兔在体心脏缺血再灌注模型的制作方法的改进.pdf

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1、2 0 1 0 年2 月 中国比较医学杂志F e b r u a r y 2 0 1 0 第2 0 卷第2 期 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E V 0 1 2 0N o 2 兔在体心脏缺血再灌注模型的制作方法的改进 薛枫，杨向军，李勋，韩莲花，王海鹏，郑冬冬 ( 苏州大学附属第一医院，苏州2 1 5 0 0 6 ) 【摘要】 目的建立兔在体心脏缺血再灌注模型的新方法。方法4 0 只新西兰大白兔随机分为缺血再灌注 组( 2 5 只) ，假手术组( 1 5 只) 。缺血再灌注组采用“二线二结”法结扎

2、心脏左前降支3 0r a i n ，然后恢复心肌灌注3 h ；假手术组仅将线从左前降支周围心肌中穿过，但并不结扎。实验中连续描记心电图。两组分别于结扎( 穿线) 前 和再灌注( 穿线) 后Ih 从股静脉取血lm L 测定血清肌钙蛋白。实验结束时取心肌行2 ，3 ，5 氯化三苯基四氮唑和 苏木精一伊红染色。结果缺血再灌注组心电图存在s T - T 的动态演变，再灌注1h 后血清肌钙蛋白浓度明显高于 术前( 0 4 74 - 0 3 5V S 0 3 34 - 0 3 1 ，P = 0 0 0 2 ) 。两种染色方法均证明存在心肌坏死。结论“二线二结”法能够 既方便又成功地建立兔在体心脏缺血再灌注

3、模型。 【关键词】兔；模型，动物；在体心脏；缺血再灌注 【中图分类号】R 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 - 7 8 5 6 ( 2 0 1 0 ) 0 2 - 0 0 5 1 - 0 3 AN e wM e t h o dt oE s t a b l i s haR a b b i tM o d e lo f H e a r tI s c h e m i a - R e p e r f u s i o ni nV i v o X U EF e n g ，Y A N GX i a n g - j u n ，L IX u n ，H A NL i a n - h u a ，W A

4、 N GH a i p e n g ，Z H E N GD o n g d o n g ( T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fS o o c h o wU n i v e r s i t y ，S u z h o u2 1 5 0 0 6 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T h i ss t u d yi n t e n d e dt oe x p l o r ean e wm e t h o dt oe s t a b l i s ham o d e lo f

5、h e a r ti s c h e m i a r e p e r f u s i o ni nr a b b i t s i nv i v o M e t h o d s F o n yN e wZ e a l a n dw h i t er a b b i t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot w og r o u p s ： i s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p ( n = 2 5 ) a n ds h a mo p e r a t i o ng r o u p ( 玮= 1

6、 5 ) T h em y o c a r d i a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o nw e r e g e n e r a t e db yt w os u t u r e sa n dt w ok n o t s ，n a m e l yl i g a t i n gt h ep r o x i m a l1 3s e g m e n to ft h el e f ta n t e r i o rd i s c e n d i n ga r t e r y ( L A D ) f o r3 0m i n u t e sf o l l o w

7、 e db yo p e n i n gt h eb l o o df l o wf o r3h o u r s T h eL A Do fr a b b i t si nt h es h a mo p e r a t i o ng r o u pw a s e x p o s e db u tn o tl i g a t e d E l e c t r o c a r d i o g r a p h y ( E C G ) w a sp e r f o r m e dd u r i n gt h ee x p e r i m e n t B l o o ds a m p l ew a sd

8、r a w nf r o m t h ef e m o r a lv e i nt oe v a l u a t ec a r d i a ct r o p o n i nI ( c T n I ) v a l u e sb e f o r eo p e r a t i o na n da f t e rr e p e r f u s i o ni nt h ei s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o f i p A tt h ee n do ft h et e s tm y o c a r d i a lt i s s u e sw e r et

9、a k e na n ds t o i n e dw i t h2 ，3 ，5 - t r i p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ( T T C ) a n dH E ，r e s p e c t i v e l y R e s u l t sT h e r ew e r ee l e c t r o c a r d i o g r a p h i cS T Tc h a n g ei nt h er a b b i t so fi s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p T h

