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1、中国应用生理学杂志、 2 0 0 6 ; 2 2 ( 2 )1 6 7 THE PRO- ANGI OGENES I S EF F ECT OF PI TAVAS TATI N I N THE Kl o t h o GENE- KNOCKOUT MI CE Z H A N G Y u e - l a n , T I A N We n , Z H A N G Z i - x i n , Z E N G D i n g - y i n , QI G u o - x i a n D e p a r t m e n t o f C i r c u l a t o r y Me d i c i n e
2、, F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l , C h i n a Me d i c a l U n i v e r s i t y , S h e n y a n g 1 1 0 0 0 1 ， C h i n a ) ABS TRACT A i m: T o d i s c u s s t h e e f f e c t o f P i t a v a s t a t i n o n a n g i o g e n e s i s i n v i v o a n d i t s m e c h a n i s m i n K l o t
3、h o h e t e r o z y g o u s d e f i c i e n t m i c e Me t h o d s : T h e h e t e r o z y g o u s d e f i c i e n t K lo t h o m i c e ( k l +/ 一) a n d w i l d m i c e ( k l +/ +) f r o m t h e s a m e l i t t e r w e r e u s e d t o e s t a b l i s h t h e a n i m a l m o d e l o f h i n d - l i
4、m b i s c h e m i a a n d g r o u p e d i n t o c o n t r o l a n d P i t a v a s t a t i n g r o u p , r e s p e c t i v e l y . H i n d - l i m b b l o o d f l o w w a s e v a l u a t e d u s i n g L a s e r D o p p l e r p e r f u s i o n i m a g e r ( L D P I ) b e f o r e t r e a t m e n t a n
5、d a f t e r o p e r a t i o n o f h i n d - l i m b s . T h e c a p i l l a r i e s i n m u s c l e o f l im b s w e r e c o u n t e d b y m e a n s o f C D - 3 1 l a b e l e d i m m u n o - f l u o r e s c e n c e . T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f A k t ( P r o t e i n k i n a s e B ) i n c
6、 e l l s w a s m e a s u r e d b y d i r e c t i m m u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e . T h e e x p r e s s i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r s ( V E G F s ) i n m u s c l e o f l i m b s w a s a s - s e s s e d u s i n g We s t e r n b l o t t
7、i n g . R e s u l t s : A f t e r t r e a t me n t o f P i t a v a s t a t i n , t h e b l o o d fl o w i n i s c h e m i c l i mb s o f t h e K l +/ 一a n d w i l d m i c e i m p r o v e d o b v i o u s l y , t h e r a t i o o f b l o o d f l o w a r e a i n i s c h e m i c l i m b t o t h a t i n n
