大鼠肝缺血再灌注损伤Fos和NOS在脑组织的表达.pdf

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1、大鼠肝缺血再灌注损伤F o s和N O S在脑组织的表达 陈胜国*,甘子明 ,王旭林 ( 新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室, 新疆 乌鲁木齐 8 3 0 0 5 4) 摘要:目的: 观察肝缺血再灌注损伤(H I R I) 过程中脑组织中F o s和一氧化氮合酶(NO S) 的变化, 探讨两者在 脑组织不同部位的改变及可能的作用。方法: 建立肝缺血再灌注( I/R) 损伤动物模型, 分为对照组、 缺血3 0m i n组 ( I组) 、 缺血3 0m i n再灌注组(I/R组) ,I/R组又分为再灌注后1h组(I/R1h) 、 再灌注后2h组(I/R2h) 、 再灌注 后4h组( I/R4h

2、) , 应用免疫组化法分别测定各组大鼠不同部位脑组织F o s和NO S的变化。结果: 肝缺血再灌注 损伤的不同时段可出现脑组织不同部位F o s和NO S改变, 尤其在再灌注后期表现明显。结论:H I R I状态下,F o s 和NO S在脑内参与了损伤过程。下丘脑中两者的变化在中枢调节作用中可能起着中介作用。 关键词: 肝; 缺血再灌注; 脑;F o s; 一氧化氮合酶 中图分类号:R - 3 3 2;R 3 2 2. 8 1 文献标识码:A 文章编号: 1 0 0 9 - 5 5 5 1(2 0 0 5)0 4 - 0 3 3 3 - 0 3 T h ee x p r e s s i o

3、 no fF O Sp r o t e i na n dN O S i nb r a i nf o l l o w i n g l i v e r i s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y i nr a t s C H E NS h e n g - g u o,G A NZ i - m i n g,WA N GX u - l i n (D e p a r t m e n t o fH u m a nA n a t o m y,X i n j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t y, U r u

4、m q i8 3 0 0 5 4,C h i n a) A b s t r a c t:O b j e c t i v e:T oo b s e r v et h ec h a n g e so fn i t r i co x i d es y n t h a s e(NO S)a n df o sp r o t e i ni ni n j u r i e d b r a i nf o l l o w i n gl i v e r i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r ya n de v a l u a t e t h ec o n

5、 t r i b u t i o no fNO Sa n dc - f o sp r o t e i nt o b r a i nt i s s u ee f f e c t .M e t h o d s:A m o d e lo fl i v e ri s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r yw a se s t a b l i s h e db yi m i t a t i o n. T h ec o n t e n t so fNO Sa n dc - f o sp r o t e i n i nb r a i nt i s s u

6、 e i n c l u d i n gc o r t e xh i p p o c a m p u sa n dh y p o t h a l a m u s r e - g i o n sw e r ee x a m i n e d i n d i v i d u a l l yb y i mm u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e f o l l o w i n gs h a mo p e r a t i o n(g r o u p1) , i s c h e m i a3 0m i nw i t h o u tr e p e

7、 r f u s i o n(g r o u p2) ,r e p e r f u s i o nf o l l o w i n gs c h e m i a3 0m i n(g r o u p3). 1h o u r r e p e r f u s i o nf o l l o w i n g i s c h e m i a3 0m i n(g r o u p4). 2h o u r r e p e r f u s i o nf o l l o w i n g i s c h e m i a3 0m i n(g r o u p5) a n d4h o u r r e p e r f u s

8、i o nf o l l o w i n g i s c h e m i a3 0m i n(g r o u p6). R e s u l t s:C o m p a r e dw i t hg r o u p 1,g r o u p 2a n d g r o u p 3,t h ec o n t e n t so fNO Sa n dc - f o sp r o t e i n i nb r a i n t i s s u e i n c l u d i n gc o r t e xh i p p o c a m p u s a n dh y p o t h a l a - m u sr e