10、 ec a r d i a cu o p o n i nIv a l u e si nr e p e r f u s i o ns t a g ew e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ep r e o p r a t i v ev a l u e s ( 0 4 7 0 3 5V S 0 3 3 0 3 1 ，P = 0 0 0 2 ) b o t ht h et w os t a i n i n gm e t h o d sc o n f i r m e dt h a tt h e r ew e r em y o c a

11、r d i a ln e c r o s i s i nt h i sg r o u p C o n c l u s i o n sT h en e wm e t h o do ft w os u t u r e sa n dt w ok n o t sa 8d e s c r i b e di nt h i ss t u d yc a nc o n v e n i e n t l ya n d s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s ha r a b b i tm o d e lo fh e a r ti s c h e m i a - r e p e

12、r f u s i o ni nv i v o ，a n dp r o v i d eau s e f u lt o o lf o rr e l a t e de x p e r i m e n t a l r e s e a r c h e s 【K e yw o r d s 】 R a b b i t s ；M o d e l s ；E s t a b l i s h m e n t ：H e a r t ；I s c h e m i a r e p e r f u s i o n 【作者简介】薛枫( 1 9 7 2 一) 。女。主治医师在读博士研究生，主要从事心血管疾病的诊治。 【通讯作

13、者】杨向军，E m a i l ：s z l o n g m a n 1 2 6 C O m 。 万方数据 5 2 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d ，F e b r u a T y2 0 1 0 ，V o i 2 0 N o 2 当急性心肌梗死发生后，早期成功地运用溶栓 治疗、经皮冠状动脉成形术( P C I ) 或急诊冠状动脉 搭桥术( C A B G ) 可以使心肌得到再灌注，从而减少 坏死的心肌面积，改善临床预后。但是研究发现再 灌注会加剧心肌细胞的损伤，导致心肌梗死面积增 大，再灌注心律失常和无复流现象的发生，从而

14、减少了以上治疗所获得的好处。因此如何能减少 再灌注损伤的发生已成为目前研究的热点，而建立 心脏缺血再灌注的动物模型为研究提供了平台。 迄今为止国内外学者已先后以大鼠、兔、犬和猪制 作了该模型旧。5 】，其中大多数为采用心脏灌流装置 的体外模型，少部分为制作繁琐的心脏在体模型。 本文介绍一种简便的兔在体心脏缺血再灌注模型 的制作方法。 1 材料和方法 1 1 实验动物 新西兰大白兔4 0 只，雌雄不拘，体重1 8 3 2 k g ，由苏州大学实验动物中心提供 合格证号： S Y X K ( 苏) 2 0 0 7 - 0 0 3 5 。其中缺血再灌注组2 5 只， 假手术组1 5 只。本研究遵循国

15、家实验动物管理条 例及国家实验动物管理实施细则。 1 2 实验耗材 R M 6 2 4 0 B O 型多道生理信号采集处理系统( 成 都仪器厂) 。E C G - 6 5 1 1 型心电图仪( 上海光电医用 电子仪器有限公司) 。E p p e n d o r f - 5 4 1 7 C 型高速离 心机( 德国艾本德公司) 。华利达H Z 一8 8 1 2 S 型水浴 摇床( 太仓科教器材厂) 。T h e r m oS c i e n t i f i cR e v c o 超低温冰箱( 美国赛默飞世尔科技公司) 。P H 计 ( 德国赛多利斯公司) 。手术剪3 把，血管钳4 把， 持针器l

16、把，5 1 2 圆针1 枚，8 2 0 三角针1 枚，0 号及4 号缝线，弯头镊1 把，刀片1 把，7 号注射器 针头4 个。2 ，3 ，5 - 氯化三苯基四氮唑( T I C ，B i o B a s i cI n c ) 。3 戊巴比妥钠溶液。生理盐水。磷 酸盐缓冲液( 2 5m g 磷酸氢二钠和0 5m g 磷酸二氢 钠溶于2L 三蒸水中，调节p H8 5 8 6 ) 。羊抗兔 心脏肌钙蛋白检测试剂盒( A D L 公司) 。 1 3 模型制作过程 取兔称重后用木制兔盒将其固定，经耳缘静脉 缓慢注射3 戊巴比妥钠溶液( 1m L k g ) ，待四肢松 软、睫毛反射消失后停止注射，将其仰

