乙型肝炎外周血单个核细胞内和血清中HBV DNA的检测.pdf

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1、天津医药2 0 0 5 年7 月第3 3 卷第7 期 4 1 9 乙型肝炎外周血单个核细胞内和 血清中H B V D N A的检测 李秀梅梁树人李顺天戴晨阳 徐健 摘要目的: 探讨不同类型乙型肝炎( 乙肝) 患者外周血单个核细胞( P B M C ) 内和血清中H B V D N A表达量的关 系。 方法: 采用荧光定量聚合酶链反应( F Q - P C R ) 检测7 7 例不同 类型乙 肝患者P B M C 内 和血清中H B V D N A 含量。 结 果: 患者血清中和P B M C内H B V D N A总阳 性率分别为4 8 .0 5 % ( 3 7 / 7 7 ) 和5 7 .

2、1 4 %( 4 4 / 7 7 ) 。其中两者中阴性和阳性检 测结果一致的患者占7 7 . 9 2 %( 6 0 / 7 7 ) ， 检测结果不一致的患者占2 2 . 0 8 % ( 1 7 / 7 7 ) ， 血清中和P B M C内H B V D N A阳性 率差别无统计学意义( X Z = 2 . 1 1 , P 0 .0 5 ) 。肝硬化( L C ) 组患者P B M C内H B V D N A阳 性率高于急性乙型肝炎( A H B ) 和 慢性乙型肝炎( C H B ) 组( P 0 .0 5 ) ， 但抗一 H B e ( + ) 组中 有增高 趋势。 结论: P B M C

3、丙H B V D N A的检测是对血清中H B V D N A检测 的重要补充。另外， H B e A g 阴 性也不能排除体内 有H B V的存在与复制。 关键词肝炎病毒， 乙型 D N A 白细胞， 单核聚合酶链反应 D e t e c t io n o f H B V D N A b e t w e e n P e r ip h e r a l B lo o d M o n o n u c le a r C e l ls a n d S e r u m i n H e p a t it is B P a t ie n t s L I X i u m e i , L I A N G S h

4、 u re n , L I S h u n t i a n , D A I C h e n y a n g , X U J i a n R e s e a r c h I n s t i t u te o f T ia n j i n I n f e c t io u s D is e a s e H o s p it a l , T i a n j i n 3 0 0 1 9 2 , C h i n a A b s t r a c t O b j e c t iv e : T o i n v e s t i g a t e t h e d i ff e r e n c e o f H B V

5、 D N A b e t w e e n i n p e r i 户e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s ( P B M C ) a n d i n s e r u m o f h e p a t i t i s B p a t i e n t s . M e t h o d s : H B V D N A o f P B M C a n d s e r u m i n 7 7 p a t i e n t s w e r e d e t e c t e d b y fl u o r e s c e n t q u a n t i t

6、 a t iv e p o ly m e r a s e c h a i n re a c t i o n ( F Q - P C R ) . R e s u lt s : H B V D N A t o t a l p o s i t i v e r a t e s i n s e r u m a n d P B M C w e r e 4 8 .0 5 % ( 3 7 / 7 7 ) a n d 5 7 . 1 4 % (4 4 / 7 7 ) r e s p e c t i v e l y . T h e r e w a s n o s ig n ifi c a n t d iff e

7、r e n c e b e t w e e n t h e m . B u t H B V D N A p o s i t i v e r a t e s i n P B M C w e r e h ig h e r t h a n t h o s e i n s e r u m . T h e d e t e c t e d r e s u l t s o f 7 7 .9 2 % ( 6 0 / 7 7 ) p a t i e n t s a m o n g t h e m s h o w e d n o d i f f e r e n c e a n d t h e y w e r e

8、i n t e r r e l a t e d 俨 0 .0 5 ) . H B V D N A p o s i t i v e r a t e s i n P B M C o f l i v e r e i r r h o s i s ( L C ) w e r e h i g h e r t h a n a c u t e h e p a t i t i s B ( A H B ) a n d c h r o n ic h e p - a t i t i s B ( C H B ) ( P 0 .0 5 ) , t h e r e w a s i n c re a s i n g t e

