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1、glibenclamide and chelerythrine respectively，the anti- arrhythmic effects induced by U50488H in the rats dur- ing myocardial ischemia and reperfusion were signifi- cantly attenuated or even completely blocked. The anti-arrhythmic effects of U50488H were not signifi- cantly affected by pretreatment w
2、ith genistein. In comparison with normal rats，the contents of Angand ET in plasma of I/ R group were significantly in- creased，but the content of NO was decreased. With the administration of U50488H，the contents of Ang and ET in plasma of rats in U50488H + I/ R group were significantly decreased. Me
3、antime the content of NO was increased.Conclusions U50488H-induced anti-arrhythmic effects in the rats with myocardial is- chemia and reperfusion are mediated by k-opioid re- ceptor. The signaling pathway may be related with Gi/ o，PKC，and KATPchannel. The activation of k- opioid receptor may elicit
4、anti-arrhythmic effect through the down-regulations of Ang or ET and up-regulation of NO in plasma of rats. Key words：ischemia/ reperfusion；k-opioid receptor； U50488H；arrhythmia 卡维地洛与美托洛尔在犬急性心肌梗死晚期 再灌注中的心肌保护作用的比较 徐少东1， 马礼坤1， 屈朝法1， 余 华1， 贾雪梅2 （1. 安徽医科大学附属省立医院心内科， 安徽 合肥 230001； 2. 安徽医科大学形态学教研室， 安徽 合肥
5、230032） 中国图书分类号： R-332； R 322. 11； R 329. 25； R 329. 28； R 542. 220. 53 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2006） 06 -0719 -04 摘要： 目的 探讨卡维地洛在犬急性心肌梗死 （AMI） 晚期再 灌注中的心肌保护作用及其与美托洛尔的比较。方法 18 条健康成年杂种犬随机平均分为 3 组： 单纯晚期再灌注组 （late reperfusion group，LR） 、 晚期再灌注预加美托洛尔组 （late reperfusion + metoprolol group，LR + M） 、 晚期再灌
6、注预 加卡维地洛组 （late reperfusion + carvedilol group，LR + C） 。 分别灌服生理盐水、 美托洛尔 （1 mgkg -1d-1） 、 卡维地洛 （1 mgkg -1d-1） 共7 d。所有犬于 d 7 灌药2 h 后开胸结 扎左冠状动脉前降支 （距离起点 5 mm）6 h， 再灌注 6 h， 制 成 AMI 晚期再灌注模型。后处死取左室心肌梗死边缘区， 比色法测定心肌超氧生物歧化酶 （SOD） 和还原性谷胱甘肽 酶 （GR） 活性、 丙二醛 （MDA） 含量， 免疫组化法检测心肌 Fas 和 FasL 蛋白表达， TUNEL 法测心肌细胞凋亡指数 （
7、AI） 。结 果 与 LR 相比， LR + M 的 SOD、 GR 活性以及 MDA 含量无 改变 （P 0. 05） ， 而 LR + C 的 SOD、 GR 活性均升高 （P 2 h） ， 常规二甲苯 （15 min 共 2 次） 、 梯度乙醇 （各10 min） 脱蜡至水， PBS 液洗5 min 共3 次， 放入湿盒， 加入 A 液 （3% H2O2） 50 l， 37温箱 中孵育 10 min 灭活内源性过氧化物酶，PBS 液洗 5 min 3 次， 放入湿盒， 加入 Triton X-100 50 l， 37 温箱中孵育 10 min 增加膜的通透性， PBS 液洗 5 min
8、3 次， 0. 01 molL -1枸橼酸钠修复液微波修 复，PBS 液洗 5 min 3 次， 放入湿盒， 滴加 5% BSA 封闭液， 37温箱孵育 0. 5 h， 不洗， 滴加1 : 50稀释 的 Fas 或 FasL 一抗 （兔抗 IgG） 37温箱孵育1 h， 后 置 4 冰箱中过夜。次日取出， PBS 液洗 5 min 3 次， 放入湿盒， 滴加二抗 （生物素化山羊抗兔 IgG） 37温箱孵育 1 h，PBS 液洗 5 min 3 次， 放入湿 盒， 滴加 SABC 37温箱孵育 1 h， PBS 液洗 5 min 4 次， 放入湿盒， 滴加 DAB 显色， 蒸馏水洗涤， 脱水、
