多元免疫分析技术在生物医学领域的最新研究.pdf

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1、 绘述与进展 J M e d R e s , F e b 2 0 0 8 . V o l . 3 7 N o . 2 多元免疫分析技术在生物医学领域的最新研究 侯晓晖刘白玲张宏玉 免疫分析技术是现代生物医学领域里的一个重要的研究 课题， 在当今社会， 它已成为一个非常重要的工具， 在临床诊 断与基础研究、 D N A与基因分析、 高通量药物筛选与新药开 发、 反恐怖袭击、 公众场所毒害物质与传播疾病的检测防护、 食品 与水源 危害物检测等 众多方面发挥着关键性的作用 。 从2 0 世纪4 0 年代以来， 免疫分析技术得到了不断的发展与 完善， 先后形成了免疫荧光技术( 1 9 4 1 ) 、

2、放射免疫技术 ( 1 9 5 9 ) 和酶免疫技术( 1 9 6 6 ) 三大经典免疫分析技术。虽然 一系列传统的免疫分析技术在2 0世纪6 0 代年和7 0年代受 到了广泛的关注与欢迎， 但通常情况下， 在一个分析体系人们 只能对一种酶一 底物、 抗体 一 抗原以及受体一 配体的相互作 用进行检测， 无法将含有复杂成分的样品或多种样品进行同 步检测， 并且还普遍存在着灵敏度不高、 分离步骤繁杂、 样品 消耗大、 费时费力、 分析费用高、 周期长、 测试效率低等缺点。 随着生物医学、 分子生物学、 受体学、 基因学的快速发展， 人们 对免疫分析技术提出了越来越高的要求， 促使传统的免疫分 析技

3、术逐步向多元化、 高通量化、 微型化发展， 不断开发快速、 简单、 灵敏度高、 探测下限浓度低的高效免疫分析新技术， 近 年来已成为国内外生物医学领域一个非常热门的研究课题。 一、 免疫分析概况 现代免疫分析的早期形式产生于1 9 5 9 年B e r s o n 和Y a l - 1 ，等 人开 创的 放 射免疫分析法( r a d i o im m u n o a s s a y , R I A ) ( 2 1 , 他们利用1 5 I 标记胰岛素， 并使其与血浆中游离的胰岛素共同 竞争有限的胰岛素抗体特异性结合位点， 最终形成的放射性 抗原一 抗体复合物与待测物含量呈线性负相关， 应用口

4、一 ， 计 数器即可检测。该法灵敏度高， 特异性强， 抗体抗原易于碘化 标记， 应用范围宽; 但存在的主要缺点是: 使用放射性元素带 来了放射污染处理难的问题， 不仅有可能影响操作人员的健 康， 而且限制了试剂的寿命， 难以获得长期稳定的检测标准， 因而使得操作成本很高。尽管从 1 9 7 9 年以来逐渐发展的邻 近闪烁分析技术在传统的放射免疫分析技术基础上有了很大 改进， 有效避免了紧琐的分离步骤， 并且很好地实现了商业 化， 但是该项技术仍然存在着一些缺点: 检测试剂盒和操作费 用较高， 同位素衰变周期短而导致长时间连续自动化分析存 在困难， 测试过程中非特异性干扰信号难以消除， 由于体外

5、测 资助项目: 国家自 然科学基金( 2 0 5 7 4 0 7 1 ) 作者单位: 6 1 0 0 4 1 中国科学院成都有机化学研究所( 侯晓晖、 刘 白玲) ; 2 5 7 0 6 1 中国石油大学化学化工学院( 张宏玉) 通讯作者: 刘白玲， 电子信箱: b l l iu c h e m h o tm e i l . c o m 试环境的改变和生物大分子在与荧光微球结合的过程而导致 的构象发生改变会使检测结果与体内环境免疫特性发生偏 差， 等等。因此， 要将这种技术从传统型向多元免疫分析发展 还存在种种技术困难等。根据国外的统计显示， 国际上在免 疫分析中采用放射性同位素作为标记所占的

