传染性喉气管炎病毒烟台株TK基因序列测定及TK蛋白功能初步分析.pdf

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1、第3 3卷第1 0期西北农林科技大学学报(自然科学版) Vo l . 3 3 No . 1 0 2 0 0 5年1 0月J o u r .o f No r t h we s t S c i - T e c hUn i v .o f Ag r i .a n dF o r . ( Na t .S c i .E d . )Oc t .2 0 0 5 传染性喉气管炎病毒烟台株 T K基因 序列测定及 T K蛋白功能初步分析 * 刘文波1,周斌1,黄兵1 , 2,张秀美2,张素芳1,陈溥言1 ( 1南京农业大学 农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏 南京2 1 0 0 9 5 ; 2山东省农科院

2、 家禽研究所,山东 济南2 5 0 0 2 3 ) 摘 要根据传染性喉气管炎病毒( I L T V)美国6 3 2株T K基因序列设计并合成1对引物,以I L T V烟台株 D NA为模板扩增了T K基因, 并对其进行了序列测定。将I L T V烟台株的T K基因和T K蛋白分别与I L T V美国 6 3 2株,英国T h o r n e株, B e i j i n gE 2株, B HV- 1 , E HV- 1 , E HV- 2 , F HV- 1 , HHV- 1 , HHV- 2 , HHV- 3 , HHV- 4 , HVT, MD V- 1 , MD V- 2 , P R V和

3、S HV- 2的T K基因和T K蛋白比较后发现, 其T K基因的核苷酸和T K蛋白的氨基酸同 源性分别为2 4 . 6 %9 9 . 5 %和1 5 . 1 %9 8 . 9 %,表明不同I L T V毒株之间T K基因和T K蛋白相对保守,但与其 他 -疱疹病毒的T K基因和T K蛋白同源性则较低。 关键词 传染性喉气管炎病毒;烟台株; T K基因;同源性分析 中图分类号 S 8 5 8 . 3 1 5 . 3文献标识码 A文章编号 1 6 7 1 - 9 3 8 7 ( 2 0 0 5 ) 1 0 - 0 0 7 5 - 0 5 传 染 性 喉 气 管 炎 病 毒 (I n f e c

4、t i o u s l a r y n g o t r a c t h e i t i sv i r u s , I L T V)属于疱疹病毒科, - 病毒亚科,可引起鸡的急性上呼吸道感染,病鸡表现 为呼吸困难、产蛋率下降和较高的死亡率,是危害养 禽业的重要病毒之一 1 。I L T V基因组为双股线状 D NA,长约1 5 5k b 。到目前为止,完整的基因组序列 仍然未见报道,但已有对基因组中1 1 4k b的序列进 行测序分析的报道,包括其整个短独特区 2 4 。 胸苷激酶( T h y mi d i n ek i n a s e , T K)基因是疱疹 病毒的主要毒力基因之一,也是大多

5、数疱疹病毒复 制的非必需基因。由T K基因编码的胸苷激酶是胸 腺嘧啶合成补救途径中的关键酶,能够转移 AT P 上的h -磷酸到脱氧胸苷的5 i羟基上,从而生成脱氧 胸苷5 i单磷酸和AD P 5 。该酶还可使病毒在中枢神 经系统中复制,导致疱疹病毒具有神经潜伏能力。 T K基因的缺失可使毒株毒力下降和潜伏感染能力 降低。国外已对I L T V美国6 3 2株和英国T h o r n e株 的T K基因序列和结构功能进行了研究,但国内对 I L T V各地方株的T K基因序列和结构功能报道还 较少,且报道的序列多不完整 6 , 7 。为此,本试验对 I L T V烟台株的T K基因进行了扩增、

6、 克隆和测序, 并对I L T V烟台株的T K基因和T K蛋白与已报道 的I L T V毒株及同属 -疱疹病毒亚科的其他毒株的 T K基因核苷酸和T K蛋白氨基酸序列进行了比较 分析,以期为进一步研究T K基因的功能以及研制 T K基因缺失的I L T V基因工程疫苗奠定基础。 1 材料与方法 1 . 1 质粒载体、工程菌和试验毒株 j MD 1 8 - T载体, 购自大连宝生物公司;宿主菌 D H5 ,由本室保存; I L T V烟台株,由山东省农科院 家禽研究所禽病室惠赠。 1 . 2 鸡胚 S P F鸡胚, 由山东省农科院家禽所S P F鸡场提 供。 1 . 3 酶和试剂 T k l酶

