4 0川无R N A酶的双蒸 水中,置一 2 0 保存备用。 3 . H B V 基因
19、型的聚合酶链反应 ( P C R ) 法分型: P C R引物序列见表1 。 第一轮P C R引物 ( 外引物) 和 第二轮P C R引物 ( 内引物) 根据S 基因 保守序列设计。 正义链和反义链为通用外引物。 混合体系A组的引物 为: B 2 , B A l R , B B l R及B C I R , 其中B 2 为共同引 物 ( 正义链) , 其他为型特异引物 ( 反义链) 。混合体 系B 组的引物为: B 2 R , B D 1 , B E l 和B F I , 其中B 2 R 为共同引物,其他为型特异引物。第一轮P C R反应 体系总体积为5 0 p 1 , 其中1 0 x P C
20、R反应液5 u l , 2 5 m mo l / L d N T P s 0 . 2 p 1 , 2 5 u mo l / L 正义链和反 义链引物各0 . 4 u 1 , T a q p l u s D N A聚合酶 ( 5 U / u 1 ) 0 . 2 A l , D N A提取液5 u 1 , 补足灭菌双蒸水至5 0 p l o 循环参数为: 首先9 4 预变性3 m i n ,然后按9 4 1C 4 0 s , 5 3 C 4 0 s , 7 2 C 4 5 s ,扩增3 5 个循环, 最后延 伸7 m i n 。 第二轮P C R 分混合体系A组和混合体系B2 组进行, 每组样品反
21、应体系为3 0 P 1 。 混合体系A组的 组成如下 : 1 0 x P C R 反应液3 d , 2 5 m m o l / L d N T P s 0 . 1 2 u 1 , 2 5 u mo l / L B 2 0 . 3 风, 2 5 u mo l / L B AI R、 B B I R和B C I R各0 . 2 4 u l , T a q p l u s D N A聚合酶 ( 5 U / u 1 ) 0 . 2 u 1 , 第一轮P C R扩增产物5 u 1 , 补足 灭菌双蒸水至3 0 风。 混合体系B 组的组成为:1 0x P C R反应液3 P I , 2 5 mmo l /
22、 L d N T P s 0 . 1 2 p 1 , 2 5 u mo l / L B 2 R 0 . 3 u 1 , 2 5 u mo l / L B D 1 、B E 1 和 B F 1 各0 . 2 4 u l , T a q p l u s D N A聚合酶 ( 5 U / u 1 ) 0 . 2 贝, 第一轮P C R扩增产物5 川, 补足灭菌双蒸水 至3 0 a 。 循环参数为: 9 4 预变性3 m i n , 按9 4 1C 4 0 s , 5 5 0C 4 0 s , 7 2 1C 4 0 s ,扩增2 0 个循环后, 再按9 4 C 4 0 s , 7 2 1C 4 0 s
23、 ,扩增2 0 个循环, 最后延伸7 m i n , 反应结束后, 分别取混合体系A , B 的扩增产物1 0 贝, 并加至3 0 g / L 琼脂糖凝胶中 进行电 泳, 嗅化乙锭染色, 凝胶成像仪下观察结果并照相。 为确证本法可靠性, 曾 用本法和S 区序列测定法对1 0 份C H B 患者的血清 ( 包 括1 株A型、1 株B , C 混合型, 2 株B型和6 株C 型) 进行了基因分型, 两法分型结果完全一致3 1 0 结果 1 . H B e A g 阳性与阴性C H B 患者特征比较: 6 2 例 表1 聚合酶链反应分型法的引物序列 引物 第一轮聚合酶链反应 第二轮聚合酶链反应混合体
24、系A 混合体系 B 正 义 链 反 义 链 B2 BAI R BBI R BCI R B2 R BDI BEI BFI 序 列 5 - A A C A AG A G C T AC A G C A T G G G - 3 ( 通用引物) 5 - T T AA AC G C C G C A G AC AC A T C C - 3 ( 通用引物) 5 - G GC T C MAG T T C MG G AAC AG T - 3 ( A, B和C型通用引物) 5 一 C T C G C G G A G A T T G AC G A G A T G T - 3 ( A型特异性) 5 一 C A G G
25、T T G G T G A G T G AC T G G A G A- 3 ( B型特异性) 5 一 G G T C C T AG G A A T C C T G A T G T T G - 3 ( C型特异性) 5 - G G AG GC G G A T Y T G C T G GC A A - 3 ( D, E和F型通用引物) 5 一 G C C A AC A A G G T A G C T 一 3 ( D型特异性) 5 一 C AC C AG AA A TC C G A G T T G G A AC C A 一 3 ( E型特异性) 5 一 AT G GG AC T G AAT C TC
