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1、- 2 3 4- 吉林医学2 0 0 6 年3 月第2 7卷第3 期 光动力疗法对S D大鼠C 6 胶质瘤照射后单态氧含量的影响研究 黄海燕， 李蕴博， 别黎， 鲁质成 吉林大学第一医院神经外科， 吉林长春1 3 0 0 2 1 ) 曲要 目 的: 本文研究了光动力 学疗法对大鼠 胶质瘤照射后单态氧( 0 2 ) 含量的 影响。 材料与方法:取5 6只S D大鼠 皮下注射 C 6 胶质瘤细胞， 待肿瘤直径达2 c . , 随机 分成7 组， 每组8 只， 其中一组为对照组，于肿瘤内 注射光敏剂血琳甲 醚( H M ME ,1 0 m g / k g ) ， 对 照组未注射光敏剂 注射后给予光动
2、力治疗， 光动力学疗法以功率为1 5 0 m W/ c m : 的H e - Ne 激光照射 1 5 mi n ， 将照射后大鼠分别于照 射后即 刻， 1 5 m in , 3 0 m i n , 6 0 m i n , 8 h , 2 4 h 取出肿瘤样本， 液氮冷冻储存， 真空冷冻抽干， 研磨后用电子自 旋磁共振机测量单态氧含量。 结果: 在所选定的剂量下， 照射后单态氧浓度逐渐增加 至6 0 min时达到高峰， 照射后8 h Vk后单态氧含量显著减低。结论: 光动力治疗 作用对肿瘤的抑制途径之一是光动力治疗后单态氧的产生短时间内迅速升高， 对肿瘤细胞起。N A光敏作用， 作用于细胞膜，
3、线粒体 以及核酸， 达到杀死肿瘤细胞目的。 ( 关搜词)光动力学疗法; C 胶质瘤; 血啡甲醚; 单态氧 中图分类号: R- 3 3文献标识码: A文章编号: 1 0 0 4 - 0 4 1 2 ( 2 0 0 6 ) 0 3 - 2 3 4 - 0 3 Ef f e c t o f t h e t o d y n a mi c t h e t i o n mon omo r a py o n r p h i s m o x y g e n c o n t e n t s ( 0 2 ) in d u c e d b y p h o - S D t u mo r - b e a r i n g
4、 r a t b y H e - N e l a s e r r a d i a - H U A N C H a i - y a n ,L l Y u n - b n , B I E Le t a l (D e p o r tm e n t o f N e r a o s tt r g e ry ,t h e F i r s t C l in ic a l H o s p ita l of J e a l i n U n i v e r s i ty , C h a r Wh u n 1 3 0 0 2 1 , C h i n a ) p a p e r re p o r t s th e e
5、 ff e c t o f ( 02 ) in d u c e d p h o t o d y n a m i c T h e mo n o mo r p h y s im o x y g e n c o n t e n t o f t u mo r c e ll we r e t o se v e n g ro u p s : (0 ) c o n tr o l g r o u p , ( 1 5 m) P D T g rou p 光动力学疗法( P h o t o d y n a m i c T h e r a p y , P D T ) 是一种治疗颅 内恶性肿瘤的有效方法。光动力狞法的基
6、础是生物光动力敏化 作用。在适当敏化剂存在下， 不同类型生物体、 细胞和生物大分 子， 在分子氧的环境中都会受到3 2 0 n m以上可见光的损伤或破 坏。光动力治疗已经成为神经外科脑胶质瘤综合治疗的一个重 要组成部分， 具有特异性杀伤作用。本文以S D大鼠胶质瘤为研 究对象，用相同剂量光动力治疗后不同时间取出肿瘤组织进行 单态氧含量测定。 探讨光动力治疗的理论基础和最佳治疗时机， 为临床应用提供依据。 1材 料 与 设 备 1 . 1 C , 胶质瘤细胞株:痛株为 C 6 胶质瘤细胞 ， 浓度: 6 x 1 0 6/ m t ; 由吉 林 大 学 生 化 研 究 所 提 供 作者简 介 :
