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1、内皮素的 mRNA 在实验性牙髓炎组织中的表达 刘英群1*，彭旭霞2，王锐1 （1. 哈尔滨医科大学口腔医学院 儿童口腔科，黑龙江 哈尔滨 150001； 2. 哈尔滨医科大学第二临床医学院 儿童口腔科，黑龙江 哈尔滨 150086） 摘要 目的通过检测内皮素-1 （ET-1） 在牙髓组织中的表达， 探讨 ET-1 与正常及炎性牙髓组织的关系。方法 以改良的单纯穿髓开放法建立 Wistar 大鼠实验性牙髓炎的动物模型， 病理观察分析该型的牙髓组织情况； Northern 杂交分析牙髓组织内 ET-1 的 mRNA 表达水平。结果ET-1mRNA 在正常组及牙髓炎组均有表达， 且在炎症时增长 明
2、显， 以牙髓炎 3 天组表达量最多。结论ET-1 参与了牙髓炎症的发生与发展过程。 关键词 内皮素； 牙髓组织； 牙髓炎； Northern 杂交 中图分类号R- 332； R781.31文献标识码A 文章编号1000 - 1905 （2005） 03 - 0236 - 04 Expression of endothelin-1 mRNA in the experimental pulpitis models LIU Ying-qun， PENG Xu-xia， WANG Rui （Department of Pediatric Dentistry， School of Stomatology
3、， Harbin Medical University， Harbin 150001， China） Abstract：ObjectiveTo study the relationship between the expression of ET-1 mRNA and pulpal tissue in- flammation.MethodsThe experimental pulpitis models of rat were induced through simply pulp exposure by drilling maxillary molar with cool water.Pul
4、pitis were observed pathologically； The expression of ET-1 mRNA in pulp were analyzed by Northern hybridization.ResultsET-1 expression was observed in normal and inflamma- tory pulp and was up-regulated with its dominance at day 3.ConclusionET-1 may be involved in the occur- rence and development of
5、 pulpitis. Key words：endothelin； pulp； pulpitis； Northern hybridization 收稿日期2005 - 03 - 28 基金项目黑龙江省科技攻关项目资助 （GC02C149-02） 作者简介刘英群 （1961 - ） ， 女， 黑龙江尚志人， 教授， 硕士研究生 导师。*通讯作者 内皮素 （endothelin， ET） 是一种血管活性肽， 是目 前所知血管收缩作用最强的物质， 具有广泛的生物 学效应， 对全身血压、 局部血流灌注及细胞增殖等有 重要作用 1。在人牙齿组织中， 血管内皮细胞是 ET 产生的唯一来源， 推测由内皮细胞产
6、生和释放的 ET， 可能通过旁分泌机制参与了正常和病理状态 下， 人牙髓组织的血压和血流的调节 2。牙髓微循 环是牙髓炎的首发部位， 其稳定性的调控直接影响 炎症的发生与发展 3。在牙髓微血管中 ET-1 受体 的存在， 可调控牙髓的微循环， 尤其在牙髓受损时更 为明显。牙髓微血管内皮细胞在局部炎症反应的地 方合成释放 ET， 引起组织修复或坏死 4。ET 的升 高可能是牙髓炎的病因， 也可能是牙髓炎的结果。 本研究通过检测 ET-1 在牙髓组织中的表达， 探讨 ET-1 与正常及炎性牙髓组织的关系， 为牙髓炎的早 期控制提供依据。 1材料与方法 1.1材料 ET-1 引物： 上游： 5-TC