8、 o n - i s c h e mi c l i m b i n c r e a s e d a n d t h e d e n s i t y o f c a p i l - l a r i e s i n c r e a s e d i n i s c h e m i c l i m b s o f t h e K l +/ 一a n d w i l d m i c e . P i t a v a s t a t i n e n h a n c e d t h e p h o s p h o r y l a t io n o f A k t a n d t h e e x p r e s
9、 s i o n o f V E G F i n is c h e m i c l i m b s o f t h e K l +/ 一a n d w i l d m i c e . C o n c l u s i o n : P i t a v a s t a t i n h a s t h e p r o-a n g i o g e n e s i s e f f e c t i n v i v o a n d t h e V E G F - p - A k t - N O p a t h w a y ma y b e i n v o l v e d i n t h e me c h a
10、n i s m o f t h e e f f e c t o f P i t a v a s t a t i n . K E Y WO R D S : p i t a v a s t a t i n ; a n g i o g e n e s i s ; v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) 中药天年饮对衰老大鼠脑单胺类神经递质含量的影响 宋成军， 陈志宏， 张松岩， 高福禄 ( 承德医学院中心实验室， 河北 承德 0 6 7 0 0 0 ) 摘要目的: 观察中药天年饮( T i a
11、 n n i a n y i n , T N Y - t r a d i t i o n a l c h i n e s e m e d ic in e ) 对D 一 半乳糖衰老大鼠脑单胺类神经递质去甲肾上腺 素( N E ) 、 多巴胺( D A ) , 5 - 夯色胺( 5 - H T ) 含量的影响。方法: 选用成年雄性S D大鼠4 0 只， 随机分为4 组， 每组均为 1 0 只: 正常组、 衰老模型组、 T N Y用药组、 阴性对照组。D 一 丰乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型， 采用高效液相色语一电化学法检测 各组大鼠下丘脑、 海马 N E , D A , 5 - H T的
12、含量。结果: D 一 半乳糖衰老大鼠下丘脑、 海马 N E , D A , 5 - H T的含量明显降低( 与正常大鼠 相比P 0 . 0 1 ) : T N Y可明显提高脑单胺类神经递质的含量( 用药组与模型组相比P 0 . 0 5 ) 。结论: T N Y可有效调整中枢神经 递质的合成， 具有良好延缓衰老的作用。 关健词: 天年饮; 衰老; 脑; 单胺类神经递质 K E Y WO R D S : T N Y; a g i n g ; b r a i n ; m o n o a m i r t e n e u r o t r a n s m i t t e r 中图分类号: R 2 8 5
13、. 5文献标识码: A文章编号: 1 0 0 0 - 6 8 3 4 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 6 7 - 0 2 脑内单胺类神经递质是一类调节机体生理活动的重要 物质， 这些物质在组织中的含量是反映神经递质生物合成、 释放、 摄取、 失活等过程的生化指标; 在研究神经元功能状态 或研究药物对神经组织作用的影响时， 亦常用这些生化指 标 。 本研究主要观察中药天年饮( T i a n n i a n y in , T N Y ) 对 D 一 半乳糖衰老大鼠下丘脑、 海马单胺类神经递质去甲肾上腺 素( N E ) 、 多巴胺( D A ) , 5 - 经色胺( 5 - H T
14、) 含量的影响， 探讨天 年饮延缓衰老的作用机制。 1 材料与方法 1 . 1 实验动物的选择及分组 选用成年雄性 S D大鼠4 0 只( 购自河北医科大学实验动 物学部， 体重 1 8 0 - - 2 5 0 g ) ， 随机分为 4 组( n =1 0 ) : 正常组、 衰老模型组、 T N Y用药组、 阴性对照组。其中模型组、 用药 组、 对照组均采用D - 半乳糖连续腹腔注射( 2 0 0 m g “ k g - 1 . d - ， 共4 0 d ) 制作亚急性衰老的大鼠模型: 模型组大鼠于造 模成功后不再作任何处理; 用药组大鼠于造模成功后每天用 T N Y灌胃， 共3 0 d ;
