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1、 第2 7卷 第3期 2 0 0 6年5月 武汉大学学报 ( 医学版) M e d i c a l J o u r n a l o fWu h a nU n i v e r s i t y V o l . 2 7N o . 3 M a y,2 0 0 6 课题来源: 国家自然科学基金资助项目( 编号:3 0 3 7 1 5 5 4) 作者简介: 何晓宁,男,1 9 7 8 -, 医学硕士生, 主要从事口腔修复学研究 通讯作者: 程祥荣,女,1 9 3 9 -, 教授, 博士生导师, 主要从事口腔修复学临床和基础研究 壳聚糖胶原支架复合胰岛素样生长因子- 1 在牙周组织工程中的应用 何晓宁 刘同
2、军 石珊珊 程祥荣 武汉大学口腔医学院口腔医学生物工程教育部重点实验室 武汉 4 3 0 0 7 9 摘要 目的: 观察复合胰岛素样生长因子- 1(I G F | 1) 的壳聚糖胶原支架对体外培养 的 人 牙 周 韧 带 细 胞 (P D L C) 的影响, 以探讨复合I G F - 1的壳聚糖胶原支架在人P D L C增殖中的作用。方法: 将体外培养P D L C接种于 复合I G F - 1的壳聚糖胶原支架上, 通过MT T法测定对细胞增殖的影响, 同时通过半定量P C R检测细胞mR NA合 成变化。结果:P D L C在两种不同支架上的增殖及mR NA合成情况有显著性差异(P0. 5)
3、 。结论: 该复合支架可 以作为I G F - 1的载体; 复合在支架上的I G F - 1对P D L C的粘附与增殖及细胞外基质的合成均有较好地促进作用。 关键词 壳聚糖; 胶原; 支架; 生长因子; 牙周韧带细胞 中图分类号 R 7 8 3. 1;Q 8 1 文献标识码 A 文章编号 1 6 7 1 - 8 8 5 2(2 0 0 6)0 3 - 0 3 2 3 - 0 3 A p p l i c a t i o no fC h i t o s a n /C o l l a g e nS c a f f o l dC o n t a i n i n g R e c o m b i n e
4、 dH u m a nI G F - 1i nP e r i o d o n t a lT i s s u eE n g i n e e r i n g H EX i a o n i n g,L I UT o n g j u n,S H IS h a n s h a n,C H E N GX i a n g r o n g K e yL a b o r a t o r yo fO r a lB i o m e d i c a lE n g i n e e r i n go fM i n i s t r yo fE d u c a t i o n,S c h o o l o fS t o m a
5、 t o l o g y, Wu h a nU n i v e r s i t y,Wu h a n4 3 0 0 7 9,C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e:T os t u d yI G F - 1c o m b i n e dc h i t o s a n/c o l l a g e ns c a f f o l da n dt oo b s e r v e t h eb i o l o g i c a l a c t i v eo fh u m a np e r i o d o n t a l l i g a m e n t c e
6、l l s(P D L C s)c u l t u r e do n i nt h es c a f f o l d .M e t h o d s:P r o l i f - e r a t i o no fP D L C sw a s e x a m i n e db yMT Tm e t h o dw h e nP D L C sw e r e c u l t u r e d i nc h i t o s a n/c o l l a g e n s c a f f o l d sw i t ha n dw i t h o u t I G F - 1a n dt h ee f f e c t
7、o f I G F - 1c o m b i n e ds c a f f o l do nmR NAs y n t h e s i s e x a m i n e db ys e m i - q u a n t i t i v eR T - P C R.R e s u l t s:T h ep r o l i f e r a t i o na n dE CMs y n t h e s i so fP D L C s h a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw h e nc u l t u r e di nd i f f e r e n t
