人16型乳头瘤病毒假病毒的制备.pdf

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1、北京大学学报 （自然科学版） ， 第 42 卷， 第 2 期， 2006 年 3 月 Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis，Vol.42，No.2（Mar. 2006） 收稿日期： 2005-06-17；修回日期：2005-12-13 人 16 型乳头瘤病毒 “假病毒” 的制备 秦焱崔红莲胡美浩 （北京大学生命科学学院， 北京， 100871） 摘要利用杆状病毒表达体系， 在 sf9 细胞中表达人 16 型乳头瘤病毒 （Human Papillomavirus type 16，HPV16） 的晚 期表达蛋白 L1， 通过超速离

2、心的方法得到 HPV16 病毒样颗粒 （virus like particles，VLPs） 。VLPs 经过 DTT 和 EDTA 处 理解聚成 L1 蛋白， 将构建好的真核表达载体 E6E7-pcDNA3.1 + 与解聚的 L1 蛋白混合， 透析除去 DTT 和 EDTA 并逐 渐升高 Ca2 +的浓度， 解聚的 L1 能够重新聚集成 VLPs， 其中一部分 VLPs 包裹了真核表达载体， 和天然的人乳头瘤病 毒的构成很相似， 作者称之为 “假病毒” 。 关键词人 16 型乳头瘤病毒；杆状病毒表达系统；假病毒 中图分类号S 852.65 In Vitro Construction of P

3、seudovirions of Human Papillomavirus Type 16 QIN YanCUI HonglianHU Meihao （College of life sciences，Peking University，Beijing，100871） AbstractThe L1 major capsid protein of human papillomavirus type 16 was expressed in sf9 insect cells by recombinant baculoviruses and self-assembled into virus-like

4、particles（VLPs） . The VLPs were harvested by CsCl ultracentrifugation and were disassembled with DTT and EDTA. A reassembled process was performed by removing DTT and EDTA in the presence of E6E7- pcDNA3.1 + plasmid and Ca2 +. The novel VLPs，in which the plasmid was packed，were named HPV16 pseudovir

5、us. Key wordshuman papillomavirus type 16；baculovirus expression system；pseudovirus 人乳头瘤病毒 （Human papillomavirus，HPV） ， 属 于乳多空病毒科 （Papillomaviridae） A 属。人乳头瘤 病毒为 DNA 病毒， 病毒粒子比较小， 没有包膜， 其病 毒粒子呈二十面体对称 （T = 7） ， 由 72 个壳粒， 即 60 个六邻体壳粒和 12 个五邻体壳粒构成， 直径为 52 55 nm。乳头瘤病毒至少有 2 种结构蛋白， 其中主要 外壳蛋白 L1 分子量为 55 kD，

6、 大约占病毒结构蛋白 总量的 80%， 另一种次要的结构蛋白 L2 分子量为 70 kD。在病毒壳体内包含环状双链 DNA， 约为8 kb。 HPV 目前约有 100 种分型 1。它们均为趋上皮细胞 病毒， 只感染特定类型的上皮并引起上皮增殖， 因此 能够引起人类皮肤或粘膜形成多种良性疣甚至诱发 产生恶性肿瘤 29。因此， 预防 HPV 的感染的研究 无论在理论上和临床上都具有很重要的意义。本实 验构建了一种组成上模拟了 HPV16 病毒的 “假病 毒” ， 这种 “假病毒” 的外壳是由 HPV16 的 L1 蛋白组 成的病毒样颗粒 （VLPs） ， 里面包裹了作为病毒基因 组类似物的真核表达

7、载体。这种结构在很大程度上 模仿了天然的 HPV16 病毒， 但由于不包含有病毒的 完整基因组， 所以不具有病毒的危险性， 而且不能够 复制。这种 “假病毒” 可以进一步用来研究对动物模 型的免疫保护作用， 以期得到一种预防 HPV16 感染 的手段。 1实验材料与方法 1.1实验材料 1.1.1质粒、 细胞和线性病毒 穿梭 质 粒 pBacPAK8 由 本 实 验 室 保 存； E6E7- pcDNA3.1 + 质粒由本实验室构建， 大小约为 6.5 kb； sf9 昆虫细胞由本实验室保存。 1.1.2实验试剂 Benzonase 购自 Sigma 公司 （美国） ； anti-HPV16

