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1、中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-23 J.n- 20054 506744 N08 6中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-24 J.n- 20054 506 44 N08 6 基金项目:国家自然科学基金9:02;04粤 财企9200?=:6;、9200:=200, 8?- +)/4脑组织置 无菌JKK-n20LL管中备用。 487睾丸组织取材:剪开阴囊皮肤及皮下组织,取 一个完整睾丸置无菌JKK-n20LL管中备用。 587骨髓组织取材:分离两侧股骨和胫骨,去除骨 两端,生理盐水反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液,;7000
2、7 /1in,离心;071in,弃上清,备用。 皮肤、肌肉、脑和睾丸组织入液氮速冻,-M07冻 存。 骨髓组织直接行端粒酶提取。 四、端粒酶提取 ;87冰冻组织样本:切成;0N;5 1厚的切片,取 大约5ND片置于含200 ?冰预冷细胞裂解液的 JKK-n20LL管中。 28 骨髓组织样本:加200 ?冰预冷细胞裂解液 重悬。 冰上孵育0 1in,4 ,;2 000 /1in、 离心20 1in ,取 ;D5 ?上清移入另一JKK-n20LL管中;液氮 中速冻后,-M0 冻存;取;0 ?上清液,加入O0 ? 灭菌双蒸水,行组织蛋白定量。 五、组织蛋白定量分析 取考马斯亮蓝PF250染液;80
3、1?置于玻璃试管 中;加入;00 ?组织匀浆液,混匀,室温放置;0 1in; 紫外分光光度计测定Q:值=波长5O5 n1C,以溶剂为 空白对照。 以牛血清白蛋白=;N50 BC为标准品绘制 标准曲线,依据标准曲线计算组织匀浆蛋白含量。 六、 RCSFJ?T9U法检测组织端粒酶活性 ;8 端粒重复序列的扩增:取25 ?反应混合液, 以每个样本5 B组织蛋白计算, 分别加入组织提取 液,22G2Q定容至50 ?;RCS 扩增:25 引物延伸 25 1in,O4 灭活端粒酶5 1in,然后O4 、0 I,50 、 0 I,D2 、O0 I,0个循环,D2 延伸;0 1in。 28 J?T9U定量检测
4、:取20 ?变性液,加入5 ? RCS扩增产物,室温孵育;0 1in;加入225 ?杂交 缓冲液,混匀;取;00 ?杂交混合液置于微量滴定板 中,D ,孵育2 h;250 ? 漂洗缓冲液漂洗次;加入 ;00 ? 抗地高辛FRQ:工作液, 室温孵育0 1in;250 ? 漂洗缓冲液漂洗5次;加入预热的;00 106? VWX 底物溶液,室温振荡20 1in;加入;00 ?中止反应液 终止反应;酶联免疫检测仪检测=波长450 n1C。 8 端粒酶活性评价:阳性对照Q:值应Y;85,阴 性对照Q:值应Z0825,待检标本Q:值减阴性对照 Q:值Y082为端粒酶阳性。 七、统计学分析 采用99R9;0
5、80统计软件, 对结果行单因素方差 分析。 结果 不同年龄皮肤、肌肉、脑、骨髓和睾丸组织端粒 酶活性结果表明,新生组皮肤、肌肉和脑组织中均有 端粒酶活性表达,其中脑组织和肌肉组织活性较高, 分别为;80;6和08M2O,而皮肤组织端粒酶活性较低, 仅为0854, 与其余各年龄组相比, 差别显著=PZ 080;C;随着年龄的增长,皮肤、肌肉和脑组织端粒酶 活性明显下降,一月龄以后,这三种组织基本不表达 端粒酶活性。 一月组至二年组,骨髓组织的端粒酶活 性分别为;802D、;8;6、08O4、;80D4和08O2,而睾丸 组织则分别为;865、;84M、08OMM、08O46和08M5O。 由 此
6、可见骨髓和睾丸组织持续表达较高端粒酶活性, 虽然睾丸组织端粒酶活性随着年龄的增长呈下降趋 势,但下降的幅度较小,而骨髓组织端粒酶活性基本 保持稳定。 各年龄组间骨髓和睾丸组织端粒酶活性无 明显差别=PY0805C。与睾丸组织相比,除一月组骨髓组 织中端粒酶活性明显低于睾丸组织外=PZ0805C,其余 各年龄组两种组织中酶活性无显著性差异。=图;C 讨论 随着体细胞克隆技术和干细胞技术的巨大发 展,通过VC获得与受治疗患者相同遗传信息的胚胎 干细胞=-1/0niE I-1 E-66I,J9CIC,再利用J9CI分 化多潜能性得到移植治疗或组织工程所需的种子细 胞,从而避免了异体间移植所引发的免疫