17、卧固定于手 术台。胸部备皮后予皮肤消毒剂安尔碘消毒，沿胸 部前正中线做纵形切口逐层剖开暴露胸骨及胸 廓。于第2 肋间用剪刀剪断胸骨，并同时将胸骨与 第2 4 肋双侧连接处剪断，除去胸骨后用缝线向两 侧牵拉胸廓以扩大手术视野，用眼科小剪刀剪开纵 膈胸膜和心包膜暴露心脏。以肺动脉圆锥与左心 耳交界处的左冠状静脉主干为标志，于左心耳下方 2m m 处进针缝线穿过心肌，深度为2m m ，宽度为4 5m m ，与左冠状静脉平行放置一根缝线于心脏表 面。予肝素钠溶液( 5 0 0U k g ) 静脉推注后，将穿过 心肌的缝线交叉打一单结并拉紧两端( 假手术组仅 穿线不结扎) ，由助手将结下放置的与左冠状静

18、脉 平行的另一根缝线交叉打一活结，通过两个结成功 结扎左前降支。其标志为心电图I I 导s T 段明显抬 高，结扎局部心肌由红色转为暗灰色。3 0m i n 后解 开活结，通过牵拉该缝线解开结扎左前降支的死 结，从而恢复该血管的灌注。 1 4 心电图 将7 号注射器针头扎入兔四肢皮下作为电极， 将多道生理信号采集处理系统和心电图仪的电极 线与其连接，记录I I 导心电图。 1 5 心肌染色 再灌注3h 后取出心脏，洗净血迹，去除心房和 右心室。于一8 0 冷冻0 5h 后沿左室长轴将左室 横切为厚约2m m 的薄片，将其置于3 0m L1 T T C 溶液( 0 3gT T C 溶于3 0m

19、L 磷酸缓冲液) 中，于 3 7 水浴0 5h 。 1 6 组织形态学观察 心肌再灌注3h 后剪取心脏，于冠脉穿线处下 5m m 处剪取一小块左心室前壁，常规石蜡制片，苏 木精伊红( H E ) 染色，显微镜观察组织形态学变化。 1 7 血清肌钙蛋白测定 缺血再灌注组分别于结扎前和再灌注1h 后穿 刺股静脉取血lm L ，假手术组于穿线前和穿线后1 h 取静脉血1m L 。所有血样均于25 0 0r m i n 离心 1 0m i n 取血清于一8 0 保存。收齐标本后按A D L 公司羊抗兔心脏肌钙蛋白检测试剂盒说明书操作 测定血清肌钙蛋白。 1 7 统计学方法 计量资料用均数标准差( 孟s

20、 ) 表示，用 S P S S l 7 0 统计软件进行成对样本I 检验，以P 0 0 5 为差异有统计学意义。 2结果 2 1 心电图 左前降支结扎后I I 导联S T 段弓背上抬明显， 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d ，F e b r u a r y2 0 1 0 ，V 0 1 2 0 N o 2 5 3 再灌注后S T 段回落至基线( 图1 ) 。 注： 术前B 结扎1 0r a i n 后C 再灌注1h 图1 心电图( I I 导) F i g 1 T h eE C Go far a b b i t ( 1

21、 e a dI I ) A B e f o r e o p e r a t i o n ；B T e nm i n u t e sa f t e rl i g a t i n gt h eL A D ；C O n e h o u ra f t e rr e p e r f u s i o n 2 2 心肌染色 坏死的心肌呈白色，正常心肌染成砖红色( 图 2 ) 。 2 3 组织形态学观察 梗死区心肌丧失正常结构，横纹消失，细胞水 肿，胞核溶解、消失，并可见炎症细胞浸润( 图3 ) ， ( 图2 ，3 见彩插2 ) 。 2 4 血清肌钙蛋白测定 再灌注1h 后左前降支结扎者血清肌钙蛋白浓 度明显

22、高于术前( 0 4 7 士0 3 5V 8 0 3 3 0 3 1 ，P = 0 0 0 2 ) ，而假手术组穿线前后无明显变化( 0 2 6 0 2V S 0 3 0 1 5 ，P = 0 0 8 ) 。 认为该方法存在较高的气胸发生率，易导致兔死 亡。而胸骨正中开胸减少了这种风险。 开胸结扎兔冠状动脉通常选择左前降支，但该 血管被薄层心肌覆盖，肉眼不能明视，且长短不一， 最短者只达心室的上1 3 ，最长者长达心尖7 ) 。故 结扎部位亦高，通常选择左心耳尖下方结扎，且进 针要有一定深度，结扎时以与左前降支伴行的左冠 状静脉为标志。有文章报道结扎左室支造模，该 血管为左旋支分支，沿心脏左缘下