9、n d e n c y i n A n t i - H b e ( + ) g r o u p . C o n c lu s io n : T h e d e t e c t i o n o f H B V D N A i n P B M C w a s a n i m p o r t a n t c o m p l e m e n t i n s e r u m . M o r e o v e r H B V s e x i s t e n c e a n d d u p l i c a t io n c o u l d n o t b e e x c l u d e d w h e n H

10、 B e A g n e g a t i v e . K e y w o r d s h e p a t i t i s B v i r u s D N A l e u k o c y t e s , m o n o n u c l e a r p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n 乙型肝炎病毒 ( H B V )感染后可激发机体对 H B V抗原的免疫应答， 这种免疫应答在肝细胞的损 害过程及 H B V的清除中起重要作用。H B V感染外 周血单个核细胞( P B M C ) 会直接影响机体的免疫功 能 P B M C 对H B V抗原

11、的反应与H B V的复制及清 除有关，所以对P B M C内H B V D N A的检测有重要 意义。 本研究采用F Q - P C R对各型乙型肝炎( 乙肝) 患者进行血清中和P B M C内H B V D N A的检测， 并 探讨乙肝患者 P B M C内H B V D N A与H B V血清标 志物的关系， 结果报告如下。 1 资料与方法 1 . 1 临床资料 1 . 1 . 1 研究对象7 7 例乙肝患者为 2 0 0 1 年 1 月一2 0 0 2 年 1 1 月本院住院患者， 男4 9 例， 女2 8 例， 年龄 1 1 一 7 1 岁。急性 乙型肝炎 1 6 例( A H B组)

12、 ， 慢性乙型肝炎4 4例( C H B组) ， 肝 硬化1 7 例( L C 组) 。 诊断符合2 0 0 1) 年全国病毒性肝炎会议诊 断标准。 另选9 例体检健康者作对照组( 男3 例， 女6 例， 年龄 1 66 0 岁) 。 1 . 1 .2 试剂血清标志物检测所用试剂为华美公司产品。 H B V D N A 定量检测所用试剂为广州达安公司产品。 p H 7 .2 淋 巴细胞分层液和0 .0 2 m o l/ L p H 7 .2 P B S 购自 医学科学研究院 - 一 不 落 革石3 0 0 1 9 2 ， 天 津 市 传 染 病 医 院 4 2 0 T i a n j i n

13、M e d J , J u l 2 0 0 5 , V o l 3 3 N o 7 血研所。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 P B M C 分离 取肝素抗凝血4 m l , ， 用等量淋巴细胞分 层液分离P B M C ， 将分离的P B M C 细胞用P B S 1 0 m L 清洗， 反 复4 次， 最后一次清洗后的上清液留取1 0 0 w L ， 进行H B V D N A检测。沉淀细胞溶于 1 0 0 w L P B S中，加人 1 8 ;.L L 4 % N o n i d e t P - 4 0 ( N P - 4 0 ) ， 混匀后放3 7裂解3 0 m i n ， 然后

14、涂片 镜检， 细胞裂解充分置一 7 0 待检。 1 .2 .2 F Q - P C R 检测 P B M C 标本在检测前解冻， 然后进行 1 5 0 0 0 r / m i n 离心1 5 m i n ， 吸取上清液5 0 R L 进行H B V D N A 检测， 依说明书操作。 结果 0 .0 5 ) ， 但抗一 H B e ( + ) 组中有增高趋势， 见表2 0 表2血清中与P B MC内H B V D N A阳性率和H B V 血清标志物的关系例( %) H B V血清标志( + )n H B V D N A ( + ) 血清( + ) % P B M C ( + ) % P B

15、M C ( + ) 而血清( 一 ) 班k 4+ H B e A g + jX- H B c + H B s A g + 抗- H B e + 抗- H B c 十 41 2 8 2 7 ( 6 5 . 8 5 ) 8 ( 2 8 . 5 7 ) 2 ( 2 5 .0 0 ) 2 9 ( 7 0 .7 3 ) 1 2 ( 4 2 . 8 6 ) 3 ( 3 7 . 5 0 ) 2 ( 4 .8 8 ) 4 ( 1 4 . 2 9 ) 1 ( 1 2 . 5 0 ) 2 结果 9 例正常人对照组P B M C和血清中H B V D N A 均为阴性， 排除了P B M C自身D N A的干扰。