7、排斥、病原 体的传播等问题。 因此VC将成为细胞移植治疗和组 织工程中最具应用前景的种子细胞来源;,2。 56; C MY K 中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-23 J.n- 20054 506744 N08 6中华神经医学杂志2005年6月 第4卷 第6期Chin J N-./01-24 J.n- 20054 506 44 N08 6 由于9C研究起步晚,对于何种供体细胞最适合 用于9C, 尚缺乏依据和标准。 与动物克隆相比,9C 选择供体细胞的来源明显受取材限制。目前动物克隆 的研究表明,供体细胞选择与克隆有着密切关系:,;。 主要表现在:供体细胞
8、端粒长度决定克隆细胞的 端粒长度。 端粒位于线性染色体或染色质的末端,具 有保证线性?N完整复制、维持染色体结构稳定和 防止端粒?N降解的作用,同时与染色体定位及细 胞衰老密切相关=0。Ahi-6B等C发现克隆绵羊的端粒 长度比年龄相当的对照组短,而与其核供体细胞的端 粒长度相当,说明核供体细胞的端粒长度决定了其核 移植后代的端粒长度。供体细胞与克隆效率有关。 从目前动物克隆的结果分析,供体细胞的分化程度对 克隆效率影响较大,总体来看,核供体细胞的分化程 度越低,克隆效率越高,即DACBE胚胎成纤维细胞E 卵丘细胞E成纤维细胞=。 因此选择分化程度低的 细胞作为核供体,将有助于提高治疗性克隆效
9、率。 众所周知,端粒酶活性表达是维持端粒长度的基 础。 而在正常个体的胚胎发育过程中,DACB表达高 水平的端粒酶活性,随着细胞的不断分化,端粒酶活 性下降,分化成熟细胞不表达端粒酶活性=2。 因此端 粒酶活性表达也是细胞分化程度的一种标志。目前研 究表明正常个体中,仅有性腺组织和部分干细胞表达 端粒酶。 如果利用具有端粒酶活性的细胞作为核供 体,不仅有利于提高克隆的效率,同时也能保持较为 完整的端粒长度,有可能成为核供体细胞的选择标准 之一。 本研究选择了可能用于治疗性克隆的组织皮 肤、肌肉、骨髓组织,以性腺组织和脑组织为参照。 结 果表明,所检测的五种组织端粒酶活性随年龄的增长 均呈下降趋
10、势,但不同组织下降的程度不同,这可能 和不同组织中表达端粒酶活性的未分化或低分化细 胞数量有关,推测可能与不同组织的功能相关。 新生 组皮肤、肌肉和脑组织中均有端粒酶活性表达,以脑 组织和肌肉组织活性较高,而皮肤组织端粒酶活性较 低。随着年龄的增长,皮肤、肌肉和脑组织端粒酶活性 明显下降,一月龄以后,这三种组织基本不表达端粒 酶活性。从而证实了分化成熟的组织不表达端粒酶活 性, 同时也部分反映了不同组织发育时间上的不同 步。而骨髓组织和睾丸组织在检测的各时间点均持续 表达较高端粒酶活性,随年龄略有下降,但各组间差 别不明显。睾丸组织持续表达端粒酶活性与生殖功能 有关,而对于骨髓组织中端粒酶活性
11、持续表达的意义 目前尚不清楚。 目前研究发现骨髓内存在干细胞群, 主要有造血干细胞和骨髓间充质干细胞等,这些细胞 均表达不同程度的端粒酶活性,与组织更新和修复功 能有关。因此骨髓组织持续表达端粒酶活性可能源于 这些干细胞群,参与组织更新和修复。不仅如此,如果 利用这种具有端粒酶活性的干细胞作为核供体细胞, 将可能提高克隆效率,同时保持完整端粒长度,最大 程度保留细胞增殖能力。 本研究结果不仅证实分化成熟的组织不具有端 粒酶活性,同时也证实了骨髓组织中含有能终身保持 端粒酶活性的细胞群。这种细胞可能是一种较好的用 于治疗性克隆的核供体细胞。 由于9C中所用的核供 体细胞为单细胞,因此需要进一步对