23、行，其特点为表 浅、粗大，供血范围较大，造模成功率较高。但笔者 认为在体模型本身手术视野不大，找寻并结扎左室 支难度较大，且如结扎部位偏高则易致兔死亡，故 仍推荐结扎左前降支。 缺血再灌注模型不同于心梗模型，结扎血管造 成心肌缺血后要迅速恢复血流。目前大多数实验 都是通过将结扎血管的缝线两端共穿一细管形成 闭环，拉紧缝线用止血钳固定导致心肌缺血，松开 钳子则使心肌得到再灌注9 。该方法对细管的要 求较高，太软则不能完全阻断血流，太硬则容易损 伤心肌。也有研究者通过剪断该线来实现再灌注。 但由于结扎血管的缝线深陷心肌内，故不仅不能立 即恢复血流，而且剪线时容易损伤心肌。本研究所 采用的“二线二结

24、”法既简单又有效。结扎血管的 缝线所打单结本身易松动，但由于单结下第二根线 所打活结刚好压在其上方使其其不易松动，从而阻 断血流。当轻松解开该活结后，由于该线恰好位于 单结下方故将其向上方牵拉可以立即解开该单结， 实现心肌再灌注。血清肌钙蛋白测定和心肌染色 证明该方法确实造成了心肌缺血坏死。两结均解 开后出现的心电图改变说明该方法成功实现了心 肌再灌注。“二线二结”法目前未见报道，笔者认为 值得推广。 3讨论 参考文献： 目前在体制作心脏缺血再灌注模型的方法有 开胸结扎冠状动脉和不开胸、应用心导管介入方法 封堵左前降支。本研究采用前一方法制作了兔在 体心肌缺血再灌注模型。与众多以大鼠为对象的

25、研究相比，兔具有以下优点：( 1 ) 作为哺乳动物其心 脏生理特性与人类更为相似；( 2 ) 心脏相对较大 便于操作；( 3 ) 左右胸腔各自具有独立的胸膜，互不 相通。暴露心脏时不需使用呼吸机。多年以来大 多数实验采取左侧第2 、3 、4 肋间切口开胸。但笔者 1 Y e l l o nD M ，H a u s e n l o yD J M y o c a r d i a lr e p e r f u s i o ni n j u r y J 】N E n g lJM e d 。2 0 0 7 ，3 5 7 ：1 1 2 1 1 1 3 5 2 Z h uM ，F e n gJ ，L u c

26、 c h i n e t t iE ，e ta 1 I s c h e m i cp o s t c o n d i t i o n i n g p r o t e c t s r e m o d e l e d m y o c a r d i u m v i at h eP 1 3 K - P K B A K T r e p e f f u s i o ni n j u r ys a l v a g ek i n a s ep a t h w a y J 。C a r d i o v a s cR e s ， 2 0 0 6 ，7 2 ：1 5 2 1 6 2 3 Y a a gX M ，P

27、 r o c t o rJ B ，C u iL ，e ta 1 M u l t i p l e ，b r i e fc o r o n a r y o c c l u s i o n sd u r i n g e a d yr e p e r f u s i o np r o t e c t r a b b i th e a r t sb y t a r g e t i n gc e l ls i g n a l i n gp a t h w a y s J JA mC o i lC a r d i o l 。2 0 0 4 ， 4 4 ：1 1 0 3 1 1 1 0 ( 下转第6 1 页)

28、 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d ，F e b r u a r y2 0 1 0 。V 0 1 2 0 N o 2 6 1 个较大的夹角，受力点集中在一点上，严重影响大 鼠的自由活动，同时固定不良，极易被大鼠破坏；2 ) 只用弹簧简单套住导管无缝线固定，则弹簧极易随 着大鼠活动而移位，导管外露，从而易被大鼠抓坏 或咬坏。这三种情况：设备极易受到大鼠咬坏或用 爪抓坏( 咬断导管或把导管拔出) ；或弹簧接触点受 力不均，影响大鼠活动等，可至实验无法进行下去。 导管穿弹簧侧边入内孔组操作：这种方法( 如 图2 A ) 可