6、比例正在迅速减 少， 而非放射性免疫分析方法所占的比重正在上升，。 从2 0 世纪后半叶以来逐渐发展起来了多种非放射性免疫分析技 术， 例如荧光偏振免疫分析、 时间分辨荧光免疫分析、 酶联免 疫分析 ( E L I S A ) 、 化学发光免疫分析、 生物发光分析、 电化学 发光免疫分析等等， 通过不断改进， 这些技术逐渐走向成熟。 但是， 它们还是存在检测反应物下限浓度不够低， 检测灵敏度 不高， 不易区分和定量同个体系中产生的不同检测信号， 自 动 化、 高通量化及微量化程度不高等缺点。突破传统的免疫分 析测试的限制， 研究开发更加高效、 快速、 灵敏、 可靠的多元免 疫分析已经成为一个现

7、代科技发展的必然趋势。 二、 多元免疫分析研究的新进展 多元免疫分析具有很多传统免疫分析无法比拟的优点: 可以在一次分析中对多个分析物进行筛选， 与单一靶点作用 的筛选体系相比通量更高， 并能有效降低采样产生的偏差， 还 可进行痕量检测， 检测下限浓度低， 灵敏度高. 可以很大程度 地节约昂贵的分析样品的用量， 可有效提高筛选质量和降低 成本。 下面， 将主要从基本工作原理、 操作方法入手， 对国外近 年来成功研究的多元免疫分析技术进行介绍。 1 . 流式细胞术: 所谓流式细胞术( fl o w c y t o m e t r y ) ， 是一种 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进

8、行多参 数、 快速( 每秒可达 1 0 0 0 一 1 0 0 0 0 个) 的定量分析和分选( 纯度 可达9 9 %以上) 的技术。使用的流式细胞仪( fl o w c y t o m e t e r ) 是集光电子物理、 光电测量、 计算机、 细胞荧光化学、 单抗技术 为一体的高科技细胞分析仪， 主要由激光发光系统、 流动室及 液流驱动系统、 光学系统、 信号检测系统、 数据分析系统几大 部分组成。在过去的2 0年中， 流式细胞术已经成为临床诊 断、 新药筛选等领域一个不可缺少的工具 。由于该技术能 够分辨不同荧光色团受激发产生的多个波长范围的信号， 并 且可以以每秒对上千个荧光粒子扫描的

9、速度对同一样本中的 多个不同的分子进行同步检测， 因此适合用于多元免疫分析 测试。 该技术的工作原理是: 以大小均一的聚苯乙烯微球( 粒径 大小l O n 。一 I O O O W M ) 作为检测抗体的固定载体， 在微球的制 造过程中掺人两种不同的红色分类荧光( 常用的荧光素如表 1 0 6 万方数据 医学研究杂志2 0 0 8年 2月第 3 7卷第 2期 缘述与进展 1 所示) ， 根据这两种不同分类荧光的比例不同， 可以把球形 基质分为1 0 0 种， 这样每个微球在发光光谱中都有一个光谱 地址。利用这 1 0 0 种特异的微球， 可以标记上 1 0 0种不同的 探针分子同时对一个样本中

10、的1 0 0 种不同的目的分子进行检 测。在检测前， 把针对不同检测物的核酸( 互补链) 和蛋白 ( 如抗原抗体) 共价固定在具有特定光谱地址的微球上; 然后， 将这些用不同颜色编码的微球混合， 加人被检测物( 被检测物 可以是血清中的抗原、 抗体或酶等， 也可以是聚合物酶链反应 ( P C R ) 产物) ， 在悬液中的微球与被枪测物特异性结合， 并带 有荧光标记。然后微球呈单列通过两束激光， 一束判定微球 的颜色从而决定被测物的特异性( 定性) ; 另一束测定微球上 的荧光标记强度从而决定被测物的量( 定量) 。所得到的数据 经电脑处理后可以直接用来判断结果。 表 1 流式细胞术中常用的荧

11、光素 F I T C ( 异硫氮酸 荧光素) P E ( 藻红蛋白) P e r c P ( 多甲藻黄素叶绿 素蛋白) 深红色 P I ( 碘化丙陡)A P C ( 别藻蓝蛋白) 荧光颜色 特征波长 绿色 5 2 0 n m 橙黄色 5 7 5 n m6 7 5n m 橙红色 6 2 0 n m. 红色 6 6 0 n m 一 s 4 8 8 n 二波长的氢离子激光激发; * s 6 3 0 n 二波长的氦氖激光或红色二极管激光激发 针对这一原理， 美国 L u m i n e x 公司将流式细胞术实现了 很好的商业化应用， 其公司推出的L u m i n e x “ 0 等多个系列的多 功能