7、、 限制性内切酶m n o p和q k rHp,均购 自大连宝生物公司; D NA胶回收试剂盒,购自上海 生工公司。 1 . 4 引物的设计与合成 根据已发表的I L T V序列 6 设计并合成1对引 物,序列为P 1 s 5 i - AT At T ut Auu T tT T ut t t u t A u Au AT u- 3 i ; P 2 s 5 i - u t tu u A T t tt AT T Atu AAt t tt ATAATt Au- 3 i 。引物由大连宝 *收稿日期 2 0 0 5 - 0 2 - 2 8 作者简介 刘文波( 1 9 7 6 v) ,男,山东商河人,在读博

8、士,主要从事动物分子病毒学和免疫学研究。 通讯作者 陈溥言( 1 9 4 1 v) ,男,江苏南京人,教授,博士生导师,主要从事畜禽传染病研究。 生物公司合成,扩增T K基因长约1 . 1k b 。 1 . 5 病毒增殖及其核酸的提取 将I L T V烟台株接种于1 0日龄S P F鸡胚的绒 毛尿囊膜,收集7 2 1 2 0h富含痘斑的鸡胚尿囊膜 和尿囊液,参照文献 8 的方法提取病毒D NA,作为 P C R模板。 1 . 6 P C R扩增 在 P C R管 中 加 入1 0 P C R B u f f e r5 L , 2 5 mmo l / LMg C l24 L , 1 0mmo l

9、 / Ld NT P1 L , 上下 游引物各2 0p mo l ,模板1 L , T a qD NA聚合酶0 . 5 L ,用超纯水补至5 0 L ,置P C R仪上进行扩增。扩 增方法为: 9 4预变性5mi n ;然后9 4 4 5s , 6 5 1mi n , 7 2延伸1mi n , 3 0个循环;最后7 2延 伸1 0mi n 。取5 LP C R产物于1 0g / L琼脂糖凝胶 上进行电泳并分析结果。 1 . 7 P C R产物的克隆与鉴定 取1 5 LP C R产物,在1 0g / L琼脂糖凝胶上 电泳,并用D NA胶回收试剂盒回收目的片断条带。 将回收的目的片断连接到p MD

10、 1 8 - T载体中,转化 D H5 大肠杆菌。挑取单个菌落在L B ( 含5 0 g / mL Amp )培 养 基 中 培 养,然 后 提 取 质 粒 用 P s t 和 B a mH进行双酶切鉴定,对鉴定为阳性的克隆测 序。 1 . 8 序列与功能分析 用D NA S t a r软件,对测序结果与G e n B a n k收 录的I L T V和其他 -疱疹病毒的T K基因核苷酸序 列及推导出的T K蛋白氨基酸序列作同源性分析。 2 结果与分析 2 . 1 I L T VT K基因的扩增 应用设计的引物,以I L T V烟台株的 D NA为 模板扩增出1条约1 . 1k b的条带,大小

11、与目的片段 相符,见图1 。 图1 P C R扩增的I L T VT K基因 1 . D L20 0 0ma r k e r ; 2 . P C R产物; 3 .阴性对照 F i g . 1 Amp l i f i e dT K g e n eb yP C R 1 . D L20 0 0ma r k e r ; 2 . P C Rp r o d u c t ; 3 . Ne g a t i v ec o n t r o l 2 . 2 目的基因的克隆与酶切分析 从扩增片段与 p MD 1 8 - T载体连接产物转化 D H5 大肠杆菌得到的阳性菌落中, 挑取数个进行 培养。采用常规法提取质粒后

12、,用P s t 和B a mH 进行双酶切,结果在约2 . 7k b和1 . 1k b处各得1 条带(图2 ) ,表明T K基因已成功克隆到p MD 1 8 - T 载体中。将得到的重组质粒命名为p MD - T K。 图2重组质粒p MD - T K的酶切鉴定 1 . D L1 50 0 0ma r k e r ; 2 .重组质粒 F i g . 2 I d e n t i f i c a t i o no f t h er e c o mb i n e dp MD - T K p l a s mi db yd i g e s t i o nwi t hP s t a n dB a mH 1