29、使弹簧紧贴体表，导管不外露，导管进入弹 簧接口处使弹簧形成的“一长一短”两端与体表皮 肤缝合固定非常牢固，弹簧导管设备不容易被大鼠 破坏。经过多次实验，设备未曾被大鼠咬坏或抓 坏。由于弹簧紧贴大鼠体表，受力面积大且较均 匀，最大程度减少大鼠对弹簧等设备在体表连接的 不适，所以大鼠自由活动性好。 最后，当留置导管多次采血时，在每次抽完血 后，必须用生理盐水抗凝剂配液冲洗导管，否则就 会出现采血不畅的现象。这是由于每次抽完血后， 导管内必留有血液，若无进行生理盐水抗凝剂配液 冲洗导管，导管内血液极易出现凝固，赌塞导管 通道。 综上所述：本实验提倡的“导管穿弹簧侧边入 内孔组”，操作起来每一步思路及

30、注意事项都非常 清楚，常人很快就会操作，具有成功率高等优点。 但本实验在导管插入心脏前的准备工作所需时间 还有待缩短。 参考文献： 1 杨文敏，曾其毅肾上腺素对内毒素致大鼠炎症性肝损害的 保护作用 J 中国循证儿科杂志2 0 0 7 ，1 2 ( 0 4 ) ：2 7 6 2 8 1 2 王宁。郑江，郭毅斌，等心导管留置术对大鼠脏器功能影 响的实验研究 J 第三军医大学学报，2 0 0 6 ，( 1 4 ) ：1 4 7 3 1 4 7 5 3 B e n oD W ，K i m u r aR E N o n s t r e s s e dr a tm o d e lo fa c u t e

31、e n d o t o x e m i at h a tu n m a s k st h ee n d o t o x i n i n d u c e dT N F a l p h a r e s p o n s e J A mJP h y s i o l ，1 9 9 9 ，2 7 6 ( 2P t 2 ) ：H 6 7 1 一H 6 7 8 4 徐叔云药理学实验方法 M 北京：人民卫生出版社 1 9 9 1 ：5 4 6 修回日期 2 0 0 9 - 1 1 - 1 5 ( 上接第5 7 页) 8 C o l e m a nD L ，H u m m e lK P S t u d i e s

32、w i t ht h em u t a t i o n ，d i a b e t e s i nt h em o u “ J D i o b e t o l o g i a ，1 9 6 7 。3 ：2 3 8 2 4 8 【9 C h u n gW K ，C h u aS C ，L e eG H ，e t 止P o l y m e r s s ec h a i n r e a c t i o n - r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ( P C R - R F L P ) a n

33、de l e c t r o p h o r e t i ca s s a y sf o rt h em o u s eo b e s e ( L e p “) m u t a t i o n J O b e sR e s ，1 9 9 7 ，5 ：1 8 3 1 8 5 1 0 H i r a s a w aT ，O h a r aT ，M a k i n oS 1 9 9 7 G e n e t i ct y p i n go ft h e m o u s eo bm u t a t i o nb yP C Ra n dr e s t r i c t i o ne n z y m ea n

34、 a l y s i s J E x pA n i t a ( T o k y o ) 。1 9 9 7 ，4 6 ：7 5 7 8 1 1 胡培丽，范昌发，李吉占，等单管双向等位基因专一性扩增 方法在近交系小鼠遗传检测中的应用 J 中国实验动物学 报，2 0 0 6 ，1 4 ( 4 ) ：2 4 6 2 5 0 【修回日期 2 0 0 9 - 1 l - 1 0 万方数据 一。t I _ 。7 ：f - r ，八 。 t 嗨 。 j 够 嗨 o 。j 够 带j ， 辅 。I 舷f 薛枫，等免在体心脏缺血再灌注模型的制作方法的改进 f 正女见第5 l 页 X U E 艮n g ，c ta l

35、A N e wM e t h o dt oE s t a b l i s haR a b b i tM o d e lo lH e a r tI s c h e m i aR o p e r f u s i o ni nV i v o f F u l l t e x lo np a g e5 ”“0 m n eJ f 口0 m 日n “n N cT h em 1 4 K l l o n l i e u c “响 kT h en o d a lm y 删i u m ”b r i c kM d 目2m “u 1 陀 F i g2 T h eg 哪4 P ”4 eo F m b b i tm y o c a r ( 1 i u m ( T T cs 1 8 m m 阁。鳓 万方数据