9、 g i o n sw e r e l i t t l es t a t i s t i cs i g n i f i c a n c e,(P0. 0 5).T h e r ew a so b v i o u s l ys t a t i s t i cs i g n i f i c a n c eb e - t w e e ng r o u p 4a n df o r m e rg r o u p s,(P0. 0 5). C o n c l u s i o n:T h ed a t ao fNO Sa n dc - f o sp r o t e i n i nb r a i nt i s

10、 s u e i n c l u d i n gc o r t e xh i p p o - c a m p u sa n dh y p o t h a l a m u sr e g i o n sv a r yd e p e n d i n go nd i f f e r e n t t i m eo f l i v e r i s c h e m i a - r e p e r f u s i o ns p e c i a l l y, a f t e r r e p e r f u s i o n.NO Sa n dc - f o sp r o t e i na r e i n v o

11、l v e d i nb r a i nt i s s u e i n j u r yf o l l o w i n gr e p e r f u s i o no f i s c h e - m i a l i v e r . K e yw o r d s:l i v e r;i s c h e m i a;r e p e r f u s i o n;b r a i n;F o s;NO S 休克、 肝的大手术、 肝移植等常不可避免地引发 肝缺血和血流再通后肝损伤及全身多器官的功能障 碍 1。探 索 肝 缺 血 再 灌 注 损 伤 ( h e p a t i ci s c h e m i a

12、 r e p e r f u s i o n i n j u r y,H I R I,I /R) 及所并发的远隔脏器 损伤的机制, 寻找减少损伤及增加机体抗损伤的方法 是一项有待研究的课题。8 0年代初H I R I已引起人 们的关注, 蔡宏波等 2报道 H I R I还可引起肺、 肾、 心 等远隔脏器组织的形态结构及机能代谢改变, 并发现 其损伤主要发生在再灌注阶段。本实验探讨在H I R I 状态下, 脑内F o s和N O S表达的分布变化及相互关 系, 为临床研究脑保护作用提供形态学依据。 1 材料与方法 1. 1 实验动物 雄性W i s t a r大鼠4 8只( 新疆医科 大学动物

13、实验中心提供) , 体重2 0 02 5 0g。 333 新疆医科大学学报 J OUR NA LO FX I N J I ANG ME D I C A LUN I V E R S I T Y 2 0 0 5A p r ., 2 8(4) * 作者简介: 陈胜国(1 9 6 7-) , 男, 讲师, 硕士, 研究方向: 神经生物学。 1. 2 试 剂 免 疫 组 化 二 步 法 试 剂 盒 E l i V i s i o n TM,NO S 1(B AO - 0 3 6 0) 、c - f o s(R A B - 0 1 8 7) 、 A P E S(G L U - 0 0 4 7) 购置于福州

14、迈新生物技术开发 公司, 其中一抗、 二抗均为即用型。 1. 3 动物模型的复制与分组 4 8只大鼠, 随机分6 组: 对照组( 假手术组) 、 缺血3 0m i n组( I组) 、 缺血 3 0m i n再灌注组(I/R组) 、 缺血3 0m i n再灌注后1 h组(I/R1h组) 、 缺血3 0m i n再灌注后2h组(I/R 2h组) 、 缺血3 0m i n再灌注后4h组(I/R4h组) , 每组8只。术前1 2h禁食, 1%戊巴比妥钠(4 0m g/ k g ) 腹腔注射麻醉, 无创血管钳钳夹阻断肝门部, 造 成1 0 0%实质性肝缺血, 均阻断3 0m i n再去除血管 钳, 形成

