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1、文章编号 1007-3949 （2006） 14-02-0107-04 实验研究 半边莲生物碱抑制内皮素诱导的大鼠主动脉 平滑肌细胞增殖 王婧婧1，范秀珍2，刘尚明1，魏欣冰1，任冬梅3，陈 融1，李 莉1，胡维诚1 （山东大学 1.医学院；2.护理学院；3.药学院， 山东省济南市 250012） 关键词 病理学与病理生理学； 半边莲生物碱对血管平滑肌细胞增殖的影响； 免疫细胞化学； 半边莲生物 碱； 内皮素； 增殖细胞核抗原； 增殖 摘要 目的研究半边莲生物碱对内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用。方法用内皮素 1 剌激大鼠 主动脉平滑肌细胞增殖， 以细胞计数试剂盒计数细胞个数、 氚标胸腺嘧
2、啶脱氧核苷掺入检测 DNA 的合成量、 免疫细 胞化学技术观察增殖细胞核抗原的表达活性作为细胞增殖的指标， 并应用台盼兰拒染、 乳酸脱氢酶检测观察半边 莲生物碱的细胞毒性反应。结果内皮素 1 （10- 7mol/ L） 可明显促进细胞增殖 （与对照组相比， P 0.05） 。结论半边莲生物碱 （50 200 mg/ L） 可浓度依赖性地抑制内皮素 1 所诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖， 且此抑制作用并非是通过细胞毒性 作用实现的。 中图分类号 R363 文献标识码 A Lobelia Chinensis Lour Alkaloids Inhibiting Rat Aortic Vascular
3、 Smooth Muscle Cell Pro- liferation Induced by Endothelin WANG Jing-Jing1，FAN Xiu-Zhen2，LIU Shang-Ming1，WEI Xin-Bing1，REN Dong-Mei3，CHEN Rong1，LI Li1，and HU Wei- Cheng1 （1. School of Medicine；2. School of Nursing；3. School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China） KEY WORDSL
4、obelia Chinensis Lour； Aortic Vascular Smooth Muscle Cell； Endothelin；Proliferating Cell Nuclear Antigen； Proliferation； Rat ABSTRACTAimTo determine the effect of scutel laria barbata alkaloid（LCLAs） on proliferation of cultured vascular smooth muscle cell（VSMC） induced by endothelin （ET） .MethodsRa
5、t aortic VSMC was cultured and divided into four groups：ET group，ET + LCLAs group，ET + BQ-123（the selective ETA receptor antagonist） group and control group，then the cell proliferation activity was subsequently quantified by cell counting kit-8 to count cell number，3H-TdR incorporation to measure DN
6、A synthesis and quantitative immunohistochemical technique to investigate the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） in VSMC.Cytotoxicity was measured by Lactate Dehydrogenase（LDH） colorimetry and Trypan blue exclusion tests. ResultsCompared with the control group，ET-1 （10-7mol/ L）
7、significantly enhanced the proliferation activity of VSMC （P 95%。待细胞生长汇合出现 “峰与谷” 结构后， 用含 0.25%胰蛋白酶消化液消化、 传代培养。选 3 8 代 细胞用于实验。 1.4细胞计数 3 按细胞密度 0.4 108/ L 将 VSMC 接种于 96 孔 培养板， 每孔 0.1 mL， 细胞生长至次汇合状态时， 更 换无血清 DMEM 饥饿培养 24 h， 使细胞同步化于 G0/ G1期。根据不同的实验分组加药：对照组加 0. 2% NCS 的条件培养基；内皮素组加内皮素 1 终浓 度为 10-7mol/ L 的