26、 / T TC T G TG 一 3 ( F型特异性) 中华肝脏病杂志2 0 0 5 年7 月第1 3 卷第7 期C h i n J H e p a t o l , J u l y 2 0 0 5 , V o l 1 3 , N o . 7 C H B患者中, 2 1 例 ( 3 3 . 9 % )为H B e A g 阴性, 4 1 例 ( 6 6 . 1 % ) 为H B e A g 阳性; 4 1 例肝硬化患者中, 2 8 例 ( 6 8 . 3 % ) 为H B e A g 阴 性, 1 3 例 ( 3 1 . 7 % ) 为H B e A g 阳 性。在C H B 患者中, H B
27、e A g 阴性组的平均年龄为 3 9 . 2 岁, H B e A g 阳 性组为2 7 . 9 岁, 差异有统计学意 义,t = 2 . 2 3 1 , P 4 0 U / L ; 4 1 例H B e A g阳性 C H B患者中,3 5 例 ( 8 5 . 4 % ) A L T4 0 U / L , 差异有统计学意义, 、 z =8 . 1 2 3 , PG 0 . 0 1 。 2 8 例H B e A g 阴 性肝硬化患者 中, 1 8 例 ( 6 4 . 3 % ) A L T 4 0 U / L ; 1 3 例H B e A g阳 性肝硬化患者中,1 2 例 ( 9 2 . 3
28、 % ) A L T 4 0 U / L , 差异无统计学意义,、 “ 二2 . 6 8 8 , P 0 . 0 5 0 讨论 H B e A g 阴 性C H B 分布与地域有关。 地中 海地区、 意大利、日 本和我国香港H B e A g 阴性C H B 患者的比 例较高1 , 4 , 5 j , 但美国却极少发现H B e A g 阴性C H B 患 者6 。本研究检测6 2 例C H B和4 1 例肝硬化患者,其 H B e A g阴性者的比例分别占3 3 . 9 %和6 8 . 3 %,提示 H B e A g 阴性可能与乙型肝炎慢性化有关。 在HB e A g阴性 C H B和肝硬
29、化患者中,A L T升 高者的比例低于H B e A g阳性组 ( 分别为4 7 . 6 %和 8 5 . 4 % , 6 4 . 3 %和9 2 . 3 % ) , 提示H B e A g 阴性C H B 和 肝硬化患者伴有不同程度的肝损害,但其活动程度低 于H B e A g 阳 性组。 有报道应用干扰素治疗H B e A g 阴 性C H B 患者, 可有效抑制H B V 复制, 使A L T 正常化, 但停药后易引起复发il l a 感染C 基因型H B V后易发展成C H B 、肝硬化和 肝癌18 1 。许军等19 1报道 C H B患者的C基因型比例明显 高于H B V慢性携带者。
30、本研究表明, H B e A g 阳性和 阴性的C H B 和肝硬化患者均以C 基因型为主, 提示C 基因型感染可能与乙型肝炎慢性化有关,但尚需对感 染C 基因型与其他基因型的乙型肝炎患者进行前瞻性 研究加以证实。 参考文 献 1 Y o o B C , P a r k J W, K i m H J , e t a l . P r e c o r e a n d c o r e p r o m o t e r m u t a - t i o n s o f h e p a t i t i s B v i r u s a n d h e p a t i t i s B e a n t i g e
31、 n - n e g a t i v e c h r o n i c h e p a t i t i s B i n K o r e a . J H e p a t o l , 2 0 0 3 , 3 8 : 9 8 - 1 0 3 . 2 C h i n e s e S o c i e t y o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s a n d P a r a s i t o l o g y a n d C h i n e s e S o c i e t y o f H e p a t o l o g y o f C h i n e s e Me d
32、i c a l A s s o c i a t i o n . T h e p r o g a m me o f p r e v e n t i o n a n d c u r e f o r v i r a l h e p a t i t i s . Z h o n g h u a G a n z a n g b i n g Z a z h i , 2 0 0 0 , 8 : 3 2 4 - 3 2 9 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性 肝炎防治方案.中 华肝脏病杂志,2 0 0 0 , 8 :3 2 4 - 3 2 9 . 3 Wa n g X H , H e Z P
33、 , Z h u a n g H , e t a l . E s t a b l i s h m e n t a n d a p p l i c a t i o n o f a g e n o t y p i n g m e t h e d f o r h e p a t i t i s B v i r u s u s i n g p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . Z h o n g h u a G a n z a n g b i n g Z a z h i , 2 0 0 3 , 1 1 : 3 1 0 - 3 1 1 . 王小红