7、TTCTCTCTGCTGTTTGTGGCTT-3 下游： 5-TCTTTTACGCCTTTCTGCATGGTA-3 TRIZOL 试 剂 （GIBCO） ； Image Master VDS-CL； Northern 杂交试剂盒； RT-PCR 试剂盒。 1.2大鼠实验性牙髓炎模型的建立 6 只 Wistar 大鼠， 随机分成 3 组， 每组 2 只， 改良 单纯穿髓开放法 5， 于上颌第 1、 2 磨牙开髓， 建立牙 髓炎模型， 第 3 磨牙不做任何处置作为对照组。分 别于 1 天、 3 天、 6 天处死大鼠， 取出牙齿， 固定、 脱 钙、 石蜡包埋、 切片 （5m） 、 HE 染色， 光镜
8、下观察。 1.3ET-1mRNA 的表达 1.3.1标本的制备： 32 只 Wistar 大鼠， 随机分成正 632 第 39 卷第 3 期 2005 年 6 月 哈尔滨医科大学学报 JOURNAL OF HARBIN MEDICAL UNIVERSITY Vol.39， No.3 Jun.， 2005 常对照组、 牙髓炎 1 天组、 3 天组和 6 天组， 每组 5 只， 按上述方法建立牙髓炎模型， 分别于当天、 1 天、 3 天、 6 天处死大鼠， 即刻取出牙齿， DEPC 水擦拭牙 面， 暂放在液氮中， 于 - 70冰箱中保存备用。 1.3.2探针的制备 1.3. 2. 1RNA 的提取
9、： 100mg 组织加 TRIzol 试剂 1ml， 加入液氮中匀浆组织至粉末状， 混匀振荡， 加 TRIzol 试剂的 20%的氯仿， 进行相分离。15 30 孵育样品 5min，4， 12 000 g 离心 15min， 取无色 上层水相放入另一离心管中， 加 TRIzol 试剂的 50% 的丙醇。15 30孵育 10min， 4， 12 000 g 离心 10min。去除上清， 用 75%酒精洗涤 RNA 沉淀物， 加 与 TRIzol 试剂等量的 75%酒精， 4，7 500 g 离心 5min。短暂干燥 RNA， 沉淀 5 10min， DEPC 水溶解 RNA， 电泳， 拍照， 紫
10、外分光光度计测量 OD260/OD280 的比值， 测定其浓度， 储存 - 70冰箱中。 1.3.2.2RT-PCR： RT-PCR 反应条件为总 RNA5 l， Oligo （dT）1l， 加 DEPC 水 至 10. 5l， 70 变 性 10min， 冰浴 5min， 后加 MgCl24l、 10 buffer 2 l、 dNTP 2l， 总反应体积 20l， 50 1h、 94 10min； 从 总反应体积中取 5l， 加 10 buffer 2.5l、 MgCl21.5 l、 上下游引物各 0.5l、 Taq 酶 0.5l， 建立 25l 反应 体系， 94 变性 5min， 后 9
11、4 30s、 55 30s、 72 1min进行 30 个循环， 72延伸 10min。点样于 1% 的琼脂糖凝胶中， 电泳， 拍照。 1.3.2.3DNA 的回收： 割胶， 透析袋电泳洗脱法。 取 1 l 点样。 1.3.2.4DNA 的转化： 将 PCR 产物连接到 pMD18-T 载体上， 转化至 JM109 的感受态细胞中， 在含有 X- gal、 IPTG、 Amp 的 LB 固体培养基中培养， 形成单菌 落， 挑白色菌， 液体培养， 克隆 PCR 产物。 1.3.2.5质粒的提取、 鉴定： 按试剂盒要求提取质 粒， EcoR和 Hind（Katara） 双酶切鉴定质粒。取 液体菌液
12、 200l， 测序。 1.3. 2. 6地高辛 （DIG） 标记探针： 纯化后的 DNA 1l、 上下游引物各 3l、 去离子水 34.5l， 94变性 10min， 冰浴 5min， 加 10 Ebuffer 5l、 DIG DNA 3 l、 Ex Taq 0.5l， 94 1min， 后 94 30s、 45 30s、 72 1min 进行 30 个循环， 72延伸 10min， 取 2l 与纯化 的 DNA 1l 一同电泳， 拍照， - 20保存。 1.3.3Northern 杂交 1.3.3.1总 RNA 的提取： 同上。 1.3. 3. 2RNA 的琼脂糖凝胶电泳： 每一样品取 50