12、悬浮点阵仪和试剂盒使免疫分析取得了巨大进步; 它和 以前的平面式点阵仪相比， 具有更佳的灵活性， 减少了抗体的 构象改变， 提高了反应动力学参数， 并且具有三维结构的微球 对蛋白质的更大的承载能力也使这一技术成为免疫分析中一 个非常灵敏的平台， 因此， 流式细胞术的深入研究也受到了广 泛的关注。 2 0 0 5 年， 美国马里兰州国家标准与技术研究所的 W a n g L i li 及 其同 事在L u m in e x 0 0 标准检 测 技术上进行了 改 进， 将4 0 n m表面带有醛基的聚苯乙烯微球用作荧光指示器， 利用 悬浮点阵仪对两种生物毒素蓖麻毒素( r i c t i n A

13、C h a i n ) 和 B g 芽胞杆菌( b a c i l l u s g l o b i g i i ) 一 进行同步的夹心式免疫分析 ( s a n d w i c h 一 t y p e i m m u n o a s s a y ) I i 。 操作过程可以描述如下: 首先将 L u m i n e x 试剂盒提供的带有编码的微米级聚苯乙烯微 球与针对待测毒素的抗体共价结合， 然后加人生物毒素， 利用 抗体 一 生物毒素之间的特异性作用使之形成微球 一 生物毒素 复合体。然后加人带有两种橙色荧光团并共价固定特定抗体 的纳米级微球， 再与微球 一 生物毒素复合体作用形成夹心结 构

14、， 通过L u m i n e x 0 0 悬浮 点阵仪来检测信号。 这种改进和以往 采用的L u m i n e x 0 0 标准分析法相比具有2 个优点: 避免了使 用生物素化的特定抗体和用荧光素标记的链肌亲和素( s t r e p - t a v i d i n ) ， 简化了操作步骤， 节约了成本; 与通常使用的藻红 蛋白荧光素( P E ) 相比， 检测灵敏度可提高2 一1 0倍， 对样品 中 检 测 物的 浓度 要 求 可 低至1 一 5 n g / m l 。 更重 要的 是， 2 种待 测物并不会在检测过程中产生相互干扰。因此， 这种纳米级 的微球可用作一种很好的荧光指示器。

15、在最近的两三年时间 里， 有越来越多的学者发表文章， 将流式细胞分析技术应用于 T N T 危害物检测、 流行性感冒病毒监测、 病原体检测等方面， 这些成果表明多元免疫分析在未来具有广阔的发展空间。 2免疫聚合酶链反应技术: 聚合酶链反应( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n , P C R ) ， 又称无细菌克隆技术( “ fr e e b a c t e r i a “ c lo n in g t e c h n iq u e ) ， 是一种对特定的D N A片段在体外进行快 速扩增的新方法。技术最早由美国 C e t u s 公司人

16、类遗传研究 室K a ry M u l l i 。 及其同事于1 9 8 5 年发现并研制成， M u l l i s 因此 获得了1 9 9 3 年度诺贝尔化学奖。从P C R首次提出至今， 在分 子生物学的基础研究中扮演着越来越重要的角色， 广泛地用 于基因克隆和制造突变。 P C R技术的基本原理: 众所周知， D N A是由四种碱基按 互补配对原则( 即腺嗓吟A对胸腺喻吮T ， 鸟嗓吟G对胞啥吮 C ) 组成的螺旋双链。在细胞内， D N A复制时， 解螺旋酶首先 解开双链让它变成单链做为模板， 然后， 另一种酶一 R N A聚合 酶合成一小段引物( p r i m e r ) 结合到

17、 D N A模板上， 最后， D N A 合成酶以这段引物为起点， 合成与 D N A模板配对的新链。 P C R即是在体外模拟 D N A复制的过程， 它用加热办法让所研 究的D N A片段变性变成两条单链， 人工合成两个引物让它们 结合到D N A模板的两端， D N A聚合酶即可以大量复制该模 板。 免疫聚合酶 链反应技术( i m m u n o 一 p o l y m e r a s e c h a in r e a c - t i o n , I P C R ) 最早出现于1 9 9 2 年建立的抗原检测系统， 是基于 特定抗体和用作生物标志物的核酸分子结合， 利用P C R技术