7、黄海燕 ( 1 9 6 3 - ) , 男 ， 吉林 省公 主岭 市人 ， 副 主任 医师 ， 博 士 主要从 事神 经外科 临床工作 。 1 .2 实验动物:选取健康雌性S D大鼠4 $只， 体重(2 0 0 1 2 0 ) g ， 由 吉林大学医学院实验动物室提供。 1 3光源系统与光敏剂以及实验仪器: HN- 6 0 0型激光治疗 机 ( 长春中吉光电设备有限公司)激光波长:6 3 2 .8 - ( He - Ne L a se r ) ， 最大激光功率 6 0 0 .W; 5 0 0 - W(光纤末端输出) 。 输出方式: 单芯光纤输出( 可更换点状， 柱状， 球状光纤) 适用于 体表
8、以及腔内治疗 1 .4 光敏剂; 血啡甲醚,10.g/ml(第二军医大学药物化学研究 所提供) 0 .5 m g / k g ， 荷瘤大9 右腋下局部皮一 浸润注 射。 1 .5 电 子顺磁共振( E S R) 型号:J E S F E 3 X O E O L 公司 ) 。 1 .6 真空冷冻抽干机 1 .7 电子天平 D T -1 0 0( 北京光学仪器厂) 1 .8 单态氧侧试软件:E S R- 谱仪的计算机数据采集控制系统 操作版本: 1 .0 ( 长春应用化学研究所提供) 。 2方 法 2 .1 建立胶质瘤细胞模型: C 细胞为大鼠胶质瘤细胞株。收集 黄海燕1 周力疗法对S D大鼠C胶
9、质瘤照射后单态氧含量的 g r l 研 h .2 3斤“ 对数生长期生长状态良好的C, 细胞， 调整细胞浓度为 l .O x l o / ml， 细胞存活率达9 5 %以上。取健康的雌性 S D大鼠5 6只， 体重 2 0 0 - 2 4 0 g 以5 x 1 0 细胞/ 只， 接种于鼠右侧腋 皮下， 每只鼠注 射 。 5 m 1 接种后放回笼中正常饲养，观察接种后肿瘤生长情况， 在接种后l o d ， 肿瘤生长良好， 大小约呈直径1 . O c n m 大小的肿物 作为本试验的胶质瘤模型. 2 . 2 处理方法: 荷瘤大鼠随机分成 7 组， 每组 8只， 荷瘤大鼠照 射前肿瘤局部用8 % 硫
10、化钠脱毛。 对肿瘤内注射光敏剂血啦甲醚 1 O m g / k g ， 对照组未给子光敏剂, 2 4 h 后用1 0 % 水合抓醛0 .8 . 1 腹 腔内注射麻醉， 将大鼠四肢固定， 给予 He - N e激光治疗照射， 每只照射1 5 min ，分别于照射后即刻, 1 5 m i n , 3 0 min , 6 0 n u n , 8 h , 2 4 h ， 将肿瘤组织取出， 立即液氮冷冻保存， 待实验应用。 2 . 3 肿瘤细胞单态氧含量测定: 将液氮内冷冻保存的经过光动 力治疗的肿瘤标本放人真空冷冻抽千机内连续真空冷冻抽干 2 4 h后， 将肿瘤取出研磨成粉末状， 电子天平下将肿瘤称重
11、1 装人 磁共振管， 在电子自旋顺磁共振下测定单态氧含量。并以标样 为参照物( 浓度已知， 长春应化所提供) ， 分别测定标本所含单态 氧浓度。并应用S P S S 8 . 0 fo r Wi n d o w ， 统计软件包进行统计学 处 理 2 . 4 数据处理: n = No x S / S ox W; n 被测样本自旋数; N 标样自旋 数; w 被测样本重量; S 被测样品谱线的面积 S , 标准样品谱线 的面积) 。将所有数据均输人计算机，调用 S P S S 8 . 0 fo r Win - d . -统计软件包进行统计学处理 3结果 表 1 不 同处理 组单线 态氧含 量 照射样
12、 本实验组对照组 时间样本 浓度 标样 浓度 样/ 标祥木 浓度 标样 浓度样1 标 O mi n 8 0 . 0 0 0 7 0 . 0 1 2 4 0 . 0 5 6 5 0 . 0 0 1 1 0 . 0 0 9 7 0 . 0 0 3 4 1 5 m in 8 0 . 0 0 4 6 0 .0 1 0 0 0 .4 6 0 0 0 .0 0 3 8 0 .0 0 !巧0 .0 0 4 0 3 0 . 6 . 8 0 .0 0 5 0 0 .0 1 0 0 0 .5 0 0 0 0 .0 0 3 9 0 .0 0 8 5 0 .0 0 3 6 6 0 mi n 8 0加 3 6 0 .
