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1、分光光度法测定饲用六位点植酸酶活性 李俊玲孙延军山东省饲料监察所 施文娟北京桑普生物化学技术有限公司 韩冰郭芳坤山东济南天天香有限公司 植酸酶是一种能水解植酸的磷酸酶类， 广泛存 在于植物、 动物和微生物中。目前， 国内外学者公认 的植酸酶有 2 种： 即六位点植酸酶和三位点植酸酶。 三位点植酸酶由霉菌、 真菌、 酵母菌产生； 六位点植 酸酶由植物体内产生， 如小麦、 大麦、 黑麦的麸皮中， 其中以小麦麸含量最高。三位点植酸酶作用于植酸 时， 首先从植酸的第 3 碳位点开始水解酯键而释放 出无机磷， 然后再依次释放出其他碳位点的磷， 六位 点植酸酶， 它首先在植酸的第 6 碳位点开始催化而 释
2、放出无机磷。 磷在植物中的主要存在形式为植酸磷， 植酸磷 不能被单胃动物直接利用， 从而造成磷源浪费和形 成高磷粪便污染环境。植酸酶可使植物饲料中磷的 利用提高 40 % 60 %， 粪便中磷的排出量减少 30 % 50 %， 还可降低植酸盐的抗营养作用， 因此 对提高畜牧生产效益及降低植酸盐对环境的污染有 重要意义。 植酸酶的应用越来越广泛， 六位点植酸酶在实 际生产中越来越发挥着重要的作用， 因而无论是饲 料管理部门、 饲料质检机构、 科研部门还是生产企业 都面临着对商品六位点植酸酶定量测定的工作。三 位点 植 酸 酶 的 检 测 方 法 已 于 2002 年 正 式 发 布 （GB/ T
3、 186342002） ， 但因为三位点植酸酶与六位 点植酸酶的作用位点、 最佳 pH 等均不同， 用 GB/ T 186342002 测定六位点植酸酶， 检测结果一般只是 实际含量的一半， 无法准确测定， 因此， 需要有一种 快速、 简便， 具有高度特异性、 灵敏度、 准确度的方 法， 测定六位点植酸酶的活性。 植酸酶常用测定方法有钒 - 钼酸铵法、 硫酸亚 铁 - 钼蓝法、 VC - 钼蓝法、 丙酮 - 磷钼酸铵法等， 其 中钒 - 钼酸铵法较为常用， 该方法是利用植酸酶可 以水解植酸钠释放出无机磷的原理。通过加入酸性 钒钼酸铵试剂使水解反应停止， 同时与水解释放出 收稿日期： 2005
4、- 11 - 10 来的无机磷产生颜色反应， 形成黄色的含磷络合物， 在 415 nm 波长下测定磷的含量。以标准植酸酶为 参照物， 间接计算被测样品中植酸酶的含量。我们 在该方法的基础上， 结合六位点植酸酶的特性， 制定 了以下方法。 1六位点植酸酶活性单位定义 样品在植酸钠浓度为 5.0 mmol/ L、 温度 37 、 pH 5.00 的条件下， 每分钟从植酸钠中释放 1mol 无机磷， 即为一个植酸酶活性单位， 以 U 表示。 2方法原理 六位点植酸酶在一定温度和 pH 条件下， 水解 底物植酸钠， 生成正磷酸和肌醇衍生物， 在酸性溶液 中， 用钒钼酸铵处理生成黄色的 （NH4） 3P
5、O4NH4VO3 16MoO3 复合物， 在波长 415 nm 下进行比色测定。 3试剂和溶液 3.1乙酸缓冲液 （I） ， 0.25 mol/ L： 称取 34.02 g 三水 乙酸钠于 1 000 mL 容量瓶中， 加入 900 mL 水溶解， 用冰醋酸调节 pH 至 5.00 0.01， 并用蒸馏水定容 至 1 000 mL。 3.2乙酸缓冲液 （） ， 0.25 mol/ L： 称取 34.02 g 三 水乙酸钠， 0.5 g TritonX - 100， 0.5 g 牛血清白蛋白 （BSA） 于 1 000 mL 容量瓶中， 加入 900 mL 水溶解， 用冰 醋 酸 调 节 pH
6、至 5. 00 0. 01，并 定 容 至 1 000 mL。 3.3植酸钠溶液， 7.5 mmol/ L： 称取 0.692 9 g 肌醇 六磷酸钠， 于 100 mL 容量瓶中， 用 0.25 mol/ L 乙酸 缓冲液 （） 溶解并定容至刻度， 冰醋酸调节 pH 至 5.00 0.01。 3.4硝酸溶液： 1 + 2 水溶液。 3. 5钼 酸 铵 溶 液， 100 g/ L： 称 取 10 g 钼 酸 铵 （NH4） 6Mo7O24 4H2O 于 100 mL 容 量 瓶 中， 加 入 1.0 mL氨水 （25 %） ， 用水溶解并定容至刻度。 3.6偏钒酸铵溶液， 2.35 g/ L：