9、透明、 封片， 显微镜观察， 阳性细胞为棕黄色。每张 切片在 10 40 光镜下选择阳性表达区内的 10 个无 重叠视野， 采用图像分析系统测量阳性染色的光密 度值 （OD） ， 计算其均值作为代表值。 1. 5 心肌梗死边缘区心肌细胞凋亡指数测定 采 用武汉博士德公司的试剂盒， 按其说明采用末端脱 氧核糖核苷酸转移酶 （TdT） 介导的带荧光的 dUTP 缺口末端标记 （TdT-mediated dUTP nick end labe- ling， TUNEL） 法标记心肌凋亡细胞核中的 DNA 3， -OH末端。步骤如下： 按上述方法石蜡切片常规脱 蜡至水， 双蒸水液洗 5 min 3 次，
10、 放入湿盒， 加入 A 液 （3%H2O2） 50 l， 37温箱中孵育 10 min 灭活内 源性过氧化物酶， 双蒸水液洗 5 min 3 次， 放入湿 盒， 加入 Triton X-100 50 l， 37温箱中孵育 10 min 增加膜的通透性， 双蒸水液洗 5 min 3 次， 放入湿 盒， 滴加 Proteinase K 37温箱中消化 10 min，TBS 液洗 2 min 3 次， 放入湿盒， 加入标记缓冲液稀释 的 TDT 和地高辛的 dUTP， 37温箱中标记 2 h， TBS 液洗 2 min 3 次， 放入湿盒， 滴加 5% BSA 封闭液， 37温箱孵育 0. 5 h，
11、 不洗， 加入抗体稀释液稀释的 生物素化地高辛抗体， 37温箱孵育 0. 5 h，TBS 液 洗 2 min 3 次， 放入湿盒， 加入抗体稀释液稀释的 SABC， 37温箱孵育 0. 5 h， TBS 液洗 5 min 4 次， 放入湿盒， 滴加 DAB 显色， 蒸馏水洗涤， 苏木精轻度 复染， 脱水、 透明、 封片， 显微镜观察， 阳性细胞核为 棕黄色。每张切片在 10 40 倍光镜下选择阳性表 达区内的 10 个无重叠视野， 细胞凋亡指数 （AI） ： 阳性细胞数/ 视野所有细胞总数 100 ，计算其均 值作为代表值。 1. 6 统计学分析 数据以-x s 表示， 组间比较采 用 t 检
12、验。 2 结果 2. 1 3 组对 SOD 活性、 GR 活性、 MDA 含量的影 响 与晚期再灌注组相比， 晚期再灌注预加美托洛 尔组的 SOD、 GR 活性以及 MDA 含量无改变 （P 0. 05） ， 而晚期再灌注预加卡维地洛组的 SOD、 GR 活性均升高 （P 0. 01） ， 而 MDA 含量降低 （P 0. 05） 。 2. 2 心肌梗死边缘区 Fas 和 FasL 蛋白以及凋亡细 胞表达 心肌梗死边缘区 Fas 和 FasL 蛋白以及凋 亡细胞在 3 组中的不同表达情况分别见附图 （Fig 1 027中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bullet
13、in 2006 Jun； 22 （6） Fig 1 Expression of Fas protein of myocardial infarction brim deteced by immunohistochemistry （SP 400） 1A： LR group； 1B： LR + M group； 1C： LR + C group Fig 2 Expression of FasL protein of myocardial infarction brim deteced by immunohistochemistry（SP 400） 2A： LR group； 2B： LR + M
14、group； 2C：LR + C group Fig 3 Expression of apoptotic myocardial cells of myocardial infarction brim deteced by TdT- mediated dUTP nick end labeling， TUNEL（TUNEL 400） 3A： LR group； 3B： LR + M group； 3C： LR + C group 3） 。与晚期再灌注组相比， 晚期再灌注预加美托 洛尔组的 Fas 和 FasL 蛋白以及凋亡细胞表达下降， 差异有显著性 （P 0. 05） ， 并且晚期再灌注预加卡
15、维地洛比晚期再灌注预加美托洛尔亦下降明显， 两 组相比差异有显著性 （P 0. 05） 。 Tab 1 Comparison of SOD， GR activity and MDA content of myocardial infarction brim in three groups（-x s， n =6） Group SOD / NUmg -1 Pro GR / NUmg -1 Pro MDA / molg -1 LR67.71 7.75 36.74 7.28 22.79 7.23 LR + M68.69 8.6037.61 7.0122.80 5.96 LR + C90.14 15.6
16、6*61.38 4.85*19.48 4.06* *P 0. 05，*P 0. 01 vs LR，LR + M group Tab 2 Comparison of Fas/ FasL protein expression and apoptotic index of myocardial infarction brim in three groups（-x s， n =6） GroupFas/ ODFasL/ ODAI/ % LR0.742 0.0270.642 0.02831.09 1.33 LR + M0.656 0.033*0.547 0.026*26.89 2.49* LR + C0.
