利用骨髓间质干细胞修复小鼠颅骨缺损的实验研究.pdf

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1、第3 4 卷黑龙江医学V 0 1 3 4 。N o 5 3 5 4 “ 2 0 1 0 年第5 期H E IL O N GJ I A N GM E D I C A LJ O U R N A L M a y 2 0 1 0 利用骨髓间质干细胞修复小鼠颅骨缺损的实验研究 马泽云1 ( I 北京大学口腔医学院特诊科，北京1 0 0 0 8 1 ；2 ，翟德红2 鸡西矿业集团总医院口腔科，黑龙江鸡西1 5 8 1 0 0 ) 摘要：目曲探讨小鼠骨髓间质干细胞( M S C s ) 修复小鼠颅骨缺损的能力。方法分离培养扩增小鼠 M S C s ，并在其同窝小鼠颅骨上造约5 0m m 圆形缺损，分别植入煅

2、烧骨+ 藻酸钙( 载体组) 和M S C s 细胞+ 煅 烧骨+ 藻酸钠( 实验组) 及空白组，4 个月后，取出标本进行病理分析。结果空白组未见骨组织形成；栽体 组仅见有少量骨组织形成；实验组有较多的新生骨组织形成，并且新生骨和宿主骨有连接。结论小鼠骨 髓间质干细胞能促进骨组织形成，具有修复骨缺损的潜能。 关键词：骨髓间质干细胞；煅烧骨；骨缺损；修复 d o i ：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 4 5 7 7 5 2 0 1 0 0 5 0 1 3 学科分类代码：3 1 0 5 1中图分类号：R 一3 3 2文献标识码：A E x p e r i m e n tS t

3、 u d yo ft h eP o t e n t i a lo fB o n eM a r r o w d e r i v e dM e s e n c h y m a l S t e mC e l l si nR e s t o r a t i o no fM o u s eC a l v a r i a lD e f e c t s M AZ e y u n ，Z H A ID e h o n g ( S p e c i a lD e n t a lD e p a r t m e n t ，S t o i n a t o l o g yC o l l e g eo fB e i i i

4、n gU n i v e m i t y ，B e i j i n g1 0 0 0 81 ，C H I N A ) A b s t r a c t ：O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ep o t e n t i a lo fb o n em a T o Wm e s e n c h y m a l d e r i v e ds t e mc e l l s ( M S C s ) i n t r e a t m e n to fc a l v a r i a ld e f e c t M e t h o d sM i c eM S

5、C sw e r ei s o l a t e da n dc u l t u r e di no s t e o i n d u c t i v em e d i u m C a l v a r i a lb o n ed e f e c t sa b o u t5 0m m 5 0m mw e r em a d eo ne a c ho ft h es a m el i t t e ro fm i c e ，t h e nf i l l e dw i t hn o n e ( c o n t r o lg r o u p ) ，o rc a l c i n a t e db o n ea

6、n da l g i n a t ec a l c i u m ( v e h i c l eg r o u p ) ，o rM S C sp l u sc a l c i n a t e db o n ea n da l g i n a t e s o d i u m ( e x p e r i m e n t a lg r o u p ) A l ls p e c i m e n sw e r er e m o v e d4m o n t h sp o s t t r a n s p l a n t a t i o nf o rh i s t o l o g i c a le v a l

7、u a - t i o n R e s u l t sN ob o n ew a so b s e r v e di nd e f e c t sw i t h o u tr e s t o r a t i o n Af e wo fn e wb o n e sw e r ef o u n di nd e f e c t si n v e h i c l eg r o u p M a n yn e w l yf o r m e db o n ec o n n e c t e dw i t ht h ee n do fh o s tb o n ew e r ea l s of o u n di

8、nd e f e c t sr e p a i r e d w i t hM S C sw i t he a l c i n a t e db o n ea n da l g i n a t es o d i u m C o n c l u s i o nM S C sw i t hc a l c i n a t e db o n ea n da l g i n a t es o d i u mh a v et h ep o t e n t i a lf o rr e p a i r i n gb o n ed e f e c t s K e yw o r d s ：B o n em a r

9、r o w d e r i v e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( M S C s ) ；C a l c i n a t e db o n e ；B o n ed e f e c t s ；R e s t o r a t i o n 6 R o d eTSJ a n s s e n sU ，S c h i l dHH ，e t a 1 F r a g m e n t a t i o no fm a s s i v ep u l m o n a r ye m b o l i s mU s i n gap i g t a i lr o t a t