7、 称取 0.235 g 偏钒酸 饲料检测与品质控制 56 饲料研究F FE EE ED D R RE ES SE EA AR RC CH H N NO O. .2 2， 2 20 00 06 6 铵 （NH4VO3） 于 100 mL 棕色容量瓶中， 加入 2 mL 硝 酸溶液 （3.4） ， 用水溶解定容至刻度。避光条件下保 存 1 周有效。 3.7颜色终止液： 移取 2 份硝酸溶液 （3.4） ， 1 份钼 酸铵溶液 （3.5） ， 1 份钒酸铵溶液 （3.6） 混合后使用， 现用现配。 3.8磷酸二氢钾 （KH2PO4） ： 基准物。 4仪器设备： 恒温水浴、 分光光度计、 磁力搅 拌器
8、、 酸度计等 5标准曲线 准确称取 0.680 4 g 在 105 烘至恒重的基准 磷酸二氢钾于 100 mL 容量瓶中， 用乙酸缓冲液 （） 溶解， 并定容至 100 mL， 浓度为 50.0mol/ mL。按表 1 的比例稀释成不同浓度， 与试样一起测定， 以无机 磷浓度为横坐标， 吸光值为纵坐标， 列出直线回归方 程 （y = ax + b） 。 表 1 标准曲线配制 序号稀释量 （mL/ mL）磷浓度 （mol/ mL） 10.5125 20.5212.5 30.546.25 40.583.125 50.5161.562 5 6试样测定 称样 0. 1 1 g， 置于 100 mL 烧
9、杯中， 加入约 70 mL乙酸缓冲液 （） ， 在磁力搅拌器上高速搅拌 30 min， 用乙酸缓冲液 （） 定容至 100 mL。摇匀， 取 约 10 mL 上清液， 离心 10 min。取适量上清液用乙 酸缓冲液 （） 稀释， 使样液浓度保持在 0.4 U/ mL 左 右， 待反应。 建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶 参考样， 便于检验整个操作过程是否有偏差。 取 10 mL 试管按下面的反应顺序进行操作， 在 反应过程中， 从加入底物开始， 向每支试管中加入试 剂的时间间隔要绝对一致， 37 水解 30 min。反应 步骤及试剂、 溶液用量见表 2。 反应后的试样溶液在室温下静置
10、10 min， 如出 现混浊， 需 4 000 r/ min 离心 10 min， 上清液 415 nm 波长处测定试料空白 （A0） 和试料溶液 （A） 的吸光 值， A - A0为实测吸光值。用直线回归方程计算植 酸酶的活性。 表 2 反应步骤 反应顺序样品、 标准样品空白标准空白 1.加乙酸缓冲液 （3.1）1.8 （mL） 1.8 （mL）2.0 （mL） 2.加入待反应液 0.2 （mL）0.2 （mL） 3.混合 4.37 预热 5 min 5.依次加入底物 （3.3）4 （mL） 4 （mL）（第二步） 6.混合 7.37 水解 30 min 8.依次加入终止液 （3.7）4 （
11、mL） 4 （mL）（第一步） 9.混合 总体积10 （mL）10 （mL） 试样中六位点植酸酶的活性： X（U/ g） = c m 30 F 式中： X试料中六位点植酸酶的活性， U/ g C根据实际样液的吸光值由直线回归方程计 算出的酶活性， U F试样溶液反应前的总稀释倍数 m试样质量， g 30反应时间， min 7方法性能 7.1pH 对测定结果的影响 动物消化道内食糜的 pH 通常在 4.0 7.0 之 间， 为了接近实际， 饲料酶活力测定的 pH 一般选择 在 5.0 6.0 之间。据文献报道， 六位点植酸酶的最 佳 pH 范围是 4.5 6.0， 为此， 我们选择 5 个不同的
12、 样品， 分别在 pH4.0、 4.5、 5.0、 5.5、6.0 5 个不同的 pH 条件下测定酶活力。结果见图 1。可以看出样 品 2、 3、 4 的酶活力， 在 pH 为 5.0 的条件下是最高 的。样 1 和样 5 虽然在 pH 5.0 时， 酶活力不是最高 的， 但仅次于 pH 4.5 时的最高值， 分别是最高值的 94.7 %和 81.4 %， 综合考虑， 我们选择了 pH 5.0 为 测定条件。 图 1 pH 对酶活力的影响 饲料检测与品质控制 饲料研究F FE EE ED D R RE ES SE EA AR RC CH H N NO O. .2 2， 2 20 00 06 6