15、对照组大鼠于造模成功后每天灌胃同等 剂量的生理盐水， 时间同用药组大鼠。 1 . 2 中药的制备 T N Y ( 由我院中医系主任贾春华教授提供) 由何首乌、 怀 牛膝、 肉从蓉、 淫羊蕾、 丹参、 获荃等中药组成， 每副含生药 9 0 g ， 按传统方法加水煎成溶液， 每m l 含有效成分相当于生药 1 . 5 g ， 按8 . l g - k g - ( 由 正常成人用量换算为大鼠用量) 每天 灌 胃一次。 1 6 8 1 . 3 单胺类神经递质含f的测定 1 . 3 . 1 样品的制备实验动物断头处死， 迅速取出全脑后 置于冰盘上， 分离出左侧海马， 将分离出的海马及其余脑组 织迅速投人
16、液氮中冷冻， 然后移人一 8 0 冰箱保存待测。 检测时取出海马， 称重后置于5 0 0 川甲醇中冰浴下用内 切式匀浆器以1 . 5 x 1 0 4 r / m i n 匀浆 3 0、 ， 然后在 4 条件下 1 2 0 0 0 r / m i n 离心4 O m in ， 取上清液2 0 t t l 进样。 检测时取出脑组织， 用直径2 . 5 m m的套管刀在冰冻大 鼠脑腹侧视交叉后方打孔取下丘脑， 组织柱长约 5 m m， 迅速 称重( 约3 0 m g ) 后置于4 0 0 川甲醇中冰浴下匀浆， 4 离心， 取 上清液2 0 闪进样。 1 . 3 . 2 含量测定采用高效液相色谱一 电
17、化学法检测单胺 类神经递质的含量: 使用日本岛津公司的S H I M A D Z U - I O A 高效液相色谱仪和L - E C D - 6 A电化学检测器， 流动相为乙酸 钠一 甲醇( 9 6 : 4 ) ， 流速为 1 . 2 m l / m in , D is c o v e r y C 1 8 0 ( 2 5 0 x 4 . 6 ) 5 p m色谱柱。 按下面的公式计算每9 脑组织中单胺类 神经递质的含量: T a b . 2 Mo n o a mi n e n e u r o t r a n s mi t t e r c o n t e n t s i n h y p o t h
18、 a l a m u s o f r a t s ( n g 馆， x士: ， n =1 0 ) , G r o u p N E D A 5 - H T C o n t r o l No r ma l Mo d e l TNY 7 5 8. 21士5 3. 6 9 9 7 8. 3 2士6 9. 7 8 6 8 1 . 3 0士8 0 . 3 2“ 8 8 6 . 3 2 士8 9 . 3 0 # 2 4 5. 3 1士6 6. 1 1士 5 8: : 1 1 士4 9. 7 8“ 1 1 士4 5 . 6 5 u 7 8 4. 3 1 士7 7 . 6 9 8 9 8. 6 4士6 8 .
19、7 0 51 3. 0 9士6 6. 5 2 8 6 6 . 1 8 士5 0 . 9 7 # ，.1J 40，1 内、，八， X样品总量( u l ) 二海马或下丘脑湿重( 9 ) 1 . 4 统计学处理 所有数据均以均数 士标准差( .z1s ) 表示， 使用 S P S S 1 1 . 0 统计分析软件以 t 检验进行统计分析。 2 结果 2 . 1 海马中单胺类神经递质的含f 模型大鼠海马中N E , D A, 5 - H T的含量均明显降低( 与 正常大鼠相比P 0 . 0 1 ) , T N Y可以明显抑制海马 N E , D A , 5 - H T含量的下降( 用药组和模型组相比
20、P 0 . 0 5 ) ( 表 1 ) o T a b . 1 Mo n o a m i n e n e u r o t r a n s m i t t e r c o n t e n t s i n h i p p o c a m p u s o f r a t s ( n g 很， x1: ， n =1 0 ) P 0 . 0 1 v s n o r m a l g r o u p ; # P 0 . 0 5 v s m o d e l g r o u p 状态 2 1 。 研究表明， N E 在记忆保持方面起重要作用， 而改善 记忆与促进 D A释放有关， 5 - H T系统则参与调节情
21、绪、 动机 和食欲等 3 1 。 脑内单胺类神经递质 N E , D A, 5 - H T等由神经细胞合成 后储存于囊泡内， 当动作电位到达神经末梢时， 在C a t 十 的参 与下以胞吐的方式到达突触间隙， 发挥作用后通过酶解或再 摄取被迅速清除。 在正常情况下， 中枢内神经递质的分泌保持在一定水 平， 并且它们相互之间的比例协调， 从而维持功能的稳定; 随 着机体的老化， 会出现学习记忆能力的下降， 同时脑内单胺 类神经递质的代谢亦发生紊乱， 出现 N E , D A , 5 - H T含量的 下降 4 1 ， 提示衰老过程中 脑内 单胺类神经递质的 平衡遭到破 坏， 并与一些老年性疾病如
22、帕金森病、 老年痴呆及脑功能的 减退有关 5 1 中医认为“ 天癸竭， 精少， 肾藏衰， 形体皆极” 是衰老的主 要原因， 所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。天 年饮由刘河间 宣明论方 何首乌丸加味而成， 在填精补髓、 乌发延年的基础上， 加淫羊蕾以强筋骨、 丹参以通心脉、 获荃 以宁心神， 具有补肝肾、 益精血、 健脾养心的功效。本实验显 示T N Y可明显提高衰老大鼠下丘脑、 海马单胺类神经递质 N E , D A , 5 - H T的含量， 提示T N Y可有效调整中枢神经递质 的合成， 恢复下丘脑、 海马内单胺类神经递质的平衡， 改善下 丘脑及海马神经内分泌细胞的功能。因此说明