10、e o nc a t h e t e r J C h e s t ，1 9 9 8 ，11 4 ( 5 ) ：14 2 7 14 3 6 7 H e i t z m a nER P u l m o n a r yt h r o m b o e m b o l i s m a n dp u l m o n a r ya r t e r i a lh y p e r t e n s i o n I n ：T h e l u n g r a d i o l o g i c p a t h o l o g i c c o r r e l a t i o n s M S t L o u i s ：C V

11、M o s b y ，1 9 8 4 ：1 0 6 1 3 0 8 B o i s e l l ePM ，D i p p o t i t oG ，C o p e l a n dC M u l 一 作者简介：马泽云( 1 9 7 1 一) ，女，学士，主治医师。 t i p l a n a ra n d3D i m a g i n go ft h ec e n t r a la i r w a y s ：c o m p a - r e i s o no fi m a g eq u a l i t ya n dr a d i a t i o nd o s eo fs i n g l e - d e

12、 t e c t o rr o wC Ta n dm u h d e t e c t o rr o wC Ta td i f f e r i n g t u b ec u r r e n t si nd o g s J R a d i o l o g y ，2 0 0 3 ，2 2 8 ( 1 ) ： 1 0 7 一1 1 1 9 P a t e lS ，E l l aA M F ，P h i l i pN ，e ta 1 P u l m o n a r y e m b o l i s m ；o p t i m i z a t i o no fs m a l lp u l m o n a r

13、yv i s u a l i z a t i o n a tm u h i d e t e c t o rr O WC T J R a d i o l l o g y ，2 0 0 3 ，2 2 7 ( 2 ) ：4 5 5 4 6 0 ( 编辑：谢忠艳) ( 收稿日期：2 0 1 0 0 3 1 0 ) 万方数据 第3 4 卷 2 0 1 0 年第5 期 黑龙江医学 H E IL O N GJ 1 A N GM E D I C A LJ O U R N A L V 0 1 3 4 N o 5 M a y 2 0 1 0 3 5 5 骨髓间质干细胞是多潜能干细胞，可以在多种 支架，如羟基磷灰石

14、、冻干骨、煅烧骨、高分子聚合 物等载体上，形成骨等组织。是骨组织工程的种子 细胞 2 3J 。已有一些学者利用骨髓间质干细胞进 行了骨缺损的修复实验。陈滨Ho 利用珊瑚羟基磷 灰石和骨髓基质干细胞( M S C s ) 复合体对胫骨 2 0c m 骨缺损区进行修复；舒胜文应用兔M S C s 以 煅烧骨为支架修复自体下颌骨缺损；S h a n gQ “ 应 用体外分离培养山羊M S C s ，并复合藻酸钙修复山 羊自体颅骨全层缺损；徐小良1 6o 将人骨形态发生蛋 白2 ( h B M P 2 ) 基因导人兔M S C s ，修复兔桡骨缺损。 以上研究，均表明利用骨髓M S C s 复合载体修

15、复骨 缺损的效果要比单纯应用载体效果好，因为骨组织 具有免疫原性，所以这些实验均仅限于用自身骨髓 M S C s 修复骨缺损。本文采用同窝小鼠为研究对 象，以具有骨诱导性的异体煅烧骨“ 8 1 和藻酸钙p 为载体，探讨利用同窝小鼠的骨髓M S C s ，复合藻酸 钙和异体煅烧骨修复全同窝小鼠颅骨缺损的可能 性。 1 材料和方法 同龄小鼠1 5 只，4 只用于培养M S C s ，剩余1 1 只分为3 组；M S C s 修复组小鼠5 只，与培养细胞的 小鼠同窝，M S C s + 煅烧骨+ 藻酸钙修复骨缺损；载 体对照组3 只，煅烧骨+ 藻酸钙修复骨缺损；单纯 骨缺损组3 只，骨缺损不修复。

16、1 1 M S C s 准备 取小鼠股骨和肱骨，剪碎后收集到离心管中， 加入3 0m L 无血清D M E M 培养基，振荡后取悬液， 重复3 次，将所收集的液体合并后，离心 l0 0 0r m i n ，1 0m i n ，弃上清，重悬细胞沉淀并将其 加入到等体积的淋巴细胞分离液液面上，1 8 0 g 离 心1 5m i n ，取低密度细胞层液体，4 0 5 g 离心 1 5r a i n ，细胞沉淀用H a n k s 液洗涤，D M E M 培养基 ( 含1 5 胎牛血清，1 0 0U m L 青霉素和1 0 0 协g m L 链霉素) 重悬，接种于培养瓶中。3 7 5 C O ，条件