13、0 0 4 6 0 . 7 8 2 6 0 . 0 0 5 6 0 . 0 0 8 3 0 . 0 0 4 2 8 h 8 0 . 0 0 5 0 0 .0 1 5 2 0 .3 2 8 9 0 .0 0 4 7 0 .0 1 5 5 0 .0 0 3 7 2 4 h 8 0 . 0 0 5 0 0 .0 1 6 9 0 .2 9 5 9 0 .0 0 4 0 0 .0 1 0 0 0 .0 0 4 0 _ 二 二 _，_- -一 生 1 匡 瓢 经过注射光敏剂后进行光动力治疗发生光敏反应.单线态 氧含量明显增加，并且在短时间内迅速上升 未经注射光敏剂， 即 使用激光照射， 肿瘤内单线态氧含量
14、非常低， 井且未发现单线态 氧的明显变化曲线。 从图中可以看到HP D波峰的相对强度随时 间变化。 光动力治疗后 1 5 n ti n即可测出单态氧存在， 并维持一定 浓度， 6 0 -in迅速达到高峰. 杀伤肿瘤作用最强。肿瘤光动力治 疗 8 h后单态氧含量已经降低至较低水平， s h含量与 2 4 h含量 差别已经无统计学意义。 以上实验表明， 光动力治疗短期内单态氧迅速达到高峰， 作 用于 肿瘤细胞杀伤细胞膜、 线粒体以及D N A ， 从而杀死肿瘤细 胞, 8 h后单态氧浓度明显下降，作用明显下降，本研究结果表 明，H e - Ne 激光光动力学疗法产生单态氧对肿瘤细胞的光敏 作用。这
15、些结果对临床研究及临床应用提供参考 4讨 论 光动力学疗法基本原理是 机体在接受光敏剂后一定时间， 光敏剂可以以相对较高浓度存留在肿瘤组织内，此时以特定波 长的光( 激光) 照射肿瘤部位， 光敏剂发生光化学反应， 在有氧的 情况下，产生化学性质非常活跃的单线态氧 ( 或/ 和某些 自由 基) 、 与肿瘤组织和细胞内多种生物大分子发生作用， 通过各种 信号途径，引起功能障碍和结构损伤，最终导致肿瘤组织消亡 川。动力治疗已经成为神经外科脑胶质瘤综合治疗的一个重要 组成部分，对于脑胶质瘤, a转移癌等恶性程度高的肿瘤， 光动力 的特异杀伤作用更显得难能可贵ra y 。单线态氧不是自由基.而是 一种激
16、发态的分子氧.其分子由两个氧原子组成， 但分子中电子 排布不同，单线态氧能量较高，化学性质活跃、其能量很容易转移 给靶因子，如果靶因子是生物膜， 会引起膜脂过氧化发光;如果靶 因子是发光剂， 则会引起发光剂的受激发光.血叶林衍生物 (h e m a t o p o rp h y r i n d e a i v a ti v e ,Hp D)在光照下可产生单线态氧 ( 1 0 a) , 用电子自 旋共振仪 ( E S P ) 测量单线态氧，该方法具有较好的 专一性， 并且空气中的氧气对测量结果无明显影响.光敏剂在光 的作用下， 可吸收一定波长的能量， 使其分子的能级由基态进人 激发态，此激发态分
17、子的能量转移到周围的氧分子时， 氧分子即 可由三线态氧转变为单线态氧，这种反应即称光敏反应ca i 影响光动力效应的因 素有很多 光敏剂浓度 照射剂量， 被 照射组织的生理特性， 血流状况， 氧分压等都在光动力过程中起 作用 本实验对以上影响因素采用统一标准， 以便观察相同条件 下， 单态氧浓度随时间变化的规律， 以探讨光动力治疗的最佳时 间油于单线态氧化学性质活跃， 其能量很容易转移给靶因子c +: 本实验在体外培养肿瘤细胞水平验证HMME - P DT的抑制肿 瘤作用，而且相同照射时间后的不同时问内的光动力杀伤作用 有明显变化， 从上表以及图形可以看出， 在电子顺磁共振下测出 单态氧浓度随
18、时问变化而变化。 分为两个阶段: 第一阶段是照射 后0 - 6 0 mi n o随着时间的延长单态氧浓度迅速升高，到 6 0 - i n时 达到高峰; 第二阶段是从 6 0 min - 2 4 h , 单线态氧浓度已经明显降 低 通过光动力治疗后单线态氧浓度旅线， 表明光动力治疗是快 速杀伤肿瘤的一种有效借施，为进一步进行光动力动物实验研 究和临床应用血啦甲醚介导光动力辅助手术治疗脑胶质瘤提供 了相关参考依据。 (T 转2 3 7 页 ) 08筋 : .: ) 1 0 1 5 3 0 6 0 8 h 2 4 h 图 1 实验 组与对 照组 不同时问 的单线 态氧 含量变化 曲线 本实验对H。