8、L1 单克隆抗体购自 Labvision 公司 （美国） ； 昆虫细胞 081 培养基 TNM-FH 购自 Gibco 公司（美国） ； pBacPAK8 DNA Kit 购自 BD 公司 （美国） ； AP-羊抗小鼠 IgG 及碱 性磷酸酶底物试剂盒购自华美生物工程公司； 其余 试剂从北京大学生物系器材室领取。 1.2实验方法 1.2.1利用昆虫细胞表达 HPV16 VLPs 参照文献报道的方法 10采用杆状病毒表达系 统表达组装 HPV16 VLPs。利用重组的杆状病毒感 染 sf9 昆虫细胞， 4 d 后收集细胞， 室温下利用 0.5% 的 NP-40 处理 15 min， 通过低速离心

9、得到细胞核组 分 （沉淀） 。沉淀加入缓冲液， 用超声波处理后离心 除去不溶物。上清加入到 30% CsCl 溶液上， 采用 Beckman SW32 转头 20 h， 25 000 rpm， 4 进行超速离 心。离心后可见一乳白色条带， 将条带吸出后透析， 采用 SDS-PAGE、 Western-blotting 和 ELISA 进行鉴定。 1.2.2VLPs 的解聚和假病毒的组装 100g 的 HPV16 VLPs 用 解 离 缓 冲 液 （pH7.5 Tris-HCl，0.15 mol/ L NaCl， 1 mmol/ L EDTA， 20 mmol/ L DTT） 室温透析2 h。

10、然后向已经解离的衣壳 粒中加入 100g 的真核表达质粒 DNA， 采用 5 mmol/ L 的 CaCl2室温透析过夜。超速离心后， 收集组分进 行 ELISA 鉴定。 “假病毒” 由于包裹了质粒 DNA， 沉 降密度要略大于 VLPs。 为了验证是否有质粒 DNA 包裹进 “假病毒” 中， 重新包裹完成后， 先使用 10 IU Benzonase 20 反应 1 h， 除去没有被包裹和吸附在 VLPs 上的质粒 DNA， 向混合物中加入 SDS （3%） 和蛋白酶 K （1 mg/ mL） ， 56 水浴 2 h。使用酚-氯仿抽提， 乙醇沉淀的方法 得到质粒 DNA， 利用电泳进行鉴定。

11、1.2.3电子显微镜观察样品 将需要观察的样品进行透析除去其中的高浓度 盐分； 吸取 10L 样品滴于铜网支持的碳膜上， 40 s 后用滤纸将多余的溶液吸去； 向铜网上滴加 10L 2%醋酸铀染色液， 染色 90 s 左右， 用滤纸将溶液吸 干； 晾干铜网。制备好的样品铜网放入电子显微镜 观察， 放大倍数 33 000。 2实验结果 2.1sf9 昆虫表达体系可以大量表达组装 HPV16 VLPs 通过 SDS-PAGE（图 1） 和 Western-blotting （图 2） 分析， 可以看出 HPV16 L1 蛋白可以在 sf9 种高效表 达， 并且在感染后 4 d 时， L1 蛋白的表

12、达量达到最大。 L1 蛋白在 sf9 昆虫细胞核中能够自发组装成病毒样 颗粒 VLPs， 通过超速离心得到一条乳白色条带， 这里 主要是 VLPs。透析除去 CsCl， 通过电子显微镜观察 可见直径约 55 nm 的病毒样颗粒 （图 3 （a） ） 。 15： sf9 昆虫细胞在重组杆状病毒感染后 6、 5、 4、 3 和 2 d 的细胞 裂解物；6. 使用空白杆状病毒感染 sf9 细胞裂解物；7. 低分子 量蛋白标准品 图 1 SDS-PAGE 鉴定 sf9 细胞表达 HPV16 L1 蛋白 Fig.1SDS-PAGE analysis of expression of HPV16 L1 p

13、rotein in sf9 cells 1. 空白杆状病毒感染 sf9 昆虫细胞裂解物； 2. 重组杆状病毒感染 sf9 昆虫细胞裂解物 图 2 Western-blotting 鉴定 sf9 细胞表达的 HPV16 L1 蛋白 Fig.2Western-blotting analysis of HPV16 L1 protein expression 2.2在一定条件下 VLPs 解离成单个衣壳粒 使用解离缓冲液处理病毒样颗粒， 室温透析 2 h， 电镜观察可以看到呈解离状态的病毒样颗粒亚 基 （图 3 （b） ） 。 2.3假病毒颗粒的组装 通过 ELISA 鉴定收集到的组分， 可见有 2

14、个吸 收峰 （图 4） ， 所对应的 CsCl 梯度分别为 1.28 g/ cm3 和 1.31 g/ cm3。高密度的组分是需要的 “假病毒” 颗 粒 （图 3 （c） ） 。 2. 4假 病 毒 中 包 裹 的 真 核 表 达 质 粒 抗 Benzonase 降解 从 Benzonase 水解 DNA 的结果来看， 没有被 “假 181 第 2 期秦焱等：人 16 型乳头瘤病毒 “假病毒” 的制备 病毒” 包裹的 DNA 都被完全水解， 其中也包括吸附 在 “假病毒” 表 面 的 DNA。而 包 裹 入 “假 病 毒” 的 DNA 则完整地保留下来， 这从另一个方面说明， 有 部分 DNA