13、 . D L1 50 0 0ma r k e r ; 2 . T h er e c o mb i n e dp l a s mi d 2 . 3 D NA序列比较分析 经测序,发现该 T K基因序列包括1个10 8 9 b p的 阅 读 框 架。将 该 基 因 序 列( G e n B a n kNo : AY7 4 1 1 3 4 ) 与从G e n B a n k上查到的I L T V美国6 3 2 株、英国T h o r n e株和B e i j i n gE 2株的T K基因序列 及其他疱疹病毒的T K基因序列相比较,结果发现, 该毒株的T K基因序列与美国6 3 2株相比有6个核 苷

14、酸发生了变异,其分别是: T 1 7 2A, C3 9 7 , 5 4 5 , 5 5 5T, T5 6 3G, A1 0 2 7C , 核苷酸的同源性高达9 9 . 5 %;与 英国的T h o r n e株和B e i j i n gE 2株相比,核苷酸变异 相同,均有 1 0个 核 苷 酸 发 生 了 变 异,其 分 别 是: T1 7 1A, C3 0 2 G, G3 0 3 T, G3 0 4 C , T3 0 5 , 5 6 6 G, C3 9 9 , 5 4 7 , 5 5 7T, A1 0 3 0C ; 另外,第3 0 2 , 3 0 3和3 0 8个 核苷酸缺失,核苷酸的同源

15、性为9 8 . 9 %;与其他疱 疹 病 毒 B HV- 1 , E HV- 1 , E HV- 2 , F HV- 1 , HHV- 1 , HHV- 2 , HHV- 3 , HHV- 4 , HVT, MD V- 1 , MD V- 2 , P R V和S HV- 2等的T K基因序列同源性不高, 分 别 为2 7 . 6 %,3 9 .6 %,3 1 .3 %,3 8 .8 %,3 9 .7 %, 3 9 . 7 %, 2 4 . 6 %, 3 1 . 4 %, 3 4 . 0 %, 3 9 . 6 %, 2 7 . 4 %, 3 0 . 1 %和2 6 . 3 %。上述与I L T

16、V烟台株T K基因进 行比较的其他T K基因在G e n B a n k中的序列号详 67 西北农林科技大学学报(自然科学版)第3 3卷 见表1 。 表1疱疹病毒T K基因在G e n B a n k中的序列号 T a b l e1 G e n B a n ka c c e s s i o nNo . = = = o f T K g e n eo f h e r p e s v i r u s 病毒简称 Ab b r e v i a t i o n 病毒全称 F u l l n a me 序列号 Ac c e s s i o n 病毒简称 Ab b r e v i a t i o n 病毒全称

17、 F u l l n a me 序列号 = Ac c e s s i o n I L T V 6 3 2s t r a i nS 8 3 7 1 4HHV- 2Hu ma nh e r p e s v i r u s2Z = 8 6 0 9 9 I L T VT h o r n es t r a i nD 0 0 5 6 5HHV- 3Hu ma nh e r p e s v i r u s3NC = - 0 0 1 3 4 8 I L T VB e i j i n gE 2s t r a i nAF 4 3 5 4 5 3HHV- 4Hu ma nh e r p e s v i r u s4

18、NC = - 0 0 1 3 4 5 B HV- 1 B o v i n eh e r p e s v i r u s1NC - 0 0 1 8 4 7 HVTHe r p e s v i r u so f t u r k e yA = 0 6 1 5 1 E HV- 1 E q u i n eh e r p e s v i r u s1NC - 0 0 1 4 9 1 MD V- 1Ma r e k sD i s e a s ev i r u st y p e1 D = 1 3 9 5 6 E HV- 2 E q u i n eh e r p e s v i r u s2NC - 0 0 1