13、g， 纯化后稀释到 5l， 加 15.8l 变性液， 65变性 10min， 冰浴 5min， 各加 2l 上样缓冲液， 混匀， 变性 胶电泳。 1.3.3.3Northern 转移： 割胶， 用毛细管转移法 6， 将 RNA 吸引至硝酸纤维素 （NC） 膜上， 转移液为 20 SSC。转移后， 将 NC 膜置于滤纸上， 室温干燥 1h， 紫外线下照射 4min 固定后， 用 6 SSC 洗膜， 再置于 滤纸上， 干燥。 1.3.3.4DNA 探针与膜上的 RNA 杂交： 将 NC 膜放 入杂交盒中， 50预杂交 1h。将已标记的探针煮沸 变性 10min， 冰浴 5min， 加入预杂交液中，
14、 50杂交 过夜。用洗液洗 5min 2 次， 室温， 振荡； 洗液 洗 15min 2 次， 68， 振荡； 缓冲液洗 1min， 室温； 缓冲液洗 30min， 室温， 振荡； 抗 DIG 抗体 2l + 20ml 缓冲液洗 30min， 室温， 振荡； 0.3% Tween20 洗 15min 2 次， 室温， 振荡； 缓冲液洗 5min， 室温， 振荡。 1.3.3.5检测： 取出 NC 膜， 用 CDP-StarTM300 l 滴 于膜上， 混匀 5min， 在 Image Master VDS-CL 上成像， 用计算机图像分析仪检测 mRNA 的相对含量。 2结果 2.1实验性牙髓
15、炎动物模型 正常对照组： 牙髓组织内有少量血管和大量散 在分布的成纤维细胞， 在牙髓与牙本质交界处的髓 腔侧有一层柱状排列的成牙本质细胞。牙髓炎 1 天 组： 穿髓孔下方牙髓组织内有大量炎细胞浸润， 成牙 本质细胞轻度紊乱， 血管内有少量红细胞， 炎症反应 区外围成纤维细胞增生。牙髓炎 3 天组： 炎症反应 区成牙本质细胞空泡变性， 排列紊乱， 牙髓血管增 多、 扩张， 其外围细胞主要是白细胞和纤维样细胞。 牙髓炎 6 天组： 残屑和有活力的牙髓间有一炎细胞 带， 成牙本质细胞液化、 坏死， 排列成网状， 其周围有 较多的脓细胞， 微脓肿形成， 牙髓血管管腔内有大量 红细胞。 2.2探针的制备
16、 OD260/OD280= 1.989， 在 1.8 2.0 之间， 说明 纯度良好， 可以进行逆转录反应。以逆转录产物 为模板的 PCR 产物经电泳， 出现略小于 564bp 的条 带， 与预期设计的片段长度 407bp 一致 （图 1） 。 DNA 回收的结果见图 2， 其片段大致在 564bp 左右， 可进行下一步的连接反应。质粒的酶切结果见图 3， 说明该菌珠存在含有目的片段的质粒 DNA， 可以 进行测序工作。测序结果证实该目的片段是 ET- 1 的基因， 因为 ET-1 的基因表达是一样的， 所以可 以用它做探针。因 DIG 是半抗原， 用它标记的探 针分子量比正常的质粒要大 （图
17、 4） 。 732第 3 期刘英群， 等 . 内皮素的 mRNA 在实验性牙髓炎组织中的表达 图 1 PCR 产物电泳结果 图 2 DNA 回收结果 图 3 质粒的酶切结果 图 4 Marker 2.3ET-1mRNA 的表达 2.3.1 牙髓炎模型各组总 RNA 的 OD260/OD280值见附 表， 其结果说明纯度良好， 可以进行 Northern 杂交。 附表总 RNA 的吸光光度比值和浓度 组别OD260/OD280浓度 （ g l - 1） 正常对照组1.9241.03 牙髓炎 1 天组1.9220.87 牙髓炎 3 天组1.9271.30 牙髓炎 6 天组1.9840.89 2.3
18、.2Northern 杂交， 正常对照组可检测到较低含 量的 ET-1mRNA 杂交信号， 牙髓炎 1 天组 ET-1 mR- NA 明显上升， 牙髓炎 3 天组 ET-1 mRNA 达到高峰， 牙髓炎 6 天组仍有杂交信号且比正常组高， 积分光 密度值见图 5。 图 5 Northern 杂交检测 ET-1mRNA 的相对水平 3讨论 本实验是牙髓炎模型建立， 旨在研究牙髓组织 的情况， 因此， 既不能选择牙髓组织未发育完全的大 鼠， 也不能选择牙髓血运不丰富， 已老化的大鼠。故 采用 3 个月左右的成鼠， 体重大约在 250 300g， 尽 量减少人为产生的误差。 有关实验性动物牙髓炎模型