16、末次洗 液进行 H B V D N A检测也为阴性，排除了血清中 H B V D N A的干扰。 2 . 1 各型乙肝患者血清中与P B M C内H B V D N A 检出情况 7 7 例乙肝患者血清中与P B M C内H B V D N A总阳性率分别为4 8 .0 5 % ( 3 7 / 7 7 )和5 7 . 1 4 % ( 4 4 / 7 7 ) ，其中两者阴性和阳性检测结果一致的患 者占7 7 .9 2 %( 6 0 / 7 7 ) ，检测结果不一致的患者占 2 2 .0 8 % ( 1 7 / 7 7 ) ， 两者差异无统计学意义( 扩 = 2 . 1 1 , P 0 .0 5

17、) o A H B , C H B和L C组患者P B M C内H B V D N A ( + ) 而血清中H B V D N A ( 一 ) 的分别占 1 2 . 5 0 % ( 2 / 1 6 ) , 1 3 . 6 4 %( 6 / 4 4 ) 和 2 3 . 5 3 %( 4 / 1 7 ) ， 差异虽无 统计学意义( 扩二1 .8 9 , P 0 .0 5 ) ， 但L C 组有增高趋 势。3 组血清中H B V D N A阳性率差异无统计学意 义( X 2 =1 . 0 3 , P 0 . 0 5 ) ; 而L C 组P B M C内H B V D N A 阳性率高于A H B 组

18、( X Z = 3 . 8 8 尹 0 .0 5 ) 和C H B 组 ( X 2 = 5 .3 1 刃 0 .0 5 ) ， 差异有统计学意义， 见表t o 表 1各型乙肝患者血清中与P B MC内H B V D N A检出情况 组别 血清( + )血清( 一 )总( +)% a一一一 P B M C ( + ) P B M C G)P B M C ( + ) P B M C G)血清( + ) P B M C ( + ) 川招 组 1 6 C H B 组 4 4 L C组1 7 6 12 7 4 3 4 3 . 7 5 4 5 .4 5 5 8 . 8 2 2 . 2 血清中与P B M

19、C内H B V D N A阳性率和H B V 血清标志物的关系不同血清标志物组中虽然 P B M C内H B V D N A ( + ) 血清中( 一 ) 的患者之间差 3 讨论 乙肝病毒不仅能侵犯肝脏，许多肝外组织已 陆续发现有H B V D N A的存在。 由于血清H B V D N A 检测对H B V暂不释放入血的肝内、 外感染不易检 出， 因此有一定的局限性。 而肝组织H B V D N A的检 测必须借助于肝穿刺获得标本，限制了其常规应 用。 通过P B M C内H B V D N A的检测能间接反映肝 细胞内H B V D N A的存在情况， 从而对各型乙肝患 者的H B V的复

20、制状态有更准确的评价。 本研究结果表明，各型乙肝患者血清中和 P B M C内H B V D N A的阳 性率有相关性， 两者符合 率达7 7 .9 2 %。并且 L C组P B M C内H B V D N A阳性 率高于A H B和C H B 组， 差异有统计学意义。但也 存在血清内阴性而 P B M C阳性的各型乙肝患者虽 然差异无统计学意义， 但L C 组有增高趋势。 这可能 是这类患者体内病毒复制正处于低谷期，血清中 H B V量很低， 病毒多隐匿于细胞中或宿主免疫应答 异常， 一方面作为潜在的传染源， 引起病毒重复感 染和肝脏病变反复活动， 最终导致慢性或活动性肝 炎;另一方面H B

21、 V长期存在于P B M C内和肝细胞 中， 增加了H B V整合的机会， 这可能是肝硬化甚至 肝癌发生发展的高危因素 o H B V感染P B M C 可能 在乙肝慢性持续及向肝硬化的转化中起重要作用。 另外， 一般认为血清中H B V D N A与H B e A g 是 病毒复制的指标， 前者通常在H B e A g 阴转时消失。 但本研究结果表明2 8 例抗一 H B e ( + ) 患者P B M C内 H B V D N A ( + ) ， 而血清中( 一 ) 患者所占比例有增高趋 势， 这可能是由于H B V发生变异的结果。 提示血清 中H B V D N A ( 一 ) 并不完全