8、t y p e so fs c a f f o l d s .C o n c l u s i o n:T h ec h i - t o s a n/c o l l a g e ns c a f f o l dc o u l db eag o o dc o n t r o l l e dr e l e a s e ds y s t e mo f I G F - 1a n d t h e c o m p l e xs c a f - f o l d sh a v es i g n i f i c a n t l ye f f e c t so np r o l i f e r a t i o no
9、 fP D L C sa n dE CMs y n t h e s i s . K e yW o r d s C h i t o s a n;C o l l a g e n;S c a f f o l d;G r o w t hF a c t o r;P e r i o d o n t a lL i g a m e n tC e l l 牙 周 韧 带 细 胞 (P e r i o d o n t a ll i g a m e n tc e l l, P D L C) 是牙周组织的主要细胞成分之一, 它具有多 向分化潜能, 有较强的合成胶原的能力, 促进P D L C 生长是增强、 形成新的附
10、着的重要方法, 是牙周组织 修复再生的基础。 胰岛素样生长因子1( I n s u l i nl i k eg r o w t hf a c - t o r - 1,I G F - 1) 是一个重要的有丝分裂原, 能对多种细 胞产生广泛的生物活性, 促进来源于多种结缔组织 和细胞系的成纤维细胞的有丝分裂的作用, 并能促 进细胞生长、 分化及细胞外基质的合成。I G F - 1对 武汉大学学报( 医学版)第2 7卷 P D L C有 明 显 的 促 分 化 作 用, 作 用 于P D L C后, P D L C总蛋白质及胶原的合成都明显增加, 将外源 性的I G F - 1加入到体外培养的细胞中
11、, 能显著地促 进细胞增殖、 分化和促进基质蛋白如蛋白多糖、型 胶原以及非胶原蛋白的合成 1。 本实验采用壳聚糖/胶原支架复合I G F - 1, 建立 缓释系统, 作为P D L C的载体进行体外培养, 检测复 合在支架上的I G F - 1对P D L C的增殖, 粘附及细胞 外基质合成的促进作用, 以期为牙周组织工程的进 一步研究寻求理论基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 胎牛血清( F B S,G i b c o,美国) , 高糖 DMEM(D u l b e c c os m o d i f i e d E a g l es m e d i u m, G i b c o,美国)
12、, 胰蛋白酶(S i g m a,美国) ,I G F - 1(P e p - r o T e c h,英国) , 小鼠抗人波形丝蛋白抗体(D AKO, 丹麦) , 噻唑蓝(MT T,S i g m a,美国) , 壳聚糖(G i b - c o,美国) ; 胶原, 由鼠尾肌键中提取。 1. 2 实验设备 磁力搅拌器, B E TA 1 - 1 5型冷冻干 燥机(C h r i s t, 德国) , C O2恒温细胞培养箱(H e r a e u s, 德国) , 倒置相差显微镜(O l y m p u s, 日本) , 扫描电镜 (H i t a c h i - 5 7 0, 日本) ,P
13、C R仪(A B I,美国) , 凝胶成 像分析系统( S y g e n e,美国) 。 1. 3 壳聚糖-胶原支架的制备 将胶原及壳聚糖用 0. 5m o l/L乙酸分别配成0. 5%(w/v) 的溶液, 将两 种材料分别注入培养皿,-2 0 成型后移入冷冻干 燥机冻干。7 5%乙醇浸泡, 大量P B S冲洗去除残余 乙醇, 紫外线照射3 0m i n。将灭菌后的材料再溶于 乙酸, 在无菌台中按1:1比例混合, 加入I G F - 1, 冻 干成1 0mm1 0mm5mm的支架, 每个支架含 2 0 0n gI G F - 1, 备用 2。 1. 4 P D L C的培养 取临床上无龋病、