19、的建立， 国内外学 者所采用的方法有 6： 高热刺激法、 单纯穿髓开放 法、 酸蚀开放联合刺激法、 软龋置入法， 而较多采用 的是机械刺激联合化学诱导剂的方法。但鉴于本实 验的动物是大鼠， 其磨牙较小， 难以制备深洞， 多以 穿髓法进行实验。为了避免根髓由于难以承受如此 强大的外界刺激而在尚未观察到炎症发生、 发展全 过程时就已坏死， 故采用改良的单纯穿髓开放方法， 使冠髓尽量损伤到最小。 在基因表达的分析中， RNA 转录的稳态水平是 监测组织的基因表达活性最方便的参数之一。 Northern杂交是经典的 RNA 分析方法， 它有许多优 点 9： 可提供来自一个基因的 RNA 种类的数目、
20、分 子大小及丰度等信息， 这是其他方法所不能做到的； 它还可将 RNA 保留在膜上供反复检测。其缺点是， 从组织提取的 RNA 必须是高质量的和未降解的， 所 以要用大量的起始样品以及更多的时间才能得到结 果。因此， 在本实验中， 预计用 20 只大鼠做杂交实 验， 而实际用了 32 只大鼠。 总 RNA 的上样量要足够， 本实验曾用 10 g、 20g 还未见杂交信号的产生， 当加样量达到 50g 时， 则正常组、 牙髓炎 1 天组、 3 天组、 6 天组均有杂 交信号的产生， 但杂交信号较弱， 与严焱 7报道的用 少量的牙髓组织即可获得较多的总 RNA 有所不同， 而大致趋势是一致的。可能
21、是 RNA 片段在转移至 硝酸纤维素膜时保留不足， 或由于紫外线交联时， 固 定过度， 从而降低了膜上有用的 RNA， 或由于纯化 RNA 的过程中， 部分 RNA 可能会损失， 或由于取材 部位不同等原因造成的。 本实验是观察 ET-1mRNA 在正常牙髓及炎性牙 髓的不同时期表达的变化， 结果 ET-1 在正常对照组 就已有表达， 与 Casasco 等的报道相一致， 其含量的 相对稳定， 提示可能与牙髓微循环的调节、 组织营养 供给有关， 而牙髓微循环是牙髓炎的首发部位， 在单 纯开放法所致的牙髓炎中， 牙髓炎 1 天组， 牙髓组织 内 ET-1 的 mRNA 表达升高， 推测 ET-1
22、 与炎症的关 系较为密切， 牙髓发生炎症时， 受损的细胞可释放大 量的炎症介质， 引起血管扩张， 通透性增加， 损伤内 皮细胞， 触发了 ET 的合成释放增加， 引起血管收 缩， 这是它对炎症时血管扩张的一种保护性反应， 可 能在牙髓修复中起一定的作用； 牙髓炎 3 天组达到 832哈尔滨医科大学学报第 39 卷 高峰， 可能由于炎症的持续性刺激， 使局部血管处于 强烈收缩状态， 造成血流动力学改变、 组织营养供给 失调、 自体细胞及邻近细胞功能异常， ET-1 成为一 种内源性的致病因素， 使升高加剧； 牙髓炎 6 天组又 有所下降， 但比正常组要高， 其表达与病程有关， 并 与炎症程度呈正
23、相关， 可能由于组织受损， 内皮细胞 过度损伤， 降解 ET 所致。从分子水平证实 ET-1 与 牙髓炎的关系， 与报道 2的 ET 在人正常及炎症牙髓 中没有显著的变化不一致， 这可能是由于所采用的 材料和方法不同造成的。我们通过建立实验性牙髓 炎模型， 使取材更直接、 更方便， 准备工作会更充分。 研究结果表明， 正常牙髓组织中含有 ET-1， 炎 症时显示高于正常对照组， 在炎症初期， 可减少炎性 渗出， 限制炎症区域扩散， 维持牙髓内环境的稳定。 由于炎症状态的持续， 破坏了牙髓内部原有的生理 平衡状态， 导致血管持续强烈收缩， 血液供给不足， 影响牙髓组织的活力， 提示与牙髓炎的发生
24、发展密 切相关， 起着重要的作用。与众多学者报道 8的 ET 在牙髓微循环中起作用， 且参与牙髓血流的调节相 一致。 目前基础医学与牙髓生物学结合越来越紧密， 对牙髓组织潜在的修复能力和牙髓病因机制的研 究， 已深入到细胞因子、 氧衍生自由基和神经肽等多 个方面， ET-1 与炎症介质、 血管活性介质的关系密 切。因此本研究认为， 将 ET-1 引入到牙髓生物学中 是非常有价值的研究， 在去除外界因素的前提下， 能 否通过改变 ET-1 的局部表达量， 促进牙髓细胞的增 殖， 达到限制炎症发展， 治疗牙髓炎的目的， 如应用 内皮素转化酶抑制剂、 受体拮抗剂等来缓解或治疗 牙髓炎， 这将是牙髓病