12、这些表达端粒酶 活性细胞进行纯化培养和鉴别。 参考文献 =7777FGnHG7IJ47CiK-66i7JL47M-BN O?8 P.1Gn Nh-/GQ-.NiR R60ninSTJU8 NGN O-24 =;4 5V ;W5X;WW8 2 O01KG-/NB J8 9h-/GQ-.NiR R60ninS in Nh- 10.B-TJU8 J/0R NGN RG2 ARi YA4 200C4 =00V =;24X=;258 C Ahi-6B JZ4 in2 J4 CG1QK-66 P4 -N G68 nG6BiB 0 N-601-/- 6-nSNhB in R60n-2 Bh-QTJU8 NG
13、N./-4 =;4 C;V C=6XC=W8 4 Ahi-6B JZ4 in2 J4 CG1QK-66 P4 -N G68 nG6BiB 0 N-601-/- 6-nSNh in ?066V G Bh-Q 2-/i-27K7n.R6-G/7N/GnB-/TJU87C60ninS47=;47=V7 =;X2258 7757777i17NM47JiGNBH-_7O47J/0B-7I47-N7G687AQ-RiiR7GBB0RiGNi0n707 h.1Gn7N-601-/GB-7GRNiiN7iNh7i110/NG67R-667Gn27RGnR-/TJU87ARi-nR-47 =;447266V72
14、0=X20=58 7767777a0.BB-7N47JG/G2iB7547b-/6i0N7A47-N7G687cn7BiN.72-N-RNi0n707N-601-/GB-7 -nH1GNiR7GRNiiN7in7h.1Gn7h-QGN0R-66.6G/7RG/Rin0S-n-BiB TJU8 7 J7 JGNh0647200=47=;4V745;X4658 77W7777Z/GnS-/7OJ47M/iShN7MD47AhG7JM879-601-/GB-7in7RGnR-/7Gn27GSinS TJU87C/iN7I-7dnR067P-1GN06472002474=V72;X408 77:777
15、79/0.nB0n74 7J-/G7O8 7J0N-nNiG67K-n-iNB707R-667R60ninS70/7h.1Gn7 1-2iRin-TJU87I-Q/027b-/Ni67?-47=;:47=0V7=2=X=258 77;7777FGnHG7IJ4 7CiK-66i7JL4 7M-BN7O?8 7J/0BQ-RNB70/7Nh-7.B-707n.R6-G/7 N/GnB-/7in7h.1Gn7N/GnBQ6GnNGNi0nTJU87NGN7Li0N-Rhn0647=;47=WV7 =W=X=W48 =07777?GhB-7I47bi-26-/47D/nBN7Z879-601-/-B
16、7Gn27N-601-/GB-V7Ki060SiRG67 Gn27R6iniRG67i1Q0/NGnR-TJU87C6iniRG67Ch-1iBN/47=;W474CV7W0:XW=8 =7777FGnHG7IJ47CiK-66i7JL47L6GR_-667C47-N7G687DeN-nBi0n707R-6676i-XBQGn7 Gn27N-601-/-76-nSNh7in7Gni1G6B7R60n-27/017B-n-BR-nN7B01GNiR7R-66B TJU87ARi-nR-472000472:V7665X66;8 =27777.hh06H-/XCGK0N7L47L/-17Z87Sin
17、S707Gni1G6B7Q/02.R-27K7B01GNiR7 R-667n.R6-G/7N/GnB-/TJU87DeQ7Z-/0nN0647200247CWV7=C=WX=C2C8 =C7777PG/6-7CL4 7b.NRh-/7L4 7Z/-i2-/7CM8 79-601-/-B7Bh0/N-n72./inS7 GSinS707h.1Gn7iK/0K6GBNBTJU87NGN./-47=;047C45V745:8 =47777Ahi-6B7JZ47JG/2in-7Z87?06647n0760nS-/7Nh-7-eR-QNi0nV7N-601-/-B7Gn27 i1Q6iRGNi0nB70/7N/GnBQ6GnNGNi0nTJU87C60ninS7AN-17C-66B47200C475V7 =5WX=608 77777777 77777777 562 C MY K