8、条件培养基；内皮素 + LCLA 组 加内皮素 1 （10-7mol/ L） 和不同剂量的 LCLAs （终浓度 为 50、 100、 200 mg/ L） ；内皮素 + BQ-123 组加内皮 素 （10-7mol/ L） 和 BQ-123（10 -6mol/ L） 的条件培养基； 孵育 24 h 后参照细胞计数试剂盒 （cell counting kit-8） 说明书在酶标仪 450 nm 波长处读取各孔吸光度值 （absorbance，A） ， 其数值大小与细胞的数目成正比。 1.5氚标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入 将 VSMC 消化分离制成细胞悬液， 调整密度为 5 107/ L 种入 24
9、孔培养板， 按以上实验分组及给药 方案对细胞处理后， 继续孵育 18 h， 向各孔培养基中 加入3H-TdR 至终浓度为 0.1 Ci/ 100 L， 孵育 8 h， 加 入冷 PBS 液终止反应。回收细胞， 液体闪烁计数仪 行放射活性计数测定。 1.6免疫细胞化学染色 血管平滑肌细胞消化传代至 6 孔培养板上 （板 内预先置入 1 cm2消毒盖玻片） ， 实验分组及给药方 案同上， 取出盖玻片， 按照免疫组织化学试剂盒步骤 检测增殖细胞核抗原的表达。采用 SimplePCI（Com- pix，Inc.） 图像分析系统对各组免疫细胞化学结果进 行图像分析， 所有玻片均在同一放大倍数 （ 200
10、） 、 同一光强度下分析。每组细胞各取 5 张玻片， 每张 玻片随机抽取 3 个视野， 计算出阳性反应细胞的平 均吸光度值 （average absorbance，A） ， 以上数据均由图 像分析系统自动计算， 定量细胞中 PCNA 表达水平 的高低。 1.7不同浓度半边莲生物碱的细胞毒性实验 细胞接种于 96 孔培养板内， 在不同浓度 （0、50、 100 和 200 mg/ L） 的 LCLAS 溶液中孵育 24 h， 观察细 胞的毒性反应 （变性、 坏死、 脱落） ， 台盼蓝染色排斥 实验计算细胞存活率， 并按乳酸脱氢酶测试盒说明 用紫外分光光度计测定乳酸脱氢酶释放量。 1.8统计学处理
11、 检测 结 果 均 以 x s 表 示，统 计 学 分 析 用 SPSS12.0 软件进行单因素方差分析 （one-way ANO- VA） ， 多样本均数之间两两比较采用 q 检验。 P 0. 05） 。结果表明 LCLA 抑制 VSMC 增殖不是非特异性细胞毒作用所致 （表 2） 。 3讨 论 内皮素 1 不仅具有强大的缩血管作用，还是一 图 2. 各组药物对增殖细胞核抗原表达活性的影响 （ 200） A 为对照组； B 为内皮素组； C 为内皮素 + 100 mg/ L LCLA 组； D 为内 皮素 + BQ-123 组。 901CN 43-1262/ R 中国动脉硬化杂志 2006
12、年第 14 卷第 2 期 表 2. 不同浓度半边莲生物碱对细胞生存率和上清液乳酸脱 氢酶活性的影响（x s，n = 6） 分组 LCLA 浓度 （mg/ L） 细胞生存率 （%） 乳酸脱氢酶活性 （U/ L） 对照组97.5 3.1523 22 LCLAs 组 5098.8 2.8530 20 10097.4 5.2518 36 20097.1 3.9522 39 种平滑肌细胞促有丝分裂原，能促进细胞增殖与 DNA 合成 4。本文通过细胞计数试剂盒计数细胞个 数、 3H-TdR 掺入检测细胞 DNA 的合成量、 免疫细胞 化学染色观察 PCNA 的表达活性方法证实了上述理 论。 内皮素只有与靶
13、细胞膜上的内皮素受体 （ETR） 结合后， 启动一系列细胞内信号传递过程， 方可实现 其生物学效应。内皮素受体 （ETR） 分为 ETAR、 ETBR 和 ETCR 3 类，其中 ETAR 主要分布于 VSMC，对内皮 素 1 有选择性亲和性，介导内皮素 1 对血管的收缩 和血管壁增殖的作用，在动脉粥样硬化等血管增生 性疾病的发生、 发展过程中起着重要的中介作用 5。 有报道， 动脉粥样硬化和高血压患者血浆内皮素 1 的 水平增高 6， 在粥样硬化斑块中 ETAR 表达增高， 本 文结果发现， 内皮素 1 的上述促增殖作用能完全被 ETAR 特异性阻断剂 BQ123 所阻断， 说明内皮素 1
14、的 促 VSMC 增殖作用主要是由 ETAR 所介导的。 内皮素与自然界存在的某些生物毒素有一定亲 缘关系 7， 包括蛇毒、 蝎毒和蜂毒。SRTX 是从蛇毒中 提取 的 一 种 毒 素，可 分 为 SRTX-a （ S6a） 、SRTX-b （S6b） 、 SRTX-c （S6c） 和 Btx（S6c） 4 个亚型。对内皮素 的 4 种亚型进行氨基酸序列分析发现， 所有这些异构 肽均包括 21 个氨基酸， 其一级结构具有明显的同源 性， 至少有 60% 80%氨基酸同源， 而且有相同的 C- 末端。研究证实， 内皮素的 C-末端特别是 Trp21、 两 个二硫键、 氨基和羧基端以及 Asp8