15、 包裹入了 “假病毒” （图 5） 。 图 3 电子显微镜观察 HPV16 VLPs、 L1 以及假病毒 Fig.3Purified HPV16 virus-like particles and pseudovirions A. HPV16 VLPs；B. HPV16 假病毒 图 4 ELISA 鉴定超速离心分离的 VLPs 和 “假病毒” Fig.4Density in CsCl gradient of refolded VLPs 3讨论 人乳头瘤病毒的衣壳由两种晚期表达蛋白 L1 和 L2 组成。主要晚期蛋白 L1 所组成的病毒样颗粒 （VLPs） 可以和细胞表面的某些蛋白相互作用， 提高

16、 1. 包装前的真核表达载体 DNA；2. 真核表达载体 DNA；3. 未 用 Benzonase 处理的 “假病毒” 抽提出的真核表达载体 DNA；4. Benzonase 处理 “假病毒” 后抽提出的真核表达载体 DNA；5. 用 Benzonase 直接处理的真核表达载体 DNA；6. 1 kb DNA 标准样品 图 5 假病毒中包裹的真核表达质粒不被 Benzonase 降解 Fig.5Stability of VLP-encapsidated plasmid DNA against Benzonase 了吸附及内吞入细胞的效率 1113。另外， 次要晚 期蛋白 L2 也可以帮助病毒外

17、壳与细胞的作用 14。 可以看出， 整个蛋白外壳在病毒的感染过程中起着 很关键的作用。因此通过免疫反应来产生针对病毒 外壳的中和抗体， 就可以在一开始减少病毒的入侵， 达到保护效果。此外病毒侵入细胞后， 有些可能会 将病毒的一部分基因组整合到细胞的基因组当中， 这样就会持续地表达病毒蛋白 E6 和 E7， 这两种蛋 白又会直接干扰细胞周期， 引起细胞增生， 进而引发 细胞恶化。因此我们考虑是否能够制备一个 “假病 毒” ， 这个 “假病毒” 具有病毒的外壳蛋白， 内部包裹 的不是病毒的基因组， 而是经过改造的真核表达载 体， 这个载体可以表达重组的没有转化危险的 E6 和 E7 基因。用这样的

18、 “假病毒” 进行免疫， 可能诱发宿 主的体液免疫反应和细胞免疫反应。 从电镜照片上来看， 重组得到的 “假病毒” 和病 毒样颗粒 （VLPs） 在外观上没有明显差异， 采用超速 离心的方法可以将两者基本分开， 这可以从 ELISA 的结果看出来。不过纵观整个实验，“假病毒” 的产 率还不是很高， 只占总的 VLPs 的 10%左右， 很大一 部分的 VLPs 没有包裹质粒。这可能主要是因为整 个包装过程是在人工环境下， 而且我们仅使用了 L1 一种蛋白组成的 VLPs， 虽然 L1 蛋白上具有与 DNA 结合、 包装的区域 1618， 但是在次要晚期蛋白 L2 上 也有这样的区域 15， 1

19、9， 而本实验中并没有引入 L2 蛋白， 因此组装的效率就会收到明显的影响。另外， 进行包裹的真核表达质粒 DNA 也和病毒的天然 DNA 有很大不同， 虽然都是环状 DNA， 但是由于质 粒 DNA 只保留了 E6 和 E7 基因的部分， 因此就造成 一些 位 于 病 毒 DNA 上 的 与 包 装 有 关 的 序 列 丢 失 20， 21， 造成包装效率的下降。此外。HPV16 病毒 的基因组大小为 8 kb 左右， 我们构建的真核表达载 281 北 京 大 学 学 报（自 然 科 学 版）第 42 卷 体质粒大约为 6 kb 左右， 质粒大小的差异可能也会 影响到包装的效果。因此， 为了

20、进一步提高 “假病 毒” 的产率， 可以考虑将这些有关的因素都引入。 本实验构建得到了 HPV16 的 “假病毒” 颗粒， 在 此基础上， 希望进一步研究 “假病毒” 对实验动物的 免疫保护作用， 为预防 HPV 感染提供新的疫苗。 参考文献 1Chan SY， Bernard HU， Ratterree M， et al.Genomic DiversityandEvolutionofPapillomavirusesinRhesus Monkeys. J Virol，1997，71：4 938-4 943 2Pisani P，Parkin DM，Ferley J. Estimates of t

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