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1、基础磷究 不同浓度的I L l 多和T G F _ l 对大鼠肋软骨细胞的影响 王丽，土正辉，杨壮群，李丽霞，屠军波，李国光 ( 西安交透天擎嚣腔蓬院口腔镊露整影羚耪陕西菠安7 l 0 4 ) 论著 【摘要】蠢酶：磺究人鸯霉孵恕余素一l 彝l 卜l 参) 争转纯生长瓣子一，臻弘彝，肄糖穸 培养的S D 欠鼠勋款案衄戆磅能的影响。 方法：采用免疫组织化学检测不同剂量I L 一1O 和T G F D ，作用4 8 h 后软骨细胞攘! 胶原和蛋白多糖表迭水平。采用R T 呻c R 方 法裣溺鲰胞珏登狡源、鑫g g f e I c 氇穰8 s e l ，2 ，童g g f e e a 鑫褥蠡襄瓢的表达
2、器乎。绻果：l L l 参可以捉避软需耋窭胞a g g f e c a 珏8 s 嚣一l ，2 的 表达，从衙降低多聚蛋白聚糖的含量，破环细胞外基质结构，减少I I 型胶原的含薰，使细胞呈现去分化的表现，对软骨细胞越 受槛调节锋瘸。低浓度褥臻F 一参，对软骨细胞起保护磅诈瘸；高浓度的鹘卜参，l e n g 雉1 ) 在促进蛋白多耱表达的霹盼也促进 软骨细胞蛋白多糖的降解，从莉打破软骨的代谢平衡，起负性调节的作用 【关键词】I 卜l 参；蔼F 一参，；较曹细胞 中图分类号】Q 8 1 3 1 文献标识码】A 文瘴编号】1 0 0 8 6 4 5 5 ( 2 0 0 8 ) 0 8 一1 1 6
3、6 一0 5 T h ee 仃e c t so Il L 一1pa n d 。r | G F B lo nr 枷c o s t I c h o n d r a Ic h o n d r o c y t e s w A N GL l ，V 鼢N GZ h e n g h u i ，Y A N GZ h u a n g q u n ，L lL i x i a ，T UJ u n b o ，UG u O g u a n g ( D e p a r t m e n to fO f a la n dM a l I I a f a c l a IP l a 8 t i cS u r g e r y ，S
4、o m a t o l o g i c a lH o s p i t a kX 7 a nJ l a a t o n gU n l V e r s 晦，I a n7 1 0 0 Q 4 t S 1 a a n x i ，C h i n a ) A b s t r a c t ：O b j e c t i v eI no r d e rt 0S t u d yI L 一1 阳n dT G F p 1h a v ew h a te f f e c t 8o nS Dr a tc h o n d r o c y t ec e I I M e t h o n d 抟 D i 黯f e 嫩d o s i
5、 s 蹬l L 一1 阳n d 他F 弗 w a Su S e dt od e a lc h o n d 燃y l ec e n4 8 晒u f s 。T h e n8 9 9 治c 鞠a f l 礤H 钧e nl l 骥 t h O s ec e l l u a r8 n dt h ec O n t f o Ig r o u pw e r ed e t e c t e db y i m m u n e h j S t o c h O m j s t r y R T P C Rm e t h o n d w a su s e dt o a 8 s e s s m e n lc e l l u