18、使核酸分子获得片段扩增， 用扩增的D N A分子代替E L I S A中 的酶， 与抗体联结起来， 从而可用测定扩增 D N A的量来反映 抗原的量。由于扩增核酸分子碎片能够放大检出信号， 因而 大大提高了灵敏度。它和传统的酶联免疫分析( E L I S A ) 在原 理上比较相似， 不同之处在于对于免疫 P C R的要求更加严 格， 不仅需要合成特定的抗体一 D N A复合试剂， 而且需要具有 能够读出扩增核酸碎片信号的方法。这两个因素是免疫P C R 与E L I S A的不同之处， 也是将E L I S A改变成免疫P C R获得成 功应用的技术关键。通过开发有效的试剂、 建立分析方法以

19、 及提高检测体系的多功能性， 可以用I P C R技术对复杂的生物 基质进行多元免疫检测。对于免疫P C R的原理和详细介绍， 可参考德国多特蒙德大学C h r is to f M . N i e m e y e r 等人于2 0 0 5 年在( T r e n d s i n B i o t e c h n o lo g y ) 上发表的最新综述( 5 1 a 3 . 蛋白质微阵列芯片技术: 蛋白质微阵列芯片技术是继 基因芯片技术之后作为基因芯片的补充而发展起来的。和基 因芯片相似， 它在固相支持物表面高密度排列探针蛋白或杭 1 0 7 万方数据 综述与进展 J M e d R e s ,

20、F e b 2 0 0 8 , V o l . 3 7 N o . 2 体点阵， 可特异地捕获样品中的分子， 然后用激光扫描系统或 C C D ( 电 感偶合器件) 获取数组像， 最后用专门的计算机软件 进行图像分析、 结果定量和解释。纽约R o c h e s t e r 大学生物化 学家、 蛋白质微阵列芯片的开创者P h i z i c h y 指出， 蛋白质微阵 列可能有一甚至比D N A芯片更有利的优点， 如高通、 自动化、 灵敏度高和可用于多元分析等。 蛋白质微阵列芯片可采用硝化纤维、 P V D F 膜、 硅树脂、 玻 璃和塑料等材料作为载体， 其中玻璃是最常使用的载体平台， 利用

21、密集的点阵可以 在一个载玻片上同步检测多达几十甚至 更多个不同样品， 这些由高密度组成的点阵可以适合于高通 量样品检测， 并且比通常的9 6 孔板筛选具有更高的效率， 还 能更加节约昂贵的检测试剂。对玻璃表面可以采用多种不同 化学修饰方法进行处理( 如聚赖氮酸修饰法等) ， 以便共价结 合抗体蛋白。为了在固定支持物上固定具有特异生物活性的 单克隆抗体蛋白并保持其空间构象和活性， 目前可采用2 种 重要的方法达到该目的: 使用聚丙烯酞胺凝胶可以吸附 4 0 0 0 k D a 大小的蛋白 质分子， 可有效保持蛋白质原有功能， 但 有反应速率低和制备过程复杂等缺点; 通过化学键牢固地 将蛋白固定于

22、固体支持物上， 配合使用多种高精尖先进仪器。 例如， 预先用含乙醛的特殊试剂处理载玻片， 用高精确印记蛋 白的机械手点纳升量体积的蛋白质于载玻片上( 点阵密度可 达1 6 0 0 点 / c m ) ， 再用牛血清蛋白( B S A ) 处理载玻片表面， 然 后用 N , N 一 玻泊酞胺基碳酸盐溶液活化B S A的赖氨酸、 谷氨 酸残基， 使其易与印记蛋白的表面胺作用形成共价服连接或 酞胺连接， 印记的小分子则可在载玻片 B S A单分子层保持立 体构象， 而后可与溶液中的大分子起反应。最后， 需要对表面 进行B S A缓冲液封闭处理， 以封闭阵列上的醛基， 并在阵列 上形成B S A分子层