19、一 N。激光光动力学疗法作用后不同时间阶段 单态氧的浓度变化， 肿瘤细胞单态氧含量测定结果经过S A S软 件方差分析表明:实验组 0 ,1 5 ,3 0 , 6 0 组 有明显差异 (P 0 .0 5 0 2 .2 I L - 1 RA对绿脓杆菌培养液导致的角膜基质细胞胶原降解 的影响: 在角膜基质细胞存在的情况下， I L - 1 R A随添加浓度的 升高，以剂量依赖关系抑制绿脓杆菌培养液导致的角膜基质细 胞胶原降解， 在。 t I O m g / m l 浓度已达具有统计学意义的抑制胶 原降解量 ( P 0 . 0 5 ) ;而在无角膜基质细胞存在的情况下， I L - I 的添加对胶原
20、降解量没有影响。见表2 0 3讨 论 研究结果显示:绿脓杆菌培养液可直接降解1 型胶原并 呈剂量依赖方式， 在角膜基质细胞存在的情况下， 这种胶原降解 作用更强。 说明绿脓杆菌的病原因子可以直接降解胶原， 而且角 膜基质细胞也参与到胶原降解之中。有结果显示角膜基质细胞 可分泌MMP o MMP能裂解胶原。角膜基质细胞分泌的MMP 以酶原的方式存在，它还需丝氨酸蛋白酶如纤溶酶的活化才能 发挥作用。在这里绿脓杆菌培养液中病原因子( 蛋白酶) 可能起 到活化MMP的作用“ o )I 1. - 1 R A可显著抑制由角膜基质细胞 介导的胶原降解作用，而对不含细胞的单纯由绿脓杆菌培养液 导致的胶原降解毫
21、无作用。提示在角膜基质细胞介导的胶原降 解过程中， 内源性I L - 1 发挥了重要作用。 研究表明， 角膜基质细 胞产生的 IL - 1可通过旁分泌和自分泌影响自身和周围细胞调 控MMP的表达。实验发现内毒素在体外可以诱导I L - 1产生。 并且在无任何外界刺激的条件一， 角膜可自然产生I L -1 .几-1 是一种具有广泛生物活性的蛋白质， 主要由单核巨噬细胞产生， 据其编码基因和理化 性质不同分为I L - 1 a , IL - 甲两类。 实 验表 明 IL - l a促进基质细胞胶原降解 3 1 , IL - 1 p作为多核细胞趋化 剂介人炎症反应， 诱发多种细胞因子的产生释放， 促
22、进大量白细 胞进人角膜，并可刺激角膜基质金属蛋白酶产生，导致组织疏 松， 细胞间隙增宽， 有利于炎症细胞的浸润， 由此又可导致几- 1 合成分泌增多，加重组织病理损伤。因此利用I L - I RA去逆转 I L - 1所致的异常变化， 成为治疗相关疾病的新手段。 V I n h h n a H 通过实验也证实了IL - 1 对胶原降解的促进作用， 并且I L - I RA 可以抑制这种由I L -I 介导的角膜基质细胞胶原降解a IL-IRA是单核巨噬细胞分泌的一种蛋白质分子，它通过 特异性地与I L - 1 受体结合，并且不激活靶细胞而对抗 I L - 1的 生物学效应， 阻断I L -1
23、在机体的免疫应答、 感染、 炎症反应和组 织损伤中的作用。 T h a k u r A等认为外源地给予重组I L - I RA能 显著减轻疾病的严重程度IQ 。目前I L - 1 R A已成功地试用于多 种疾病的治疗， 如角膜移植排斥反应, G -。病、 类风湿性关节 炎等， 有大约1 0 万名患者接受治疗而无副作用的报道。 4参 考 文 献 1 1 K ima c k i K A , H o b d e n J A ,Ha z le tt L D,e r a l .I n v iv o b a c t e r ia l p rote a s e p r o d u c t io n d u
24、r i n g p s e u d o m o n a s a e r u g i n ma c o rne a l i n - f e c ti o n 口 . I n v e s t吻 h t h a lmo l Vis S c i , 1 9 9 5 ; 3 6 : 1 3 7 1 . 2 Mis h ima H, Ok a mo t o J , N a k a mu r a M, e r a l. C o lla g e n o ly ti c a c ti v i t y o f k e r a t o c y t e s c u l tu r e d i n a c o ll a