15、再灌注, 分别取材。 1. 4 取材方法 深麻下, 经心脏灌注生理盐水1 0 0 m l和4%多聚甲醛液4 0 0m l。注毕取脑, 后固定2 h移入2 0%蔗糖液4过夜至沉底, 重新置于1 0% 福尔马林液固定, 分别取矢状面和冠状面切片( 片厚 5m) , 常规HE染色。 1. 5 免疫组化染色 应用免疫组化二步法试剂盒, 按说明进行操作过程。 1. 6 切片观察及结果判定 F o s阳性表达为细胞 胞核内呈现棕黄色颗粒, 阴性细胞为蓝染。NO S阳 性表达为细胞胞浆内呈现棕黄色颗粒, 阴性细胞为 蓝染。采用计算机图像系统分析皮质、 海马回及下 丘脑各6个视野( 目镜4 0) , 计数视野

16、阳性细胞率 ( 阳性细胞/视野内细胞总数) 。 1. 7 统计学处理 实验数据以均数标准差 ( -x s)表示, 经方差齐性检验及方差分析后行q检验。 检验水准 =0. 0 5. 2 结 果 脑皮质区、 海马回、 下丘脑各区再灌注1h便可 见大量强阳性表达的F o s蛋白和NO S, I/R2h时 明显增高, 且I/R2h和I/R4h时阳性细胞增加最 显著, 并呈持续状态( 表1、 表2) 。H I R I早期细胞水 肿, 后期有神经元坏死及胶质细胞增生, 脑组织各区 F o s蛋白和NO S在H I R I后的阳性表达呈现棕黄 色颗粒( 图1、 图2) 。 表1 F o s在脑组织不同部位的

17、表达( xs) 部 位对照组 I组I/R组I/R1h组I/R2h组I/R4h组 皮 质 2 8. 7 14. 4 32 9. 6 93. 0 92 7. 3 82. 3 86 1. 5 83. 6 58 5. 3 64. 3 88 9. 1 26. 2 9 海马回 2 2. 9 55. 9 12 2. 9 14. 3 52 4. 6 14. 9 35 5. 8 65. 9 67 6. 0 45. 7 97 6. 6 34. 4 8 下丘脑 1 7. 4 84. 4 61 6. 2 04. 7 61 6. 8 53. 5 87 0. 0 06. 2 08 3. 1 3+8. 6 38 5. 5

18、94. 8 6 注: 与I/R组及I/R2h组比较,P0. 0 5;与I/R1h组及I/R4h组比较,P0. 0 5 表2 N O S在脑组织的不同部位的表达( xs) 部 位对照组 I组I/R组I/R1h组I/R2h组I/R4h组 皮 质 2 1. 6 55. 0 12 6. 0 55. 0 72 9. 5 95. 4 06 1. 8 55. 9 08 7. 9 82. 8 18 8. 5 64. 9 3 海马回 1 4. 7 68. 6 51 7. 9 02. 0 91 9. 6 72. 2 23 1. 2 73. 2 97 4. 9 99. 6 77 8. 2 97. 6 6 下丘脑 1

19、 3. 0 46. 1 01 1. 8 84. 4 11 6. 3 94. 9 56 7. 4 36. 6 97 9. 2 26. 3 88 3. 2 04. 3 1 注: 同表1 图1 脑组织F o s在肝缺血再灌注 损伤后的阳性表达(1 0 0) 图2 脑组织NO S在肝缺血再灌注 损伤后的阳性表达(1 0 0) 3 讨论 H I R I期间, 脑各区F o s和NO S表达的各时程 变化基本一致, 提示在H I R I过程中两者变化密切 相关。H I R I早期F o s和NO S表达增高不明显, 可 以推测在此期间, 脑的功能障碍和形态变化是可逆 的。H I R I的12h间F o s

20、和NO S表达明显增高, 并呈持续状态, 表明肝缺血和形成再灌注损伤对脑 组织的影响在进一步加深。而下丘脑的明显变化说 明其对应激的中枢调节作用逐渐加强。所发挥的中 枢调节作用引起机体的抗损伤作用的增强, 使机体 处于损伤与抗损伤的相持阶段变化。可能随着肝缺 血再灌注后期损伤的加重, 下丘脑的调节作用逐渐 不明显。 肝缺血再灌注损伤中、 后期, 下丘脑的阳性核团 表达在再灌注后1h最为强烈, 可能是由于在肝的 缺血再灌注损伤形成对机体其它脏器损伤时, 下丘 脑接受来自内脏神经的传导信号, 从而形成该部位 的高表达,( 下转3 3 8页) 433 新疆医科大学学报 J OUR NA LO FX