23、， 减少以后步骤中其他蛋白的非特异性结 合。目前， 对于吸附到蛋白微阵列芯片表面的靶蛋白的检测 主要有两种方法: 一种是直接检测法， 通过利用质谱技术可以 直接分析靶蛋白的分子量和相对含量。另一种为蛋白质标记 法， 样品中的蛋白质预先用荧光物质或放射性核素标记， 结合 到微阵列上的蛋白质会发出特定的信号。使用相应的照应的 照相技术或激光扫描技术对信号进行检测， 再经过相关的软 件分析， 即可获得相关的生物学信息。 2 0 0 0 年， 哈佛大学的 M a c B e a t h 成功制备了1 0 8 0 0点的蛋 白微点阵， 并研究了这种微点阵蛋白的多项生物学功能， 包括 蛋白与蛋白的相互作用

24、， 蛋白酶底物识别及小分子蛋白靶鉴 定等， 认为应用蛋白微点阵进行高通量表达蛋白筛选和功能 鉴定的研究是切实可行的。 2 0 0 3 年德国柏林马克一 普朗克分 子基因研究所的P h i li p p A n g e n e n d t 及其同事将一种新型的多 元定点技术( m u l ti p l e s p o t t i n g te c h n o l o g y , M I S T ) 引人蛋白 微阵 列芯片中。 他们使用了高精确机器手( g A r r a y s p o t t i n g ro b o t ) 以每针1 6 个点的取样方式在聚赖氨酸处理的载玻片上进行 标样， 每

25、个点间隔1 . l m m， 形成一个 1 6 x 1 6 的密集点阵。在 经过一系列准备步骤后， 用S c a n A r r a y 4 0 0 0 型扫描仪进行样品 扫描， 辅助以 相关软件对信号进行数据处理。这种新的技术 1 0 8 不仅证明了蛋白微芯片分析具有很高的精度、 灵敏度、 数据稳 定性和高通量筛选能力， 而且能够使每个点阵所需的样品少 至0 . 1 9 - 0 . 6 n 1 , 2 0 0 4 年德国慕尼黑 L e h r s t u h l 应用物理与纳 米科学中心的K e r a t i n B l a n k 及其同事报道了一种新的双芯片 蛋白微阵列技术在多元免疫分

26、析中的应用。它克服了传统夹 心式分析中交错反应存在技术困难的缺陷， 这种平台由两个 阵列芯片组成， 一个用于捕捉抗体， 另一个阵列上附载有标记 了荧光的抗体作为参比， 由此可实现样品之间的交错反应， 不 产生任何的失真信号。其动力学测量范围和样品探测下限浓 度和其他类型的多元夹心式免疫分析相当。 4 . 量子点技术: 量子点技术( q u a n t u m d o t s , Q D ) 又可称为 半导体纳米微晶 体( s e m i c o n d u c t o r n a n o c ry s t a l ) , 是一种由II- N族或I一V族元素组成的稳定的、 溶于水的、 尺寸在2-

27、 2 0 n m之间的纳米晶粒。目前研究较多的是C d S , C d S e , C d T e , Z n S 等。作为一种最新型的荧光材料， 与传统的有机染料分 子相比量子点确实具有多种优势。其中最大的优点在于有丰 富的颜色。 单一种类的纳米半导体材料就能够按尺寸变化产 生一个发光波长不同的、 颜色分明的标志物家族， 这是染料分 子根本无法实现的。此外， 它激发光谱宽， 且连续分布， 而发 射光谱单色性好， 且颜色可调， 并够承受多次的激发和光发 射， 有持久的稳定性。因此， 这些优异的光学性质使得量子点 在生物化学、 分子生物学、 细胞生物学、 基因组学、 蛋白质组 学、 药物筛选、

28、生物大分子相互作用等研究中有广阔应用前 景。 2 0 0 4 年， 美国海军研究实验室分子生物科学和工程中心 与光学部的E l l e n R . G o ld m a n 及其同事报道了用4 种颜色的 量子点荧光试剂标记特定抗体， 并针对4种蛋白质毒素进行 了同步多元免疫分析。这种量子点是以C d S e 为核， Z n S 为 壳， 表面再搜盖二氢硫辛酸， 4 种不同的量子点的最大发射波 长分别为5 1 0 , 5 5 5 , 5 9 0 和6 1 0 n m ， 然后用这4 种不同的量子点 分别对四种抗毒素抗体进行标记。然后将浓度为 2 . 5 1 0 p t g / m l 范围的不同