22、意味着病毒的清除与复 制水平降低或消失， 并且P B M C 感染有H B V者存 在血清H B V重新复制及导致肝功能再度受损的危 险z 1 。 国 外报道有慢性乙肝患者肝移植后又出现H B V 重 新复 制， 表明P B M C 中H B V 可 能就 是一个来源3 j 0 因此 ， P B M C内 H B V D N A的检测是对血清 H B V 40 60 泊.且用.上 天津医药 2 0 0 5 年 7 月第 3 3 卷第 7 期4 2 1 D N A检测的重要补充。 参考文献 1 王贯强， 斯崇文. 应重视对隐匿性乙型肝炎的诊断. 中华内科杂 志， 2 0 0 2 , 4 1 (

23、1 0 ) : 6 4 9 - 6 5 0 黄敦武， 武英， 刘碧坚.P C R法检测慢性乙肝患者外周血单个核 细胞中H B V - D N A .西南国防医药， 2 0 0 2 , 1 2 ( 2 ) : 1 1 1 - 1 1 2 王永刚， 王宇明肝移植后乙型肝炎病毒再感染相关因素的研究 进展世界华人消化杂志，, 2 0 0 3 , 1 1 ( 9 ) : 1 4 6 0 - 1 4 6 4 ( 2 0 0 4 - 0 6 - 0 2 收稿2 0 0 5 - 0 3 - 2 1 修回) 短 篇 与 病 例 报 告 原发性甲状腺功能减退症并浸润性突眼二例 张美英 关键词甲状腺功能减退症突眼病

24、例报告 1 病例报告 例 1女， 6 2 岁。因双眼突出伴双眼胀痛、 怕光、 流泪、 乏 力半年， 于2 0 0 2 年5 月来我院就诊。 体检: 双眼突出， 右眼为 甚， 双睑肿胀， 球结膜充血， 甲状腺n 度肿大， 质韧， 无明显结 节， 心率7 2 次/ m i n ， 律齐， 双下肢无明显浮肿。 眼部C T : 双眼 球突出， 右眼明显， 球后无占位病变， 双眼内直肌增粗， 符合 G r a v e s 病( G D ) 眼部改变。查总T , ( TT, ) 0 .4 8 W g / L ( 正常值 0 .61 .8 1 R 岁L ) 、 总毛( TT, ) 2 7 .6 p t,g

25、/ L ( 正常值3 2 - 1 2 6 w g / L ) , 促甲状腺激素( T S H ) 2 7 I U / L ( 正常值0 .3 5 - 5 .5 I U / L ) 。 甲 状腺 球蛋白抗体( T G A b ) 5 1 %( 正常值 3 0 %) 、 甲 状腺微粒体抗体 ( T M A b ) 5 3 %( 正常值 2 0 %) 。促甲 状腺激素受体抗体( T R A b ) 1 7 .8 I U / m L ( 正常值 5 I U / m L ) 。甲状腺细针穿刺以淋巴细胞 为主。 诊断为原发性甲状腺功能减退症( 原发性甲减) 合并浸 润性突眼( G O ) 。 予优甲乐每天

26、5 0 W g I 次口 服， 强的松每天 3 0 m g 分3 次口 服。 1 个月后强的松改为每天巧m g 顿服， 同 时辅以 人工泪液眼部治疗，间断使用双氢克尿塞1 2 .5 m g 每 天2 次治疗。3 个月后眼部自 觉症状消失， 眼球突出减轻， 甲 状腺 I 度肿大， 甲状腺功能正常。 停用强的松， 以优甲乐每天 5 0 R g 维持， 6 个月复查除眼球轻度突出外， 无自 觉症状。甲 状腺功能正常。 例 2 男， 5 6 岁。因双眼突出伴复视、 怕光、 流泪、 双下肢 浮肿及乏力3 个月， 于2 0 0 3 年 3 月就诊。体检: 双眼突出， 上 睑挛缩， 球结膜充血。 甲状腺II