17、493 0.078#0.425 0.022#21.26 1.78# *P 0. 05 vs LR group；#P 0. 05 vs LR + M group 3 讨论 AMI 早期再灌注时心脏肾上腺素能 受体， 尤 其是 1受体的激活和上调 2是造成 AMI 早期再灌 注损伤的原因之一。既往研究表明 受体阻滞剂 美托洛尔和卡维地洛通过其 受体阻滞在 AMI 早 期再灌注中具有心肌保护作用 3， 4。但卡维地洛与 美托洛尔不同， 其结构中含有咔唑环， 并且其代谢产 物 BM-910228 是更有效的抗氧化剂， 约为卡维地洛 的 50 100 倍或维生素 E 的1 000倍， 而大量活性氧 是造
18、成 AMI 早期再灌注损伤的重要原因之一， 研究 表明卡维地洛通过其抗氧化作用 AMI 早期再灌注 损伤中有心肌保护作用 1。关于卡维地洛在 AMI 梗死相关动脉晚期开通即晚期再灌注是否同样具有 心肌保护作用， 目前未见报道。 本研究通过检测心肌抗氧化指标发现， 卡维地 洛能明显减轻 AMI 晚期再灌注梗死边缘区心肌氧 化应激状态， 而美托洛尔则无明显改变。其可能由 于 AMI 后相当长的时间内氧自由基持续增加 6， 同 时持续的心肌缺血减弱了心肌本身的抗氧化能力， 因此在长时间缺血后的晚期再灌注时更易受氧化应 激损伤 7。而卡维地洛的抗氧化作用优于美托洛 尔 8， 因此通过在 AMI 晚期再
19、灌注之前预加卡维地 洛能减少晚期再灌注造成的氧化应激损伤。那么晚 期再灌注造成的氧化应激损伤表现如何， 卡维地洛 对其又有何影响？ 本研究显示， 具有抗氧化作用的卡维地洛比美 托洛尔更能减少 AMI 晚期再灌注后的梗死边缘区 心肌细胞凋亡指数， 表明其可能还通过其 受体阻 制外的抗氧化机制在晚期再灌注中发挥心肌保护作 用。氧化应激可以通过介导炎症反应、 血管内皮细 胞相互作用、 细胞内钙超载引起线粒体内凋亡相关 127中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun； 22 （6） 基因的释放， 同时氧化应激可以激活有丝分裂原蛋 白酶、 核因子
20、 kB、 肿瘤坏死因子 而诱导心肌细胞 凋亡 9， 而通过抗氧化治疗能明显减少 AMI 早期再 灌注的心肌细胞凋亡 10。本研究表明卡维地洛可 能通过其抗氧化作用而比美托洛尔更能减少 AMI 晚期再灌注的心肌细胞凋亡， 尤其是梗死边缘区的 心肌细胞凋亡。 Fas/ FasL 系统是体内直接启动细胞凋亡的死亡 信号转导系统， 并且其易受氧化应激影响而使其激 活促进细胞凋亡 11。本研究显示卡维地洛比美托 洛尔更能明显减少 AMI 晚期再灌注的梗死边缘区 心肌细胞凋亡基因 Fas 和 FasL 蛋白的表达， 提示卡 维地洛可能通过其抗氧化作用减少了 Fas 和 FasL 蛋白的表达， 从而减少 A
21、MI 晚期再灌注的心肌细胞 凋亡， 且这种作用不依赖于其 受体阻滞作用。 综上所述， 卡维地洛和美托洛尔作为 受体阻 制剂在 AMI 晚期再灌注中通过其 受体阻滞而发 挥心肌保护作用， 并且卡维地洛依赖其强大的抗氧 化作用而在 AMI 晚期再灌注中发挥更优越的心肌 保护作用， 从而为临床预防 AMI 晚期再灌注提供实 验依据。 参考文献： 1 徐少东. 卡维地洛在心肌缺血再灌注损伤中的心肌保护作用 J . 心血管病学进展， 2005， 26 （4） ： 390 -2. 2 吴 彦， 付金艳， 聂效云. 卡维地洛对大鼠缺血再灌注心肌损 伤及 1受体密度的影响 J . 中华心血管病杂志， 2004
22、， 32 （8） ： 751 -4. 3 Khandoudi N，Percevault-Albadine J，Bril A， et al. Comparative effects of carvedilol and metoprolol on cardiac ischemia-reperfusion injury J . J Cardiovasc Pharmacol， 1998， 32 （3） ： 443 -51. 4 Feuerstein G，Liu G L，Yue T L， et al. Comparison of metoprolol and carvedilol pharmacolog
23、y and cardioprotection in rabbit ische- mia and reperfusion model J . Eur J Pharmacol， 1998， 351 （3） ： 341 -50. 5 李 保， 马业新， 解 军. 卡维地洛改善心梗大鼠心肌氧化应 激状态 J . 中国药理学通报， 2005， 21 （6） ： 751 -4. 6 Bridges A B，McNeill G P，Pringle T H， et al. A late increase in free radical activity post myocardialinfarction J
24、. Eur Heart J， 1995， 16 （7） ： 899 -915. 7 Ferrari R，Ceconi C，Curello S ， et al. Occurrence of oxidative stress during myocardial reperfusion J . J Mol Cell Biochem， 1992， 111 （1 -2） ： 61 -9. 8 Lysko P G，Webb C L，Gu J L， et al. A comparison of carvedilol and metoprolol antioxidant activities in vitro