29、扰体防于不透明的白色微孔板( m a x - i s o r b , n u n c ) 中， 4 下密封放置一夜。然后进行一系列的分离 和处理， 最后采用t e c a n s a f i r e p l a t e r e a d e r 对发光信号进行检 测和数据分析。用这种量子点技术可以很好地对4 种生物毒 家一 抗体相互作用进行检测， 如果进行改进， 还可以对6 个以 上的多个样品进行同步分析。但这种方法在进行交错反应 时， 还存在技术困难。因此要将这种技术提高筛选通量， 还有 待对反应条件、 抗体试剂做进一步优化研究。 5 . 其他: 2 0 0 6 年3 月， 美国斯坦福大学的J

30、 e ff r e y B H T o k 及其同事报道了使用一种新型的金属纳米丝作为多元免疫分 析的平台， 建立了一套用于探测恐怖袭击可能使用的致命病 毒的传感器装置。他们使用经过精确处理的纳米丝作为基 质， 来进行夹心式免疫分析。这种纳米丝是在多孔的氧化铝 模板上， 用电子沉积法对不同金属进行次微米级压条而成。 其原理为: 用金、 银两种金属通过不同的原子排列顺序组成一 个类似于条形码的纳米丝， 直径2 5 0 n m ， 长度6 0 w m ， 把镍片段 万方数据 医学研究杂志2 0 0 8 年2月第3 7 卷第 2期 综述与进展 电镀在纳米丝的两端， 然后再每个纳米丝上进行通常的夹心

31、式免疫分析反应， 通过对发射荧光的信号检测可以对这种类 似条形码的标记信号进行快速确认， 扫描的荧光图像经过分 析处理可以提供抗体/ 纳米丝结合程度， 以 及荧光团标记的抗 原目标的重要信息， 从而可以对不同的待测生物毒素进行同 步检测分析。这种新构建的分析平台同样在微小的反应体积 内就可实现， 在未来的新型多元免疫分析中具有很大的发展 潜力。 多元免疫分析是一项融汇了多个学科的高新技术， 它所 展示的超乎想象的检测能力为现代生物医学领域的多种基础 研究、 技术开发提供了可靠的技术支持。 参考文献 1 Y o n X M , Z h o n g WW, T a n g A J , a l .

32、M u l t i p l e x e d fl o w c y t o m e t r i e i m m u n o a s s a y f o r i n fl u e n z a v i r u s d e t e c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n . A n a l C h e m, 2 0 0 5 , 7 7 . 7 6 7 3一 7 6 7 8 2 Z h a o X W, L iu Z B , Y a n g H , e t _ a l . U n if o r m l y c o l o ri z e d b e a

33、d s f o r m u l - t i p l e x i m m u n o a s s a y . C h e m M a t e r , 2 0 0 6 , 1 8 : 2 4 4 3 一 2 4 4 9 3 N o l a n J P , M a n d y F . M u lt i p l e x e d a n d m i c ro p a r t i c l e 一 b a s e d a n a l y s e s : q u a n t i t a t i v e to o l s f o r t h e l a r g e 一 s c a le a n a l y s

34、is o f b i o l o g ic a l s y s t e m s . C y t o m e t ry P a rt A , 2 0 0 6 , 6 9 A . 3 1 8 一 3 2 5 4 B e r s o n S A , Y a lo w R S . Q u a n t i t a t i v e a s p e c t s o f t h e r e a c t io n b e t w e e n i n s u l i n a n d i n s u l i n 一 b i n d i n g a n t i b o d y . J C l i n I n v e

35、s t , 1 9 5 9 , 3 8 : 1 9 9 6 一2 01 6 5 尹东光， 贺佑丰， 刘一兵， 等， 标记免疫分析技术的发展点评. 标 记免疫分析与临床， 2 0 0 3 , 1 0 ( 1 ) : 4 0 - 4 2 ( 收稿: 2 0 0 6 - . 1 1 一 2 4 ) 浙江省2 0 0 6 年医药卫生科研进展 余金牛 一、 基础医学研究 1 . 生物人工肝用细胞源与混合型人工肝的研究: 浙江大 学医学院附属第一医院为解决生物人工肝的瓶颈即肝细胞源 的问题， 在国内率先建立四步灌流法分离肝细胞的新方法， 使 新鲜分离的肝细胞活率和得率得到了显著提高， 开辟了为人 工肝及细