25、研究的一个新课题。 本实验研究了 ET-1mRNA 的表达， 但在牙髓组 织中的为何种细胞表达， 以及与其它免疫活性物质 如物质 P、 降钙素基因相关肽 （CGRP） 、 一氧化氮等 的关系有待进一步研究。 参考文献 1 Hardebo JE， Kahrstrom J， Owman C， et al.Endothelin is a potent con- strictor of human intracranial arteries and veins J . Blood Vessels， 1989， 26 （5） ： 249-253. 2 Casasco A， Casasco M， Ciuf
26、freda M， et al. Immunohistochemical evi- dence for the occurrence of endothelin in the vascular endothelium of normal and inflamed human dental pulp J .J Dent Res， 1992， 71 （3） ： 475-477. 3 王忠东， 文玲英， 金岩， 等.人牙髓血管内皮细胞骨形成蛋白-3 基因表达的研究 J .牙体牙髓牙周病学杂志， 1997， 7 （4） ： 231. 4 Gilbert TM， Pashley DH， Anderson
27、RW.Response of pulpal blood flow to intra-arterial infusion of endothelin J .J Endod， 1992， 18 （5） ： 228- 231. 5 Kimberly CL， Byers MR.Inflammation of rat molar pulp and periodonti- um causes increased calcitonin gene-related peptide and axonal sprout- ing J .Anat Rec， 1988， 222 （3） ： 289-300. 6 孙卫民
28、， 王惠琴.细胞因子研究方法 M .北京： 人民卫生出版 社， 1999.331. 7 严焱， 刘正.细菌及内毒素致大鼠试验性牙髓炎的牙髓组织病 理学研究 J .现代口腔医学杂志， 1999， 13 （3） ： 167. 8 董宗祈. 内皮素的研究进展 J . 中国实用儿科杂志， 1998， 13 （4） ： 237. （上接 235 页） 常， 住院 14 天出院。嘱患儿 1.5 2 年再入院拆除钢板。 3讨论 漏斗胸的手术方法很多 1 4， 但还没有哪个术式十分完 美， 有感于患慢性肺阻塞性疾病的成人患者， 其胸部可逐渐 变成桶状， 也就是说成人的骨发育已经成熟、 质地硬、 弹性 小， 尚
29、可塑型， 儿童骨骼正处于发育期， 骨质有弹性， 可塑性 大， 更可以通过外力来改变其形状。Nuss 5对此项微创技术 的回顾性总结认为运用钢板支架技术具有创伤小、 恢复快、 患儿痛苦小等诸多优点， 最适合的年龄是 3 6 岁， 因为这个 年龄段胸廓弹性最佳， 最易塑型， 而且年龄越小， 住院时间越 短， 并发症越少， 即年龄越小， 手术越易操作。本组采用自行 设计的钢板内支架矫治漏斗胸， 效果满意， 手术操作侵袭小， 患儿术后恢复快， 无反常呼吸发生， 特向同行介绍。 参考文献 1 文平， 曹立盛， 郭成中， 等. 胸骨前钢板架内固定治疗漏斗胸 J .临床小儿外科杂志， 2002， 1 （2）
30、 ： 103-104. 2 周汉槎， 李国虎， 张春芳， 等. 带血管蒂自体肋骨矫治漏斗胸 J .中华胸心血管外科杂志， 1997， 13 （6） ： 373-374. 3 高炜， 张世范， 张德海， 等.改良带腹直肌蒂胸骨反转术治疗小 儿漏斗胸 J .中华外科杂志， 2000， 38 （13） ： 906-907. 4 杨东元， 保阪善昭， 原口和久， 等.日本和欧美漏斗胸治疗进展 J .中华整形外科杂志， 2003， 19 （2） ： 142-143. 5 Nuss D， Kelly RE Jr， Croitoru DP， et al.A 10 year review of minimally invasive technique for the correction of pectus excavatum J .J Pediatr Surg， 1998， 33 （4） ： 545-552. 932第 3 期刘英群， 等 . 内皮素的 mRNA 在实验性牙髓炎组织中的表达