17、下培养。2d 后，更换培养基，去除未贴壁血细胞，改 用矿化液培养液( 含1 0 0n m o l L 地塞米松， 1 0n m o l L1 3 一甘油磷酸钠，5 0n I 矗6 L L 抗坏血酸的 M S C s 培养基) 继续培养。 1 2 载体准备 新鲜小牛松质骨经脱蛋白、脱脂，9 0 0 高温煅 烧1h A ，成为白色、多孔、相对较脆的煅烧骨。将煅 烧骨经蒸馏水清洗后，压成颗粒，2 0 0 干烤3h 。取 第3 代M S C s ，消化后，重悬于过滤除菌的1 2 藻 酸钠( S i g m a ) 溶液中，按6 0 1 0 6 细胞5 0m m 3 煅烧 骨的比例将细胞悬液滴加到煅烧骨

18、上，置于 0 1m o l LC a C l ：液中，使M S C s 、煅烧骨和藻酸钙固 化为一体，再将其浸在无血清的D M E M 培养液中， 准备移植于骨缺损处。空载体对照组载体不加 M S C s 。 1 3 体内移植 手术程序：麻醉下暴露小鼠颅骨，在冷生理盐 水辅助下，在顶骨上制备一个直径5 0m m 的骨缺 损，将上述样本移植覆盖于骨缺损区，闭合切口。4 个月后，取出标本，4 多聚甲醛固定，E D T A ( p H = 7 0 ) 脱钙，常规切片，H E 染色。 2 结果 经淋巴细胞分离液分离得到的细胞，3 7 5 C 0 2 培养，ld 后M S C s 贴壁；2 3d 后，细

19、胞逐渐展 开，成纤维细胞状，随着培养时间延长，细胞可呈叠 层生长( 图1 ) 。 圈1 小鼠M S C s 原代培养 光镜下观察，M S C s + 煅烧骨+ 藻酸钙修复颅骨 骨缺损组，颅骨缺损处覆盖有煅烧骨颗粒，5 个标本 中，有4 个煅烧骨颗粒表面被嗜伊红的矿化组织包 绕，并可见较大、成片的嗜伊红矿化组织，染色均 匀，呈层状，其间可见骨陷窝，陷窝内可见核蓝染的 成骨样细胞。在载体与颅骨断端衔接处，可观察到 新生骨组织与小鼠原有的颅骨组织相互融合的现 象，并可见骨改建。靠近颅骨断端处的新生骨组织 较其它缺损处多( 图2 ) 。煅烧骨+ 藻酸钙载体对 照组，骨缺损处可见少量嗜伊红的矿化组织(

20、骨组 织) 。在载体与骨断端重叠处，可见新生骨与颅骨 断端骨组织融合，此处煅烧骨颗粒表面新生成的骨 组织较多，颅骨亦出现吸收改建。单纯骨缺损组：3 只小鼠颅骨缺损处均为结缔组织膜覆盖，其下为脑 组织，均未见骨组织生成。 万方数据 第3 4 卷 3 5 62 0 1 0 年第5 期 黑龙江医学 H E IL O N GJ I A N GM E D I C A LJ O U R N A L V 0 1 3 4 N o 5 M a v 2 0 1 0 图2 小鼠M S C s 修复颅骨缺损 A ：空白对照，颅骨缺损处被纤维结缔组织覆盖，无骨组织形成 B ：煅烧骨+ 藻酸钙载体对照，骨缺损处有煅烧骨颗

21、粒和少量新骨生成，一示煅烧骨颗粒 C ：煅烧骨+ 藻酸钙+ M S C s ，骨缺损处有煅烧骨颗粒和新骨生成，成骨量多于：煅烧骨+ 藻酸钙载体对照，一示新生骨附着在煅烧骨 颗粒表面上 D ：空白对照宿主骨断端情况，一示宿主骨断端圆钝 E ：煅烧骨+ 藻酸钙+ M S C s 骨断端结合情况，新生骨与宿主骨断端形成骨性融合，一示新生骨与宿主骨断端融合 3 讨论 参考文献： 煅烧骨主要成分是羟基磷灰石，但物理化学性 1 朱付平，熊光仲，王万春，等骨髓间充质 能要优于人造羟基磷灰石，更接近体内成骨的要 干细胞在骨科中应用的研究进展 J 中国中医骨 求。煅烧骨孔隙内为天然骨孑L 隙，孔隙表面光滑有 利