6、髫羽g r e c 锄锄d 鞋a g e nI l 翮穗a g g 瓣c a n a s e 一1 ，2m R e X p f e s 8 l n g 。R 船u l t sl L 一多 n e f e 8 s e st h e e X p r e s s i n g0 fa g g r e c a n a s e 一1 ，2a c c o r d i n g I yd e c r e a s et h 0c O n t e n to fa g g r e c a n ，r e d u c et h ec e I I u a rc h a r a c t e ，c 0 I a g e nI I
7、 ， d e s t 霸。箩l 结藉瞧e g f t y 联E C M 。l L 一1 多h 8 、旭rn e g 躐l 、悖蜉f e e I t s ) ne h o n d 和o c y 匏s 。L c 嚼一g f a c I eT G F 一多 h a V ee n e f g e t l ce f 酶c 挺o n c h o n d r O c y t e s ，a l t u si m p r a V et h ec o n t e n to fa g g r e C a na I s Od e g r a t i o nt h ea g g r e c a n ，f i n a I
8、 | yb r e a k d d w nt h eb a I a n c eo f 童C 鞠，h 鑫v e 艚g 融 褥鹾e c t s 溯c h 蠢f 舛e s 。 K e yw o r d s ：I L 一1 p ：T G F p 1 ：c h o n d r D c y c e s 在整形外科领域，软骨组织的缺损修复以及重建一直是 个难题。缝织工程撅念豹撵密为整形乡 科镶域提供了一种掰 的策略。将体外扩增的软骨细胞接种至合适的支架材料上进行 培养，戬获得组织工程软费。然箍，体乡附增静软骨缀稳存在着 去分化的现象，机制不明。细胞因子在影响细胞分化方面起着 耋要的作用，其中I L l ，搿
9、一叠。静律糟研究较多，毽怒各令学 糟看法不一。本文采用免疫组织化学染色，R T P C R 等方法探讨 i L l 圣_ 鞫搿一。对软骨细胞 i 型狡艨，多聚蛋白聚糖酶一l ， 2 ( a g g r e c 8 f l a s e l ，2 ) 及蛋白多糖( a g g r e c a n ) 表达量的影响。 1 材料和方法 1 1 材料；体重约1 2 0 9 韵雌性S D 大鼠( 由西安交通大学动物 中心提供) 。主要试剂与仪器：离糖D 溉M 培养基、胎牛血清( I n v i t r o g e n 公司) ；胰撩自酶6 i 鲫a 公司) 、透明质酸酶、I I 型 胶原酶、阿尔耨蕊8 G
10、 x ( s i 锄公司) ；小甄抗大鼠l l 型胶原单党 隆抗体悄e o m a r k e r 公司) ；羊抗大鼠a g g r e c a n 单兜隆抗体 ( s a n t 8C r u z 公司) ；D 躺免疫筑织仡学试裁盒( j | ：寨串杉公司) ；R N A 提取试剂盒( 上海飞捷公司) ；R e v e r t a i dF i r s ts t r a n d C 隧s y n t b e s i ci ( i t 翁糙1 ) ；歪霍、饲餮褶差显徽镜及驻徽摄彰 系统甜ik o n ) ；= 氧化碳培养箱等。 l 。2 实验方法 1 2 1S D 大鼠肋软骨细胞的分离培养“】
11、：s D 大鼠颈椎脱臼法处 死，浸泡予7 0 9 6 韵酒精中消毒1 5 m i n 。秃蔼操千# 台中取箕膀软骨 组织，剥离软骨膜，之后放入l o l n l 的螺口瓶中用眼科剪剪受 l m m 3 左右的组绞决。采用三步浚清化，获得软静细胞，3 7 ，巷9 I C 0 2 恒温培养箱中进行蝽养。传代培养采用氇2 鳓胰擞自酶翔 O 0 2 9 6 的E D T A ( 比例为l ：1 ) 迸行消纯，2 5 锄2 培养瓶接种密度为 1 0 5 m l 。采用S P 法进行蛋白多糖和I I 型胶原免疫组织化学染 色，确认为软骨细胞。本实验所采用的楚2 代肋软骨细胞。 l 。2 2 不同浓度的I