25、 J .J Cardiovasc Pharmacol， 2000， 36 （2） ： 277 -81. 9 Zhao Z Q. Oxidative stress-elicited myocardial apoptosis during reperfusion J . Curr Opin Pharmacol， 2004， 4 （2） ： 159 -65. 10韦开福， 马业新， 林英忠. 褪黑素对在体大鼠心肌缺血再灌注 损伤的作用 J . 中国药理学通报， 2005， 21 （4） ： 468 -71. 11徐少东. Fas/ FasL 系统与心肌缺血再灌注损伤 J . 心血管病 学进展， 20
26、05， 26 （6） ： 626 -9. Comparison between cardioprotection of carvedilol and metoprolol on late reperfusion of acute myocardial infarction in canine XU Shao-dong1， MA Li-kun1， QU Chao-fa1， YU Hua1， JIA Xue-mei2 （1. Dept of Cardiology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hef
27、ei 230001， China； 2. Dept of Morphological，Anhui Medical Unversity， Hefei 230032， China） Abstract： Aim To compare cardioprotection effects between carvedilol and metoprolol in canine late reper- fusion of acute myocardial infarction. Methods Eight- een anesthetized dogs were randomly divided into th
28、ree groups：late reperfusion group （LR，n =6） ， late reper- fusion after metoprolol treatment group （LR + M， n = 6） ， and late reperfusion after carvedilol treatment group （LR + C，n =6） ， respectively orally giving physiologi- cal saline，metoprolol （1 mg kg -1 d -1 ） ，and carvedilol （1 mgkg -1 d -1）fo
29、r seven days， and then late reperfusion of acute myocardial infarction model was made by ligating the coronary for 6 h，fol- lowed by reperfusion for 6 h. SOD，GR activity and MDA content of infarction brim myocardium were de- tected by colorimetry，Fas/ FasL were detected by im- munohistochemistry， ap
30、optosis index （AI）were detec- ted by TUNEL. Results Compared with LR， Myocar- dial MDA content in LR + C was decreased， and SOD and GR activities were significantly higher， but LR + M did not change. The expression of Fas/ FasL and apop- tosis index were significantly lowered in LR + M and LR + C， e
31、specially in LR + C. Conclusion Carvedilol and metoprolol have cardioprotection on late reperfu- sion of acute myocardial infarction， and carvedilol is su- perior to metoprolol and the pharmacological effects may due to its antioxidant effect. Key words： carvedilol；metoprolol；acute myocardial infarction； late reperfusion； canine 227中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun； 22 （6）