21、I N J I ANG ME D I C A LUN I V E R S I T Y 2 0 0 5A p r ., 2 8(4) 的p 5 3蛋白不能引起增殖的细胞停滞或凋亡。细胞 内受损或错配的D NA就不能被修复或清除, 从而 导致体内突变的细胞增多, 成为生长失控癌细胞的 前身。本实验结果显示, 正常胚胎神经上皮和周围 间充质细胞内p 5 3mR NA含量随着神经管的发育 而增加, 于C 8组达到最高值, 接着又逐渐减少, 于 C 2 4组降至最低点, 而后有所回升。此现象与神经 管形成过程中的细胞凋亡规律基本一致。说明p 5 3 表达参与胚胎细胞的程序性细胞死亡过程。高温处 理后2h

22、胚胎神经上皮和周围间充质细胞内p 5 3 mR NA含量即开始增加, 但不如高温后期增加显 著。说明高温不仅参与早期神经管的形成, 而且能 通过干扰p 5 3的晚期表达, 影响神经管的后期分化。 这是高温导致NT D的另一重要途径。 参考文献: 1 Z h i v o t o v s k yB,K r o e m e rG.Ap o p t o s i sa n dg e n o m i c i n s t a b i l i - t y J.N a tR e vM o lC e l lB i o l,2 0 0 4,5(9) :7 5 2 - 7 6 2. 2 A n d r e w H,W

23、 y l l i e .D e a t hg e t sab r a k eJ.N a t u r e,1 9 9 4, 3 6 9:2 7 2 - 2 7 3. 3 D i s t e l h o r s tCW.R e c e n ti n s i g h t si n t ot h em e c h a n i s mo fg l u - c o c o r t i c o s t e r o i d - i n d u c e d a p o p t o s i sJ.C e l l D e a t h D i f f e r, 2 0 0 2,9(1) :6 - 1 9. 4 T s

24、 u j i m o t oY.M o l e c u l a rb i o l o g yo f c e l l d e a t hJ. G a nT oK a - g a k uR y o h o,1 9 9 4,2 1(5) :5 9 1 - 5 9 5. 5 WuX,D e n gY.B a xa n dB H 3 - d o m a i n - o n l yp r o t e i n si np 5 3 - m e d i a t e da p o p t o s i sJ. F r o n tB i o s c i,2 0 0 2,7:1 5 1 - 1 5 6. 6 I g n

25、 e yF H,K r a mm e rP H.D e a t ha n da n t i - d e a t h:t u m o u rr e - s i s t a n c e t oa p o p t o s i sJ.N a tR e vC a n c e r,2 0 0 2,2(4) :2 7 7 - 2 8 8. 7 G u c h e l e a rH J,V e r m e sA.A p o p t o s i s:m o l e c u l a rm e c h a n i s m s a n di m p l i c a t i o n sf o rc a n c e rc

26、 h e m t h e r a p yJ.P h a r m W o r l d S c i,1 9 9 7,1 9(3) :1 1 9 - 1 2 5. 8 S a v i l l J .A p o p t o s i sa n dk i d n e yJ. JAmS o cN e p h r o l,1 9 9 4,5 (1) :1 2 - 2 1. 9 H a s sR. R e t r o d i f f e r e n t i a t i o na n dc e l ld e a t hJ. C r i tR e vO n - c o g,1 9 9 4,5(4) : 3 5 9

27、- 3 7 1. 1 0 H i p f n e rD R,C o h e nS M. C o n n e c t i n gp r o l i f e r a t i o na n da p o p - t o s i s i nd e v e l o p m e n ta n dd i s e a s eJ.N a tR e vM o lC e l lB i o l, 2 0 0 4,5(1 0) :8 0 5 - 8 1 5. 1 1 V e r m e u l e nK,B e r n e m a nZ N,V a nB o c k s t a e l eD R. C e l l c