19、 6 5 0 MD V- 2Ma r e k sD i s e a s ev i r u st y p e2 AB = 0 4 9 7 3 5 F HV- 1 F e l i n eh e r p e s v i r u s1S 6 4 5 6 6 P R VP s e u d o r a b i e s v i r u sAY = 2 1 7 0 9 5 HHV- 1 Hu ma nh e r p e s v i r u s 1AY4 2 6 8 2 8 S HV- 2S a i mi r i i n eh e r p e s v i r u s2 NC - 0 0 1 3 5 0 为了更好

20、地了解I L T V毒株的遗传学特性及与 其他疱疹病毒的亲缘关系,在分析各毒株T K基因 序列同源性的基础上,绘制了系统发生进化树,见图 3 。由图3可以看出,参试的1 7株疱疹病毒被分为3 个特定的组:禽类疱疹病毒组(包括I L T V, MD V和 HVT) 、水 痘 疱 疹 病 毒 组(包 括B HV- 1 , E HV- 1 , P R V和F HV- 1等) 和人疱疹病毒组(包括HHV- 2 , HHV- 4和S HV- 2等) ,其中禽类疱疹病毒组和水痘 疱疹病毒组关系相对较近,二者又组成了一个大的 独 立 分 支, I L T V与 禽 类 疱 疹 病 毒 组 的 MD V和 H

21、VT亲缘关系最近, 与其他疱疹病毒关系则较远。 图3 1 7株疱疹病毒T K基因的遗传进化树 F i g . 3 P h y l o g e n t i ct r e eo f 1 7h e r p e s v i r u sT K g e n e s 2 . 4 氨基酸序列比较分析 将推导出的I L T V烟台株T K蛋白氨基酸序列 和美国6 3 2株T K蛋白氨基酸序列进行比较,发现 二者同源性为9 8 . 9 %,有4个氨基酸发生了变化, 分 别 是: P r o 1 8 2 S e r , S e r1 8 5 P h e , Va l1 8 8 G l y , L y s3 4 3G

22、 l n 。与B e i j i n gE 2株和英国T h o r n e株的 T K基因核苷酸序列相比, 由于烟台株发生了较大 变异并且缺失了3个碱基,所以其T K蛋白的氨基 酸序列变异也较大,分别是: P r o 1 0 1Ar g , Al a1 0 3 Ar g , P r o1 8 3S e r , S e r1 8 6P h e , Va l1 8 9G l y , L y s3 4 4 G l n ,且第1 0 2个 氨 基 酸 缺失,同源性为 9 7 . 8 %。 I L T V烟台株T K蛋白的氨基酸序列和B HV- 1 , E HV- 1 , E HV- 2 , F HV

23、- 1 , HHV- 1 , HHV- 2 , HHV- 3 , HHV- 4 , HVT, MD V- 1 , MD V- 2 , P R V和S HV- 2的 T K蛋白氨基酸序列同源性分别为2 6 . 9 %, 2 7 . 9 %, 2 3 . 2 %, 3 5 %, 1 5 . 1 %, 2 5 . 6 %, 2 5 . 9 %, 2 3 . 5 %, 2 6 . 5 %, 2 1 . 3 %, 3 0 . 4 %, 2 8 . 4 %和2 4 . 5 %。 对氨基酸序列进行分析后发现,尽管不同疱疹 病毒T K蛋白氨基酸序列的同源性不高,但其均有 共 同 的 保 守 序 列,即 位 于

24、 N端 的- D G X X G X G K- 和- D R H- (图4 ) 。这正是所有疱疹病毒T K蛋白催 化结构域中的亚结构域,即AT P结合结构域和核 苷酸结合结构域。由图4可知,核苷酸结合结构域 ( - D R H- )在所有疱疹病毒的T K蛋白中是最保守 的, AT P结合结构域( - D G XX G XG K- )在人、鸡、痘 77 第1 0期刘文波等:传染性喉气管炎病毒烟台株T K基因序列测定及T K蛋白功能初步分析 苗病毒和禽痘病毒的胸苷激酶中也是非常保守的。 图4 I L T VT K蛋白与其他 -疱疹病毒T K蛋白中高度保守的氨基酸残基 A. AT P结合结构域; B