34、,何忠平,庄辉,等. 乙型肝炎病毒聚合酶链反应基因 分型法的建立及应用.中 华肝脏病杂志,2 0 0 3 , 1 1 :3 1 0 - 3 1 1 . 4 H u n t C M, Mc G i l l J M, A l l e n MI , e t a l . C l i n i c a l r e l e v a n c e o f h e p a t i t i s B v i r a l m u t a t i o n s . H e p a t o l o g y , 2 0 0 0 , 3 1 : 1 0 3 7 - 1 0 4 4 . 5 G a e t a G B , S t
35、o r n a i u o l o G , P r e c o n e D F , e t a l . E p i d e m i o l o g i c a l a n d c l i n i c a l b u r d e n o f c h r o n i c h e p a t i t i s B v i r u s / h e p a t i t i s C v ir u s i n f e c t i o n . A m u l t i c e n t e r I t a l i a n s t u d y . J H e p a t o l , 2 0 0 3 , 3 9 : 1
36、 0 3 6 - 1 0 4 1 . 6 C h a n H L , H u s s a i n M, L o k A S . D i f f e r e n t h e p a t i t i s B v i r u s g e n o t y p e s a r e a s s o c i a t e d w i t h d i f f e r e n t m u t a t i o n s i n t h e c o r e p r o m o t e r a n d p r e c o r e r e g i o n s d u r i n g h e p a t i t i s B
37、e a n t i g e n s e r o c o n v e r s i o n . H e p a t o l o g y , 1 9 9 9 , 2 9 : 9 7 6 - 9 8 4 . 7 T a s s o p o u l o s N C , V o l p e s R , P a s t o r e G , e t a l . E f f i c a c y o f l a m i v u d i n e i n p a t i e n t s w i t h h e p a t i t i s B e a n t i g e n - n e g a t i v e / h
38、e p a t i t i s B v i r u s D N A - p o s i t i v e ( p r e c o r e m u t a n t ) c h r o n i c h e p a t i t i s B . L a m i v u d i n e P r e c o r e Mu t a n t S t u d y G r o u p . H e p a t o l o g y , 1 9 9 9 , 2 9 : 8 8 9 - 8 9 6 . 8 C h a n H L , T s a n g S W, L i e w C T , e t a l . V i r
39、a l g e n o t y p e a n d h e p a t i t i s B v i r u s D N A l e v e l s a r e c o r r e l a t e d w i t h h i s t o l o g i c a l l i v e r d a m a g e i n H B e A g - n e g a t i v e c h r o n i c h e p a t i t i s B v i r u s i n f e c t i o n . A m J G a s t r o e n t e r o l , 2 0 0 2 , 9 7 :
40、4 0 6 - 4 1 2 . 9 X u J , Wa n g Q X , J i a n g D , e t a l . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e g e n o t y p e s o f h e p a t i t i s B v i r u s a n d t h e s e v e r i t y o f l i v e r d i s e a s e s . Z h o n g h u a G a n z a n g b i n g Z a z h i , 2 0 0 3 , 1 1 : 1 1 一 1 3 . 许军, 王齐欣, 蒋栋, 等. 乙型肝炎病毒基因型与病情轻重 的关系.中 华肝脏病杂志,2 0 0 3 , 1 1 :1 1 一 1 3 . ( 收稿日 期: 2 0 0 4 - 0 8 - 1 6 ) ( 本文编辑: 袁平戈)