36、胞生物学研究提供高质量肝细胞的新途径。利用分 子生物学方法建立了国内第 1 个来源于正常人肝的永生化肝 细胞系H e p L L ， 该细胞系具有原代肝细胞类似的形态学特征 和生物学功能; 动物实验表明， 脾内移植的H e p L L 细胞不仅能 发挥肝细胞功能， 还能向肝脏移行， 参与和促进了部分肝切除 裸鼠的肝脏再生。用该技术目 前又构建了2 株人永生化肝细 胞和3 株猪永生化肝细胞， 不仅为生物人工肝和肝细胞移植 提供了廉价易得且安全可靠的肝细胞源， 也为体外药物筛选 提供了新的生物学模型。构建了新型生物人工肝装置， 以猪 暴发性肝衰竭为实验模型， 进行了生物人工肝治疗的临床前 评价，

37、结果表明安全、 有效， 明显延长动物存活时间和提高存 活率。非生物人工肝和生物人工肝相结合， 构建了一种具有 自主知识产权的新型混合型人工肝支持系统， 利用新鲜分离 的猪肝细胞治疗慢性重型肝炎肝衰竭1 5 例， 取得了较好的临 床疗效， 且无明显不良反应。建立了肝衰竭治疗的实验和临 床新方法， 具有巨大的临床应用前景。 2 . L e b e r 遗传性视神经病变遗传性状研究: 温州医学院眼 视光学院在全国范围内收集了2 6 3 个 L e b e r 遗传性视神经病 变( L H O N ) 家系， 根据家系临床特征分析我国大陆 L H O N的 各种突变的遗传特性， 包括发病率、 男女发病

38、比例及发病年龄 作者单位: 3 1 0 0 1 3 杭州， 浙江省医学科学院 等临床特征， 为临床诊断和治疗提供了依据基础。应用 P C R , 测序和限制酶酶切方法， 对收集的全部家系进行了3 个L H O N 相关线粒体原发位点的检测工作， 并进一步利用2 4对引物对 其中1 0 0 余个家系进行了线粒体全基因测序工作和线粒体 t R N A功能分析， 分析线粒体其他位点上的突变对于原发突变 的调控作用。发现T一些家系存在如1 5 9 5 1 , 4 4 3 5 , 1 1 6 9 6 , 3 4 9 7 , 1 0 0 5 9 等位点上的继发突变， 通过进一步分析和研究， 证 明了这些继

39、发突变明显改变了其 L H O N的表型， 包括发病率、 发病年龄等。还发现继发突变中A 4 4 3 5 G突变导致t R N A M e t 的改变; 1 5 9 5 1 位点上的继发突变导致 t R N A T h r 的改变， 这些 继发突变均通过改变 t R N A的功能和稳定性， 从而加重了 L H O N原发位点的突变程度， 使得临床发病率等明显增高。 3幽门螺杆菌( H p ) 毒力和致病性的研究: 浙江大学医学 院附属邵逸夫医院等对胃肠道疾病的致病作用、 胃肠外疾病 的 致病性及幽门 螺杆菌( H p ) 的耐药机制和耐药性逆转三方 面作了深人的探讨， 较全面完整地揭示了H p

40、 的毒力、 致病性 和耐药性， 有关慢性H p 感染对胃 勃膜病理变化影响的前瞻性 研究、 H p 膜耐药机制和耐药性逆转的研究均属国内首创， 为 胃癌的发病学和预防研究提供了前提条件， 为胃癌发生的阻 断治疗莫定了基础。该研究结果对降低溃疡复发率、 根治演 疡病、 防治肝性脑病、 降低肝硬化病人的病死率具有十分重要 的价值. 并为治疗耐药H p 感染提 供了重要的实验依据。 4 ， 血管化预成组织工程肌骨瓣修复下领复合缺损的实验 研究: 浙江大学医学院附属第一医院通过组织工程技术在动 物体内预制带血管蒂的骨与软组织复合组织瓣， 了解预制组 织瓣转移后组织学的改变和愈合方式， 寻求最佳的转移方法 修复面领组织缺损， 控制复合组织瓣内骨的形成和形态改变， 1 0 9 万方数据