25、 .核苷酸结合结构域 F i g . 4 T h eh i g h l yc o n s e r v e da mi n oa c i dr e s i d u e si nt h eT Kp r o t e i no f I L T Va n do t h e ra l p h a h e r p e s v i r u s e s A. AT Pb i n d i n gs i t e ; B . Nu c l e o t i d eb i n d i n gs i t e 3 讨论 本试验对I L T V不同毒株和 -疱疹病毒亚科其 他病毒间的T K基因和T K蛋白分别进行了核苷酸 和氨

26、基酸序列比较分析。结果表明, I L T V各分离毒 株间的T K基因和T K蛋白还是比较保守的,但与 同科其他疱疹病毒相比, T K基因和T K蛋白的同 源性则较低。与I L T VT h o r n e株和B e i j i n gE 2株相 比,烟台株在AT G下游第3 0 2 , 3 0 3和3 0 8位的核 苷酸缺失,使该段碱基序列由C C GG T TG C C变成 了C G T C G C ,对应的氨基酸序列也由 P ( P r o ) - V ( Va l ) - A( Al a )变为R - R( Ar g ) 。烟台株为一强毒 株 9 ,而B e i j i n gE 2株

27、也是国内的强毒株,可见这种 缺失对其毒力并无太大影响。虽然I L T V与MD V 和 HVT同属禽类疱疹病毒, 但其 T K基因和T K 蛋白间的同源性并不高。根据绘制的遗传进化树发 现,在4个不同的I L T V毒株中,烟台株和美国6 3 2 株亲缘关系最近,推测两毒株有可能是同一起源。 本试验所做的氨基酸序列分析表明,在所有的 禽疱疹病毒T K蛋白中都有2个共同的保守氨基酸 序列,即位于N端的AT P结合结构域: - D G PF G V G K- ( I L T V为3 5 4 2位, MD V为2 5 3 2位, HVT 为1 6 2 3位)和核苷酸结合结构域: - D R H- 。

28、其是所 有 疱 疹 病 毒 T K蛋 白 的 活 性 中 心,其 中 的D 3 5 ( As p ) , G3 6 , 3 9 , 4 1 ( G l y )和K4 2 ( L y s )在所有的 - 疱 疹病毒中是非常保守的。在疱疹病毒中,只有 MD V的第3 7位氨基酸为S ( S e r ) , 并且只有禽类的 疱疹病毒3 8位氨基酸为M( Me t )或F ( P h e ) 。另外, 在疱疹病毒中,共有6个病毒的T K蛋白3 7位氨基 酸为P ( P r o ) ,而I L T V和HVT就是其中的2个,这 些都表明禽类疱疹病毒的T K蛋白可能具有底物结 合特异性。AT P结合结构域

29、的氨基酸基序( - D G P F G V G K- )是疱疹病毒T K蛋白氨基酸的核心序 列,其形成了一个疏水的袋状构象,以便与AT P腺 嘌呤环结合,在所有的疱疹病毒中均保守的3个氨 基酸残基( G) ,则形成这个疏水口袋的可变口部,其 氨基端含有酸性和芳香族氨基酸残基。该结构域的 氨基酸序列对疱疹病毒的毒力具有很大影响,如果 其3个氨基酸残基( G)中的一个发生突变,则会影 响T K蛋白的构象及其与AT P的结合,导致T K蛋 白活性丧失而致弱。由于 I L T V烟台株和B e i j i n g E 2株及英国T h o r n e株之间的氨基酸变异并不在该 结构域,所以这种变异对其

30、毒力的影响并不大。核苷 酸结合结构域( - D R H- )在所有疱疹病毒中是最保守 的,其中的天冬氨酸残基是结合Mg - NT P的前体, 其前有一疏水的折叠片。该天冬氨酸残基对T K 蛋白的催化活性至关重要。 另外,本试验在4株I L T V的T K蛋白氨基酸 87 西北农林科技大学学报(自然科学版)第3 3卷 序列中,也发现了其他疱疹病毒均有的5个保守的 半胱氨酸残基( C ) ,这些半胱氨酸残基可能是通过 形成二硫键来维持T K蛋白氨基酸的功能构象,使 AT P结合结构域与核苷酸结合结构域在空间上相 互重叠,并与底物靠近,发生反应,从而发挥T K蛋 白的功能 1 0 。 以前人们对I