25、g e n ma t r ix口 一 j p n j Op h th a 1mo 1 , 1 9 9 8 ; 4 2 ( 2 ) : 7 9 . 3 郝继龙， 陆 瑛， 贾 卉， 等. 绿脓杆菌对角膜基质细胞介 导的胶原降解作用的影响口 中华眼科杂志， 2 0 0 0 ; 3 7 ( 1 ) : 4 2 . 4 郝继龙， 孙松舫， 刘 薇， 等. 白细胞介素l a 对兔角 膜基质 细胞胶原降解代谢的影响 川. 白求恩医 科大学学报， 1 9 9 8 ; 2 4 ( 2 ) : 1 4 1 . 5 N a g a n o T , Na k a mu ra M, Nis h id a T. D i
26、ff e r e n ti a l reg u la ti o n o f c o l la g e n d e g ra d a ti o n 衍ra b b it k e r a t o c y t e s a n d p o l y mo r- p h o n u c le a r l e u k o c y t e s 口 一 C u r r E y e Re s , 2 0 0 2 ; 2 4 (3 ) : 2 4 0 . 6 D h a k u r A, Xu e M, S t a p l e t o n F , e t a l. B a la n c e o f p r o a
27、n d a n ti - i n tl a n u n a t o ry , c y to k i n e s c o r r e l a t e s 、 记 :o u t c o m e o f a c u te e s p e r im e n ta l P s e u d o m o n a s a e m g in o s a k e ra tr t is 口 I n fe c t I n n n u n , 2 0 0 2 ; 7 0 ( 4 ) : 2 1 8 7 . 收稿日 期 2 0 0 5 - 0 9 - 0 2 编校: 龙英丽 杨宇1 ( 上接2 3 5页) 5参 考 文
28、献 1 Mla d e n k o r b e l ic k , G ro a z d k r o s l , e t a l . . T h e R o l e o f H o s t L y m p h o id P o p u l a t io n in th e R e sp o n s e o f Mo u s e E MT 6 T u mo r t o p h o t o 即n a mi c T h e a p y 口 . C a n c e r Re s e a rc h , 1 9 9 6 ; 1 5 : 5 6 4 7 2 1 Mu ll e r P J . P h o t
29、o d y n a n ti c th e r a p y f o r m a l ig n a n t n e w ly d i a g - n o s e d s u p t a t e n t o r i a l g li o m a s口 一 J C li n L a s e r Me d S u r g , 1 9 9 6 ; 1 4 : 2 6 3 . 3 Ha s a n T . ln T J .D o n g h e rt y , B .W. H e n d e a o n .E d s . P h o t o d y n a n u c th e m p y :B a si
30、c p ri n c i p a l s a n d c l in i c a l a p p li c a ti o n M . M a r c e l De k k e r : Ne w Yo r k NY , 1 9 9 2 : 1 8 7 - 2 0 0 4 1范志民 鼠移植胶质瘤手术加光动力治疗的实验研究1J l . 中国激光医学杂志， 1 9 9 6 ; 5 ( 3 ) : 1 5 2 5 1 庞战军， 周 玫. 自由基医学研究方法【 M . 北京: 人民卫 生出版社， 2 0 0 0 : 3 - 8 . 6 1池顺姬. 小鼠胶质瘤微血管光动力治疗损伤修复的超微结 构研究口 科学院肿瘤 研究， 1 9 9 4 ; 1 5 ( 2 ) : 7 2 . 7 司徒镇强， 吴军正， 主编. 细胞培养 M . 西安: 世界图 书出 版公司， 1 9 9 6 : 1 8 61 8 7 . 18 1 梁永茂一临床激光医学【 M .长沙: 湖南科学技术出版社， 1 9 9 3 : 2 5 1 卜 2 5 1 收稿日期 2 0 0 5 - 1 2 - 1 2 编校: 李凯杨宇1