12、L l 和T G F 一t 作用予软骨细胞：I 卜l 基金项目：2 0 0 5 年国家自然科学基金资助项目( 3 0 5 7 2 0 5 2 ) ，2 0 0 7 年陕西省嘲际合作项目( 2 0 0 7 麟_ 0 7 ) 遴链作者# 耪轻群，勇，教授；研究方痛：壅l 缓移檀，嚣富再造；吨B i i ：y z h q u n 钿a i i 鬟j t u 。e 氐 万方数据 爵和T G F B 。分为以下浓度：1 n g m 1 ，1 0 n g m 1 ，1 0 0 n g m l 。具 豁实验步骤鳃下：班5 1 0 4 懿密度接秘予2 4 强培养援孛，每 孔加入1 5 m l 含有不同浓度I
13、L lB 、T G 卜母。的培养液。每一浓 度3 魏，劈浚3 魏瓣照。数l l 密度接耪予6 孑L 叛串，每琵翔 入2 m 1 含有不同浓度I L 一1B 、T G F _ p ，的培养液。 1 2 。3 免疫缝纯勰：采雳篼密维化二步法试荆盒。敬2 代8 溅融 合软骨细胞玻片，P B S 洗涤，4 多聚甲醮固定3 0 l i n ，P B S 洗涤 3 3 哦n ：8 舔、9 溅强1 0 蕊乙醇聪求，霜孛往糖勰将盖玻片无纲 胞面贴在载玻片，风千。0 3 9 6 H 如：室温2 0 m i n ，P B S 洗涤3 3 璐童n ；栩入一抗( 稀释发l ：2 0 ，垂冰箱过夜，秘S 洗涤3 3 m
14、 i n ；加入二抗为生物素化I g G ( 1 ：4 0 0 ) ，3 7 3 0 m in P B s 洗 涤3 3 嫩n ；熬器驻色，常烧封背。 1 2 4R T P c R 检测c o l l a g e nI I ，a g g r e c a n a s e l ，2 及 a g g r e c a n 酌表达情流：爝缅飚翻乃巅下缀稔，按鞠矗撬欷试裁 盒说明掇取总R N 舭R T P c R 方法检测不同浓度的I L - lB 、 稻F 一昼l 铬焉后熊软骨缫胞酌e o l l a g e nl I ，8 9 9 r e e 8 n 8 s e l ，2 及a g g r e c a
15、 n 的m R N A 表达水平，同时用B - a c t i n 作为内参对 照( 表1 ) 。 逆转录为c D N A 的总体积为2 0 p 1 。取3 斗1 的c D N A 进行 P 源，其总体积为2 5 弘l 隧。P c R 产物经1 骗静琼脂糖凝胶电泳， 紫外灯下观察结果。凝胶扫描分析目的基因灰度值，以 a c t i n 为参照，计算栩对值。相对值= 目的基因强 度9 _ a c t i n 基因强度。+ 1 2 I5 统计学分析：所裔结果均采用i s 表示，用o n e W a y 觚o v a 分析比较组间差异，用统计软件包进行统计分析，以 敞o 0 5 表示有统计学麓异。
16、2 结果 2 1 形态学理察：倒置显微镜下残察，髋软嚣爨代细魏2 赣贴 鹫，并有少量的细胞开始伸展，完全伸展的细胞警现不规则的多 受形，薪毙性强，约5 7 天霹镳满培养瓶遴暂传健。馋代缨戆约 6 h 就可贴壁且裔细胞伸展的现象，约3 4 天就可进行传代。 2 2 免疫维织纯学染色黢察：不嗣浓度| 卜i 多撂用居憋软骨缨 胞的蛋白多糖和胶原的袭达量不间。随着I L lB 浓度的增高， 鑫g g r e e 黼、e o l l a g e f | | 瓣含量明显减少( 圈l 、笏。低浓度懿 T G F p 。作用后的软骨细胞的鬣白多糖含量变化不大，高浓度 斡豫卜，俸矮矮翡蛋爨多糖禽量薅予对照鳃。搿一参，器髑 聪的细胞c o l l a g e nI I 的含量较对照组均有不同程度的降低， l 纨g 玺l 蔼卜蚤，缝降低豹最魏甓显( 蚕3 、4 ) 。 2 3R T P c R 结果：随着I 卜lp 浓度的增加，a g g r e c a n ， e o ll a g 馘lI 静含量鹾链降低，其结巢兵存统计学意义 0 0 5 ) ，1 0 0 n g m l 组比对照缎的含量略高，有 统计学意义 万方数据