31、L T V T K基因功能的了解是根据 其 他 疱 疹 病 毒 T K基 因 进 行 推 测, 2 0 0 2年Ha n 等 1 1 首次通过试验证明, I L T V T K基因同其他疱 疹病毒的T K基因一样,是病毒的毒力基因之一,且 是其复制的非必需基因。 T K基因缺失后,可使毒株 的毒力明显下降,但并不影响毒株的免疫原性。因 此,假如构建出I L T V T K疫苗,或许可以解决当前 使用的传染性喉气管炎弱毒疫苗所存在的一些问 题。 参考文献 1 C a l n e kBW, B a r n e sHJ , B e a r dCW, e t a l . D i s e a s eo

32、f p o u l t r y M . 1 0 t he d . Ame s , I o wa : I o waS t a t eUn i v e r s i t yP r e s s , 1 9 9 7 . 5 2 7 -5 3 9 . 2 J o h n s o nM A, P r i d e a u xCT , Ko n g s u wa nK, e t a l . G a l l i dh e r p e s v i r u s1 ( i n f e c t i o u sl a r y n g o t r a c h e i t i sv i r u s ) : c l o n i

33、n ga n dp h y s i c a l ma p so f t h eS A- 2s t r a i n J . Ar c hVi r o l , 1 9 9 1 , 1 1 9 : 1 8 1 -1 9 8 . 3 J o h n s o nM A, T y a c kSG, P r i d e a u xCT , e ta l . Nu c l e o t i d es e q u e n c eo ft h el e f t - t e r mi n u so fi n f e c t i o u sl a r y n g o t r a c h e i t i sv i r u

34、 s( G a l l i d h e r p e s v i r u s1 )S A- 2s t r a i n J . Ar c hVi r o l , 1 9 9 7 , 1 4 2 : 1 9 0 3 -1 9 1 0 . 4 Wi l dM A, C o o kS , C o c h r a nM. Ag e n o mi c ma po f i n f e c t i o u s l a r y n g o t r a c h e i t i s v i r u s a n dt h es e q u e n c ea n do r g a n i z a t i o no f g

35、 e n e s p r e s e n t i n t h eu n i q u es h o r t a n df l a n k i n gr e g i o n s J . Vi r u sG e n e s , 1 9 9 6 , 1 2 : 1 0 7 -1 1 6 . 5 Ki t S . T h y mi d i n ek i n a s e J . Mi c r o b i o l S c i , 1 9 8 5 , 2 : 3 6 9 -3 7 5 . 6 Ke e l e r CL , Ki n g s l e yDH, B u r t o nCR . I d e n t

36、 i f i c a t i o no f t h et h y mi d i n ek i n a s eg e n eo f i n f e c t i o u sl a r y n g o t r - a c h e i t i sv i r u s J . Av i a nD i s , 1 9 9 1 , 3 5 ( 4 ) : 9 2 0 -9 2 9 . 7 G r i f f i nA M, B o u r s n e l l M E . An a l y s i so ft h en u c l e o t i d es e q u e n c eo fD NA f r o

37、m t h er e g i o no ft h et h y mi d i n ek i n a s eg e n eo fi n f e c t i o u s l a r y n g o t r a c h e i t i sv i r u s ; p o t e n t i a l e v o l u t i o n a r yr e l a t e i o n s h i p sb e t we e nt h eh e r p e s v i r u ss u b f a mi l i e s J . J G e nVi r o l , 1 9 9 0 , 7 1 ( 4 ) : 8

38、 4 1 -8 5 0 . 8 Ha nM G, S u nJ K. An a l y s i s o f Ko r e a ns t r a i n s o f i n f e c t i o u s l a r y n g o t r a c h e i t i s v i r u s b yn u c l e o t i d e s e q u e n c e s a n dr e s t r i c t i o nf r a g me n t l e n g t h p o l y mo r p h i s m J . Ve t Mi c r o b i o l , 2 0 0 1 ,

39、 8 3 : 3 2 1 -3 3 1 . 9 张秀美,艾 武,王莉莉,等.鸡传染性喉气管炎的诊断与病毒分离鉴定 J .山东农业科学, 1 9 9 7 , 6 : 3 2 -3 6 . 1 0 G r a h a m RR , Mi l l a r W J . E v o l u t i o no f t h eh e r p e st h y mi d i n ek i n a s e : i d e n t i f i c a t i o na n dc o mp a r i s o no f t h ee q u i n eh e r p e s v i r u s1t h y mi d

