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1、从噬菌体抗体库中筛选血管内皮 细胞新型嘌呤受体功能抗体的研究 山丽梅， 赵艳玲， 张! 萍， 金! 城， 蔡光明， 肖小河 （解放军第 “#$ 医院药学部， 北京! %#“ :5?45?64/?%、 :/5N9 ?64/?$、 06G:V ?64/? 6b） 、 组装 7?64/? 6b、 L ?64/? 46b） 、 噬菌体载 aB*.BC23、 表达宿主菌 .H% 及辅 助噬菌体 %“cK-。 %“中国药理学通报! !“#$% 给与佐剂强化的内皮细胞裂解全蛋白 （) ?% 标记的羊抗鼠 J4“反转录 8HC6 (* !:， (* + %F? 缓冲液 $ !:，(* ,3:4 5( 1CD%
2、 $ !:，K0LM %/-,K/ ( ( !:，K0LM %/-,K/ ) ( !:， D0NHC6 聚合酶 *9 $ !:（)9 $ 单位） ， 补水至总体积 $* !:。O$P热变性 $ ,-.， O;P ( ,-.、 $P ( ,-.、 =)P ( ,-. 进行 “* 个循环， =)P延长 = ,-.。使用 胶回收试剂盒电泳纯化回收 %F? 产物并定量。 ! #! “拼接反应合成 8QL“J%F? 产物 )* . )9 * 甘氨酸缓冲液离心管中， 轻微震 荡($ ,-.， 把抗体从血管环上洗脱下来， 取出血管环 后， 用 Z _ 的 D/-WVF: 缓冲液中和。超滤法更换缓 冲环境为含
3、 )9 $ = 法蛋白定量。 “:“: $! 离体血管功能实验!采用常规离体大鼠主 动脉血管环实验， 大鼠主动脉置于盛有 ?;ABCDEF); 营养液的培养皿内， 清除血污， 仔细分离血管周围组 织， 剪成长约 - G “ ( 的动脉环， 分别将两根直径 为 #3 + ( 的不锈钢丝小心穿入， 做成三角环状， 随 后置于盛有 +# (8 ?;ABCDEF); 营养液的 -H.恒温 浴槽内， 下端固定， 上端通过张力换能器连于自动平 衡记录仪， 记录血管环肌的张力变化， 持续通入 I“,和 “, J/!混合气。?;ABCDEF); 液中的组分 为 （(78$ *+） ：KE“、 K7T“双酶切后
4、， 产物经 +3 “, 琼脂糖凝胶上的电泳 图鉴定阳性。 %! 结果 %: ! 鼠抗大鼠血管内皮细胞的单链噬菌体抗体库 的构建 %: : ! 免疫的 %46 2 )=:.)?2/ =);2 -.-A62/ BA 22;41535126)6 5. -*-1562 *2 V V +A*+4.+ 公司的鼠单链抗体系统， 构建了 小鼠抗大鼠血管内皮细胞的单链噬菌体抗体库， 所 采用的 LMN 引物是根据小鼠抗体可变区 5NE 和 5NO 保守碱基序列设计的， 可很好地扩增出整套抗 体可变区基因， 选用的 30.! =/:!限制性内切酶借 助计算机分析在免疫球蛋白数据库中的抗体可变区 基因序列中没有酶切
5、位点。这保证了本研究构建的 单链噬菌体抗体库的有效表位多样性。最终获得的 噬菌体抗体库的库容量与文献报道的同种文库相比 属于较大的文库 “， P， 这为筛选提供了有利的条件。 # # 本研究利用新型嘌呤受体在主动脉内皮细胞表 达而在平滑肌细胞不表达的特点， 先用主动脉内皮 细胞进行阳性筛选， 再用平滑肌细胞进行阴性筛选， 从噬菌体抗体库中筛选出主动脉内皮细胞特异抗 体。在筛选过程中为了增加抗原抗体接触的机会， 我们采用增加抗原的面积来增加抗原的量， 即用内 皮细胞朝外， 两端结扎的长约 QJ * 主动脉血管 环， 通过增加了噬菌颗粒与内皮细胞的广泛接触， 把 拷贝数较少或亲和力较低的抗体克隆从
6、抗体库中有 效的分离出来。 利用新型嘌呤受体具有受腺苷激活可诱发 =R 依赖的离体血管环收缩的功能特点， 在离体血管环 上进一步筛选新型嘌呤受体的特异单链抗体。得到 一株新型嘌呤受体的单链抗体， 对筛选到的新型嘌 呤受体特异单链抗体， 利用其不能拮抗嘌呤引起的 离体回肠收缩的特点， 在离体回肠收缩实验进行鉴 定， 同时采用免疫组化技术进行进一步鉴定， 初步鉴 定为新型嘌呤受体特异噬菌体 H 单链抗体。本研究 获得的中和抗体为进一步采用表达文库筛选的方法 克隆新型嘌呤受体基因提供了良好的筛选标记。相 关研究工作正在进行中。 有研究表明， =R 作为强效舒张因子在败血病 患者血清中含量明显增高，
7、抑制 =R 合成或降低其 生物活性已成为重要的治疗败血病的新策略 D。 “ES中国药理学通报# “#$!%*% 56# =? 35(25 0，L356# 0? 34-*$#* 0? (#(,- *6 )3, -)%+*,- A E%(*6 */)15:P/;P & 2*&, Q,(, *22%6*X,+ A( O )*2,- Q*)3 (5) 5()*& ,6+)3,$*5$ &,$? V3,6 )3, C35#, +*-C$54 -4-),2 Q5- %-,+ ) &6-)(%&) 5 -*6#$,.&35*6 WB A(5#2,6)（&WB）&_!/ $*7(5(4 A(2 )3, )5$
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