15、和 Glu10 的羧酸 组对它的生物学活性起了重要的作用， 构成了 SRTX 和内皮素表面的 “共同和基本” 的生物活性位点 8。 SRTX 和内皮素构成一组同源性异构肽家族， 竞争性 结合相同的 G 蛋白偶联受体， 通过 IP3 、 Ca 2 + 钙调蛋白 激酶途径， 引发各类生物学效应 9， 因此从抗蛇毒中 药中探寻防治动脉粥样硬化和高血压等疾病的方法 是可行的。 近年来发现抗蛇毒中药在拮抗内皮素作用、 抑制 VSMC 增殖和保护血管内皮细胞 （vascular endothelial cell， VEC） 功能及损伤修复方面， 有着独到的作用 10。 LCLA 为我国传统抗蛇毒中草药半边
16、莲的有效成分， 本研究也证明它可呈浓度依赖性抑制内皮素 1 所诱 导的 VSMC 增殖活性， 使细胞数目和3H-TdR 掺入减 少， PCNA 蛋白表达减弱。说明 LCLA 具有抑制 VSMC 增殖的作用。 半边莲生物碱抑制内皮素 1 所诱导的 VSMC 增 殖并非源自它的细胞毒性作用， 因为用上述方法测得 用药后 VSMC 的增殖活性、 3H-TdR 掺入量和 PCNA 蛋 白合成均比内皮素 1 处理组显著降低， 但台盼兰染色 和培养基上清中乳酸脱氢酶活力并无改变， 后者是反 映细胞膜功能状况的一种重要指标。因此可以断定 VSMC 活性下降并非细胞坏死所致。 多年来用活血化瘀法和芳香温通法治
17、疗动脉粥 样硬化性心脑血管病取得良好效果。但尚未有用清 热解毒类中药防治心脑血管病的报道， 本项研究首次 用离体细胞培养技术发现 LCLAs 能够抑制 VSMC 增 殖， 提示该类中药有可能用于临床防治动脉粥样硬化 性心脑血管疾病。 参考文献 1 杜艳芝，闫晓梅，胡维城，刘玉梅，张宝华，李 莉，等 .清热解毒液对 高脂血症大鼠内皮素影响的研 究 J .中 国 病 理 生 理 杂 志，1999，15 （12） ：1 134-137 2 李瑞峰，温海涛，李 莉，陈 融，任冬梅，胡维城，等 .半边莲不同组分 对内皮细胞内皮素及内皮源一氧化氮合酶代谢的影响 J .中国动脉硬 化杂志，2002，10（1
18、） ：19-22 3 Ryuji H，Yoichi F，Masashi M，Yuko I，Fabio P，Silval，et al.SMYD3 encodes a histone methyltransferase involved in the proliferation of cancer cell J .Nature Cell Biology，2004，7（6） ：731-740 4 Komuro I，Kurihara H，Sugiyama T，Yoshizumi M，Takaku F，Yazaki Y.En- dothelin stimulates c-fos and c-myc ex
19、pression and proliferation of vascular smooth muscle cell J .FEBS Lett，1988，238（2） ：249-252 5 Sakurai T，Yanagisawa M，Masaki T.Molecular characterization of endothelin re- ceptors J .TIPS Rev，1992，13：103 6 荆 清 .内皮素及其受体与动脉粥样硬化 J . 中国动脉硬化杂志， 1997，5（2） ：172-176 7Sokolovsky M.Structure-function relations
20、hips of endothelins，sarafotoxins，and their receptor subtypes J .J Neurochem，1992，59（3） ：809-821 8 Ducancel F，Matre V，Dupont C，Lajeunesse E，Wollberg Z，Bdolah A，et al. Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding precursors of sarafotoxins. Evi- dence for an unusual“rosary-type”organization J .J Biological Chemistry， 1993，268（5） ：3 052-055 9 Pollock DM，Keith TL，Highsmith RF.Endothelin receptor and calcium signaling J .FASEB J，1995，9：1 196-204 10 范秀珍 .清热解毒类中药抗动脉粥样硬化作用机制的研究进展 J . 中国动脉硬化杂志，2004，12（2） ：246-248 （此文编辑朱雯霞） 011ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler，Vol 14，No 2