40、 i n e k i n a s eg e n er e v e a l ss i mi l a r i t yt oac e l l - e n c o d e dt h y mi d i n ek i n a s e J . Nu cAc i R e s , 1 9 8 8 , 1 6 : 1 1 3 0 3 -1 1 3 1 7 . 1 1 Ha nM G, Kwe o nCH, MoI P , e t a l . P a t h o g e n i c i t ya n dv a c c i n ee f f i c a c yo f at h y mi d i n ek i n a

41、s eg e n ed e l e t e di n f e c t i o u sl a r y n g o t r a c h e i t i s v i r u se x p r e s s i n gt h eg r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i ng e n e J . Ar c hVi r o l , 2 0 0 2 , 1 4 7 : 1 0 1 7 -1 0 3 1 . C l o n i n g , s e q u e n c i n ga n df u n c t i o na n a l y s i so f t h et

42、h y mi d i n ek i n a s eg e n ea n d i t sp r o t e i no f i n f e c t i o u sl a r y n g o t r a c t h e i t i sv i r u sYa n t a i s t r a i n L I UWe n - b o 1, Z HO UB i n1, HU A N GB i n g1 , 2, Z HA N GX i u - me i2, Z HA N GS u - f a n g1, C HE NP u - y a n1 ( 1Ke yl a b o r a t o r yo fAn i

43、 ma l Di s e a s e s Di a g n o s t i ca n dI mmu n o l o g y , Mi n i s t r yo fAg r i c u l t u r e , Na n j i n gAg r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y , Na n j i n g , J i a n g s u2 1 0 0 9 5 , C h i n a ; 2I n s t i t u t eo fP o u l t r yS c i e n c e , S h a n d o n gAc a d e m yo fAg r i

44、 c u l t u r a l S c i e n c e , J i n a n , S h a n d o n g2 5 0 0 2 3 , C h i n a ) A b s t r a c t : Ap a i r o f p r i me r sf l a n k i n gt h eT K g e n ewe r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e dn u c l e o t i d e s e q u e n c eo f t h eI L T VUS A 6 3 2s t r a i n . T

45、h et h y mi d i n ek i n a s e( T K)g e n eo f t h ewi l dC h i n e s eI L T VYa n t a i s t r a i nwa so b t a i n e db yp o l y me r a s ec h a i nr e a c t i o na n dt h eP C Rp r o d u c t swe r ec l o n e di n t op MD 1 8 - Tv e c t o r a n dt h en u c l e o t i d e so f t h eT K g e n ewa ss e

46、 q u e n c e d . B ya n a l y z i n gwi t hD NA S t a rs o f t wa r e , wef o u n dt h a t t h eh o mo l o g yo f t h eT K g e n ea n dt h ed e d u c e da mi n oa c i do f I L T V Ya n t a i s t r a i nwi t ht h a t o f I L T V US A 6 3 2s t r a i n , E n g l a n dT h o r n es t r a i n , B e i j i

47、n gE 2s t r a i n , B HV- 1 , E HV- 1 , E HV- 2 , F HV- 1 , HHV- 1 , HHV- 2 , HHV- 3 , HHV- 4 , HVT, MD V- 1 , MD V- 2 , P R V a n dS HV- 2we r eb e t we e n2 4 . 6 %-9 9 . 5 % a n d1 5 . 1 %- 9 8 . 9 %. T h er e s u l t ss h o we dt h a t t h eT K g e n ewa sv e r yc o n s e r v e da mo n gd i f f

48、e r e n t I L T V s t r a i n s , b u t v e r y l o wb e t we e nd i f f e r e n t h e r p e s v i r u s . Ke yw o r d s : i n f e c t i o u sl a r y n g o t r a c t h e i t i sv i r u s ; Ya n t a i s t r a i n ; t h y mi d i n ek i n a s eg e n e ; h o mo l o g ya n a l y s i s 97 第1 0期刘文波等:传染性喉气管炎病毒烟台株T K基因序列测定及T K蛋白功能初步分析