23、T N Y具有良 好的延缓衰老的作用。 ，一一J，esJ ，.2 rLrL G r o u p ( 一。 enr o l No r ma l Mo d e l TNY 5 - HT 3 2 9. 3 4士4 3. 2 1 4 9 7. 3 5士6 7. 7 9 3 2 9 . 3 4士4 3 . 2 1 “ 4 5 4 . 3 2 士 4 0 . 7 8 # 4 5. 3 4士1 7. 8 8 6 3. 4 5士1 5 . 3 4 3 4. 3 8士3. 2 1 6 4 . 3 5 士 2 0 . 0 4 0 1 7 4. 2 1士3 0. 6 1 2 3 4. 1 1士4 5. 2 1 1
24、2 4 . 3 1 士2 4. 3 5“ 2 3 7 . 1 1 士 4 8 . 3 0 # 4 参考文献 。 P 0 . 0 1 v s n o r m a l g r o u p ; # P 0 . 0 5 v s m o d e l g r o u p 2 . 2 下丘脑中单胺类神经递质的含量 模型大鼠下丘脑中 N E , D A, 5 - H T的含量明显降低( 与 正常大鼠相比 P0 . 0 1 ) , T N Y可以明显抑制下丘脑 N E , D A , 5 - H T含量的下降( 用药组和模型组相比 P0 . 0 5 ， 表 2 ) 。 3 3 讨论 学习记忆是大脑的重要功能之一
25、， 其过程中伴随着复杂 的神经生理和生化机制。学习记忆的作用机制不仅与中枢 胆碱能神经系统密切相关， 并且与单胺类神经递质 N E , D A , 5 - H T及神经肤密切相关， 它们之间相互制约处于一种平衡 4 5 A m a r a S G . N e u r o t r a n s m it t e r t r a n s p o r t e r s r e c e n t p r o g r e s s J . An n u R e v Ne u r o s c i ，1 9 9 3 , 1 6 : 7 3 - 9 3 . B i r t h e l m e r A, S t e m
26、 m e l i n J , J a c k i s c h R, e t a l . P r e s y n a p t i c m o d u - l a t i o n o f a c e t y l c h o l i n e , n o r a d r e n a l i n e , a n d s e r o t o n i n r e l e a s e i n t h e h i p p o c a m p u s o f a g e d r a t s w i t h v a r io u s l e v e l s o f m e m o r y i m p a i r -
27、 m e n t s J . B r a i n R e s B u l l ， 2 0 0 3 , 6 0 ( 3 ) : 2 8 3 - 2 9 6 . N o w a k o w s k a E , C h o d e r a A, K u s K, e t a l . R e v e r s a l o f s t r e s s - i n - d u c e d m e m o r y c h a n g e s b y m o c l o b e m i d e : t h e r o l e o f n e u r o t r a n s - m i t t e r s J .
28、 P o l J P h a r m a c o l ， 2 0 0 1 ， 5 3 ( 3 ) : 2 2 7 - 2 3 3 . D e l a F u e n t e M, H e m a n z A, Me d i n a S , e t a l . C h a r a c t e r i z a t i o n o f m o n o a m i n e s y s t e m s i n b r a i n r e g i o n s o f p r e m a t u r e l y a g e i n g m i c e 1 . N e u r o c h e m I h t
29、， 2 0 0 3 , 4 3 ( 2 ) : 1 6 5 - 1 7 2 . R e h m a n H U, Ma s s o n E A . N e u r o e n d o c r i n o lo g y o f a g e in g j . A g e A g e i n g , 2 0 0 1 ， 3 0 ( 4 ) : 2 7 9 - 2 8 7 . 基金项目: 河北省科技厅资助项目 ( 0 3 5 4 7 0 0 3 D ) 收稿日期: 2 0 0 4 - 0 8 - 3 0 ; 修回日期: 2 0 0 5 - 1 0 - 1 3 作者简介: 宋成军( 1 9 7 2 - ) ， 男， 讲师， 主要从事神经解剖学方 面的研究。 通讯作者