27、 度肿大， 质韧， 无结节。 心率6 6 次/ m i n ， 律齐， 双下肢轻度浮肿。 眼部C T : 双眼突出， 球后无占 位病变， 双眼内、 上直肌 增粗， 符合G D眼部改变。 TT3 1 .5 3 R/ L , T T , 2 6 . 8 W g / L , T S H 3 3 I U / L o T G A b 5 5 %, T M A b 4 8 % , T B A b 7 .8 I U / m L 。 甲 状腺B 超: 甲 状腺呈弥漫性增大， 回 声低、 光点 粗、 分布不均。 诊断为原发性甲减并浸润性突眼。 予优甲 乐每 天5 0 N ,g ， 强的松每天3 0 m g ，

28、分3 次口 服。 1 个月后强的松改 为每天巧m g 顿服， 并辅以人工泪液眼部治疗。3 个月后患 者自 觉症状改善， 眼球突出减轻， 甲状腺未触及肿大， 甲状腺 功能正常。 予强的松每天5 m g ， 优甲 乐每天5 0 W g 维持， 6 个 月复查甲状腺功能正常。 2 讨论 本文2 例均无甲状腺疾病及抗甲状腺药物使用史，两者 从临床表现、 相关检查及治疗效果看均能确定为原发性甲 减 合并浸润性突眼。研究资料显示: G D与G O在发病机制上有 共同之处: ( 1 ) 有相关联的遗传因素和环境因素。 ( 2 ) 有相关联 的自 身免疫反应， 甲 状腺和眼球后组织存在共同抗原， 产生的 交叉

29、免疫反应可导致甲状腺外的组织病变u m。 而原发性甲减合 并浸润性突眼临床上少见报道， 尚未见相关研究资料。 自 身免 疫性甲状腺疾病( A I T D ) 包括: G D , G O 、 产后甲状腺炎和慢性 淋巴细胞性甲状腺炎。 A I T D之间免疫反应的特点密切相关n A I T D的病因公认的是器官特异性自 身免疫性疾病， 具有一定 的遗传倾向。在A I T D患者血清中常同时存在许多抗体如 : T B A b , T G A b , T P O A b等。有资料表明: T B A b具有兴奋型 ( T S A b ) 和抑制型( T S B A b ) 2 类， T S A b占优势

30、时， 可表现为 甲 亢， 以G D多见， T S B A b 占优势时， 可表现为甲减， 以桥本病 多见f31 0 原发性甲 减并浸润性突眼的诊断和治疗目 前尚 无成熟方 案， 笔者认为该病诊断主要依靠甲状腺功能和眼部C T 检查。 一方面了解甲状腺功能状态， 另一方面有助于G O的诊断和 鉴别诊断。该病的治疗， 一方面可补充足量甲状腺激素， 以 纠正甲状腺功能及下丘脑一垂体一甲状腺轴功能的异常; 另 一方面应早期使用免疫抑制剂及非特异性抗炎药物全身治 疗， 以缓解自 身免疫性炎症反应。 同时可以给予眼睛的局部治 疗和护理， 必要时可予眶部放疗和眼眶减压治疗。 参考文献 1 李梅， 邱明才. G r a v e s 病的甲状腺外表现和发病机制. 天津医药， 2 0 0 0 , 2 8 : 1 2 5 - 1 2 7 2 滕卫平. 甲状腺炎. 见: 叶任高， 陆再英主编. 内 科学第6 版. 北京: 人民卫生出版社， 2 0 0 4 .7 3 9 - 7 4 2 3 陈蔚， 张朝云， 叶红英， 等.原发性甲状腺功能减退症并浸润性突 眼二例中华内分泌代谢杂志， 2 0 0 3 , 1 9 ; 1 5 3 ( 2 0 0 4 - 0 7 - 1 8 收稿2 0 0 5 - 0 2 - 2 2 修回) 作者单位 : 3 3 0 0 0 6 南昌， 江西医学院第二附属医院内分泌科