22、于细胞的贴附和生长，具有骨引导作用。而藻酸 钙亦是软骨和骨组织工程的良好载体归J 。M S C s 是 目前公认的多潜能干细胞，骨髓M S C s 在体外培养、 诱导下，可以定向分化为骨细胞，表现出成骨细胞 的生物学特性，形成骨组织 2 3J 。本文利用煅烧骨 良好的骨组织相容性，M S C s 具有形成骨组织的能 力和藻酸钠溶液遇到钙离子可以形成胶冻样藻酸 钙的特点，将三者固化为一体，来研究小鼠M S C s 修 复同胞颅骨缺损的能力。 关于M S C s 能形成骨组织研究得亦比较深入。 而应用此技术进行骨缺损的修复的研究却不多，研 究均是以自体细胞修复骨缺损，实验动物至少需要 进行取骨髓培

23、养M S C s 和移植修复2 次手术。我们 利用同窝小鼠个体间具有1 4 相同遗传基因的特 点，将同窝小鼠的M S C s 混合培养，修复同窝小鼠骨 缺损，就有可能减少异体细胞移植所带来的免疫排 斥反应，并且简化了实验程序。我们的研究表明， 采用这种方法进行骨缺损修复，在颅骨缺损处以煅 烧骨为支架，形成新生骨组织，修复骨缺损，新生骨 组织与宿主原有骨组织间具有良好的相容性。小 鼠M S C s 复合煅烧骨和藻酸钙具有修复同窝小鼠骨 缺损的能力，且比单纯应用载体效果好，但修复效 果存在个体差异，这种差异可能是由混合M S C s 的 基因型和宿主基因型之间的匹配程度不同造成的。 伤科杂志，2

24、0 0 5 ，5 ：7 8 8 1 2 C a r l oS t e l l aC ，G i a n n iMA B i o l o g ya n d c l i n i c a la p p l i c a t i o n so fm a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s J1 P a t h o lB i o l ( P a r i s ) 2 0 0 5 ，3 ：1 6 2 1 6 4 3 叶成，史鹏骨髓间充质干细胞与成骨 J 中国矫形外科杂志，2 0 0 8 ，1 6 ：3 5 6 3 5 8 4 陈滨，裴国献，王琦，等山羊胫骨大

25、段骨 缺损的组织工程骨修复及放射性核素显像监测 J 第一军医大学学报，2 0 0 2 ，2 2 ( 1 1 ) ：9 6 6 9 6 9 5 S h a n gQ ，W a n gZ ，L i uW ，e ta 1 T i s s u e e n g i n e e r e db o n er e p a i ro fs h e e pc r a n i a l d e f e c t sw i t h a u t o l o g o u sb o n em a l T o ws t r o m a lc e l l s J JC r a n i o f a c S u r g ，2 0 0

26、1 ，1 2 ( 6 ) ：5 8 6 9 3 ，5 9 4 5 6 徐小良，戴克戎，汤亭亭，等腺病毒介导 的人骨形态发生蛋白2 基因修复兔桡骨缺损 J 中华创伤杂志，2 0 0 2 ，1 8 ( 1 1 ) ：6 7 7 6 8 0 7 许永华，顾为望，施新猷，等自体骨膜细 胞复合胶原涂层煅烧骨修复骨缺损的实验研究 J 中国矫形外科杂志，2 0 0 2 ，9 ( 5 ) ：4 6 7 4 6 9 8 丁仁奎，王万春，倪江东，等牛骨形态发 生蛋白复合煅烧骨治疗骨缺损的实验研究 J 湖 南医科大学学报，2 0 0 1 ，2 6 ( 6 ) ：5 3 7 5 3 9 9 雷德林，陈书军，羊书勇，等以藻酸钙为 载体的可注射性组织工程软骨和骨研究 J 中国 临床康复，2 0 0 2 ，6 ( 2 2 ) ：33 5 1 33 5 2 ( 编辑：谢忠艳) ( 收稿日期：2 0 1 0 0 3 0 5 ) 万方数据