14、 无龈炎的 1 3 - 1 9岁正畸拔除的前磨牙。刮下根中1/3部位的 牙周膜组织。按组织块贴壁法培养。每3d换液1 次, 贴壁良好的组织块均在1 0d内有细胞长出, 自 细胞从组织块周围游出至长满瓶底需要1 0d, 细胞 达到汇合点用0. 1 2 5%的胰酶按1:2传代。 1. 5 细胞接种 第4代P D L C用0. 2 5%胰酶消化 后稀释至11 0 9/ L, 用移液枪缓慢加至六孔板内的 支架中, 每块支架约2 0l。置于细胞培养箱中。4h 后, 每孔加4m l含1 0%F B S的DMEM培养液, 继续 培养。 1. 6 细胞增殖检测(MT T法) 试验组为含2 0 0n g 生长因
15、子的支架, 对照组为空白支架, 培养液中滴加 2 0 0n g生长因子。在含1 0%F B S的DMEM、 标准环 境下培养2 4, 4 8,7 2,9 6,1 2 0h, 每组6个孔。每孔加 MT T(50 0 0m g/L)1 0 0l, 继续培养4h, 轻轻吸尽 上清, 加20 0 0l二甲基亚砜, 振荡3 0m i n, 使结晶 物充分溶解, 用酶联免疫检测仪测定4 9 0n m的吸光 度值。 1. 7 R N A提取与半定量P C R 复合I G F - 1的支架 为试验组, 培养液中滴加生长因子支架为对照组, 细 胞接种支架后用含1 0%F B S的培养基培养2 4, 4 8, 7
16、 2,9 6h后提取细胞R NA, 逆转录后进行聚合酶链 反应。电泳结果用凝胶成像系统进行影像学分析, 结果用细胞外基质mR NA与GA P DH mR NA比值 表示。 1. 8 统计分析 所有试验均重复3组, 取平均值作 为最后结果, 使用S P S S 1 1. 0进行统计。以P0. 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果 2. 1 细胞鉴定 原代及传代培养的细胞形态相似, 为长梭形细胞, 有2 - 3个细胞质突起, 胞核呈圆形或 椭圆形, 核仁清晰, 细胞排列成束状。免疫组化染色 表明, 细胞波形丝蛋白阳性, 角蛋白阴性, 证实所细 胞为来自中胚层的成纤维细胞( 见封二,图1,2) 。
17、 2. 2 细胞增殖检测 接种后2 4h, 复合有I G F - 1的 支架粘附的细胞数量与对照组支架间无明显差异, 而第4 8h后的检测结果则显示, 两种不同支架上的 细胞数量有显著性差异 (P0. 0 5) , 说明复合有 I G F - 1的支架有明显促进P D L C增殖的作用( 图3) 。 图3 P D L C增殖情况 F i g . 3 P r o l i f e r a t i o no fP D L C s 2. 3 m R N A合成 通过凝胶成像系统对多功能蛋 白聚糖和纤维粘连蛋白mR NA电泳结果分析, 结果 表明试验组与对照组间细胞外基质mR NA合成有 显著差异( 图
18、4,5) 。 3 讨论 大量的实验研究已经证明,P D L C作为牙周膜 的重要组成部分, 因其具有分化潜能, 在牙周膜的形 423 第3期 何晓宁, 等.壳聚糖胶原支架复合胰岛素样生长因子- 1在牙周组织工程中的应用 图4 多功能蛋白聚糖m R N A表达情况 F i g . 4 m R N Ae x p r e s s i o no fv e r s i c a n 图5 纤维粘连蛋白m R N A表达情况 F i g . 5 m R N Ae x p r e s s i o no f f i b r o n e c t i n 成与修复中起着重要的作用, 是牙周组织再生与新 附着形成的重
19、要成份。因此促进P D L C在种植体- 组织界面的黏附、 增殖与分化, 对于牙周膜的再生与 修复具有重要意义。但是, 单纯靠种植界面存在的 机体自身的P D L C来实现此目的, 存在细胞量不足 及附着率过低的问题。因此, 利用组织工程技术促 进牙周膜的再生和修复, 具有一定临床意义。 I G F - 1是一种具有多种功能的生长因子。研究 表明, I G F - 1在P D L C的黏附、 增殖及细胞外基质的 合成等方面起重要的调控作用。目前组织工程中外 源性生长因子引入的方法可分为在培养液中直接加 入、 通过转基因细胞过分表达以及构建缓释系统三 种, 前者作用时间短且生长因子流失较大, 故
20、已较少 应用, 以后两者较为常用。壳聚糖和胶原作为天然 支架材料有着优异的生物学性能, 壳聚糖能促进成 纤维细胞合成胶原, 胶原可以作为细胞因子的有效 载体 3。已有学者通过研究证实, 壳聚糖胶原支架 可用于培养不同的细胞, 并能促进成纤维细胞在种 植体 表 面 的 早 期 黏 附 4。本 实 验 采 用 冻 干 法 将 I G F - 1复合于壳聚糖/胶原支架上, 利用胶原的包裹 作用使支架成为生长因子的控释载体, 减少了单纯 滴加生长因子在培养液中的损耗, 延长了作用时间。 P D L C的培养结果表明, 使用冻干法复合于壳聚糖 胶原支架上的I G F - 1保存了大部分活性, 仍能发挥