13、57 7.2方法的准确度和精密度 为了考察方法的准确度和精密度， 我们分别检 测数个产品， 每一个产品分别作 5 个平行， 测定结果 见表 3。可以看出本方法与国标测定结果比较， 更 符合实际含量， 更准确， 且精密度较好， 变异系数均 小于 14 %， 最大值与最小值间的偏差均小于 20 %。 表 3 不同方法测定结果 样品 名称 依据 标准 酶活 （U/ g） 平均 酶活 （U/ g） 变异 系数 （%） 最大值 与最小 值相对 偏差 （%） 已知 含量 （U/ g） 占标 识量 （%） 本标准 / 国家 标准 样品 1 本标准 国家标准 1 314 1 339 1 353 1 206 1
14、 357 638 753 1 314 695 55.71 000131 69.5 1.9 样品 2 本标准 国家标准 4 064 3 009 3 318 3 465 3 213 2 001 2 136 3 414 2 069 1215.55 00068.3 41.4 1.7 样品 3 本标准 国家标准 6 310 5 498 5 982 5 901 5 527 2 096 2 493 5 844 2 294 66.95 000117 45.9 2.5 7.3本方法与 GB/ T 186342002 的比较 从表 3 可以看出， 同一个样品用 2 种方法测定， 其结果不同， 且差异很大。如样品
15、1 - 3， 本标准测 定结果分别是国标测定结果的 1.7 2.5 倍， 并且样 品 1 与样品 2 本方法测定结果与已知酶活非常接 近， 分别占其标识量的 131 % 和 117 %。其他市场 上的样品 2 种方法测定的结果也相差悬殊。由此可 见， 六位点植酸酶酶活的测定使用本方法更合适。 由此， 我们认为， 该标准更适合于六位点植酸酶 酶活的测定， 有比较好的重复性和准确性， 操作简 便， 易掌握。 参考文献 1马玺， 单安山 . 植酸酶研究进展及其在饲料工业 中的应用 .粮食与饲料工业， 2001 （4） ： 27 30 2杨胜 .饲料分析及饲料质量检测技术 .北京： 北京 农业大学出版
16、社， 1993 3蒋克纯 .植酸酶和 VD3协同对肉仔鸡生产性能和 矿物元素利用率的影响 .中国家禽， 2000 （12） ： 12 14 4程茂基 .低钙磷日粮添加植酸对肉仔鸡生产性能 及钙磷利用的影响 .畜牧与兽医， 2000 （2） ： 5 6 5陆文清， 刘伟， 刘兴海， 史凯来， 等 .固态发酵饲用 植酸酶酶活的快速测定法 . 饲料研究， 2000 （1） ： 11 通讯地址： 山东省济南市槐村街 68 号 = 250022 动物保健 目前， 饲养肉牛的农户和专业户增 多， 在肉牛的饲养过程中， 有的虽然也 能注意给其添喂精料， 但添加的精料单 一。这样， 饲喂效果就不好了， 最好是
17、 把多种精料搭配后再饲喂。现将肉牛 精料的配比介绍如下： 幼牛精料的配比： 玉米面 55 % 至 60 %， 豆饼 15 %至 25 %， 麸皮 20 %至 25 %， 骨粉 1.5 %至 2 %， 食盐 1 %至 1.2 %， 微量元素适量。日喂量： 1 至 3 月龄日喂 0.5 至 0.75 kg； 4 至 6 月龄日 喂 1 至 1.5 kg； 6 月龄日喂 2 至 2.5 kg。 架子牛育肥： 精料中蛋白质饲料 （豆 饼 等）可 适 当 减 少，为 13 % 至 15 %； 碳水化合物饲料 （玉米等） 适当 增加， 在 60 %以上， 日喂 2.5 至 3 kg。 通讯地址： 山东省东平县畜牧局 271500 郑 卫 东 多 种 精 料 配 饲 喂 肉 牛 好 饲料检测与品质控制 58 饲料研究F FE EE ED D R RE ES SE EA AR RC CH H N NO O. .2 2， 2 20 00 06 6