21、其对促黏附和增殖及基质mR NA合成作用。并且 与单纯滴加生长因子的壳聚糖胶原支架比较, 复合 I G F - 1的支架能够更好的地促进细胞的增殖与纤维 粘连蛋白及多功能蛋白聚糖mR NA的合成, 相应的 蛋白合成含量变化则需要免疫组化试验进行证明。 这一结果与一些学者使用聚乳酸支架材料进行细胞 培养的结果有很大差异 5。虽然不排除实验误差的 存在, 但胶原优秀的生物学性能也是一个主要原因。 近年来有学者认为, 冻干法复合生长因子的支 架在性能上仍不能很好的满足临床要求, 用微球包 裹生长因子构建缓释载体可取得更为理想的结果。 所以构建微球将I G F - 1复合到壳胶支架上并通过动 物试验比
22、较两种方法的差距将是今后的实验方向。 参考文献 1 P a l i o t oD B,C o l e t t aR D,G r a n e rE,e ta l .T h ei n f l u - e n c eo f e n a m e lm a t r i xd e r i v a t i v e a s s o c i a t e dw i t h i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r - Io np e r i o d o n t a l l i g a m e n t f i b r o b l a s t s J. JP e r
23、i o d o n t o l,2 0 0 4,7 5(4) : 4 9 8 - 5 0 4. 2 P e n gL,C h e n gX R,W a n gJ W,e ta l . P r e p a r a t i o na n d e v a l u a t i o no fp o r o u s c h i t o s a n/c o l l a g e ns c a f f o l d f o rp e r i - o d o n t a l t i s s u ee n g i n e e r i n gJ. J o u r n a lo fB i o a c t i v ea n
24、 d C o m p a t i b l eP o l y m e r s,2 0 0 6,(i np r e s s). 3 N a g a iM,H a y a k a w aT,F u k a t s u A,e ta l . I nv i t r o s t u d yo f c o l l a g e nc o a t i n go f t i t a n i u mi m p l a n t s f o r i n i t i a l c e l l a t t a c h m e n tJ.D e n tM a t e rJ,2 0 0 2,2 1(3) :2 5 0 - 2 6
25、 0. 4 D a v i dS,G r u b e rH,M a y e rR A,e ta l . L u m b a rs p i n a l f u s i o nu s i n gr e c o m b i n a n th u m a nb o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i ni nt h ec a n i n e .Ac o m p a r i s o no ft h r e ed o s a g e s a n dt w oc a r r i e r sJ. S p i n e,1 9 9 9,2 4(1 9) :1 9 7
26、 3 - 1 9 7 9. 5 C h u n gL,S c h m i d tR,H a m l y nP,e ta l .B i o c o m p a t i - b i l i t yo fp o t e n t i a lw o u n dm a n a g e m e n tp r o d u c t s:f u n g a l m y c e l i aa sas o u r c eo fc h i t i n/c h i t o s a na n dt h e i re f f e c t o nt h ep r o l i f e r a t i o no fh u m a nF 1 0 0 0f i b r o b l a s t s i nc u l - t u r eJ. JB i o m e dM a t e rR e s,1 9 9 4,2 8(4) :4 6 3 - 4 6 9. (2 0 0 6 - 0 1 - 1 6收稿) 编辑 沈建国 523