28、y c l e a n da p o p t o s i sJ. C e l lP r o l i f,2 0 0 3,3 6(3) :1 6 5 - 1 7 5. 1 2 C o u i l l a r dM,G u i l l a u m eR,T a n j iN. c - m y c - i n d u c e da p o p t o s i s i np o l y c y s t i ck i d n e yd i s e a s e i s i n d e p e n d e n t o fF a s L/F a s i n t e r - a c t i o nJ. C a

29、n c e rR e s,2 0 0 2,6 2(8) :2 2 1 0 - 2 2 1 4. 1 3 M a c l e a nKH,K e l l e rU B,R o d r i g u e z - G a l i n d oC. c - m y ca u g - m e n t sg a mm ai r r a d i a t i o n - i n d u c e da p o p t o s i sb ys u p p r e s s i n g B c l - X LJ.M o lC e l lB i o l,2 0 0 3,2 3(2 0) :7 2 5 6 - 7 2 7 0

30、. 1 4 S e a r sR C,N e v i n sJ R. S i g n a l i n gn e t w o r k st h a t l i n kc e l lp r o - l i f e r a t i o na n dc e l lf a t eJ.JB i o lC h e m,2 0 0 2,2 7 7(1 4) : 1 1 6 1 7 - 1 1 6 2 0. 1 5 M e e kDW. T h ep 5 3r e s p o n s e t oD NAd a m a g eJ. D NAR e - p a i r,2 0 0 4,3(8 - 9) :1 0 4

31、 9 - 1 0 5 6. 1 6 Y o o nK,S m a r tR C. C/E B P a l p h a i saD NAd a m a g e - i n d u c i b l e p 5 3 - r e g u l a t e dm e d i a t o ro f t h eG 1c h e c k p o i n t i nk e r a t i n o c y t e s J.M o lC e l lB i o l,2 0 0 4,2 4(2 4) :1 0 6 5 0 - 1 0 6 6 0. 收稿日期:2 0 0 5 - 0 1 - 1 5 000000000000

32、0000000000000000000000000000000000000 ( 上接3 3 4页) 进一步在下丘脑合成保护机体抗损伤的相关激素, 产生上行大脑皮质的有关信息介质, 发挥其中枢整 合调节作用。但在再灌注后期的24h期间,F o s 和NO S的增幅不再明显。提示在这种状况下, 尤 其是早期脑内的NO S阳性神经元活动增强, 除了 产生NO S和NO, 还通过NO作为第二信使诱导 F O S蛋白表达, 参与了脑对机体的应激反应的调 节, 促使脑内多种神经递质释放增加, 并促使机体调 动有利于脑组织在缺氧缺血情况下的各种积极因 素 3, 有效地清除脑内堆积的有害毒性活性物质 (C a

33、 2+、 氧自由基和兴奋性氨基酸等) , 从而保护脑 未受损神经元和使受到损害的神经元得到形态和功 能的改善。 以往研究已经证实,F o s对下丘脑室旁核的精 氨酸加压素(AV P) 基因和促肾上腺皮质激素释放 素(C RH) 基因的表达有重要调节作用, 并且NO发 挥的中介作用与F o s表达密切相关 4。王兴友等5 报道, 应激性损伤所致急性肺损伤与下丘脑功能状 态关系密切, 在A L I后12h下丘脑F o s出现高表 达, 应用氯丙嗪后, 在A L I的症状有所缓解的同时, 下丘脑中F o s呈低表达。针对肝缺血再灌注后形成 的损伤, 应用抗应激性药物治疗是否能有效控制损 伤, 有待于

34、进一步研究证实。 参考文献: 1 华贇鹏.肝缺血再灌注损伤及其防治J.医学综述,2 0 0 1,7 (2) :1 1 1. 2 蔡宏波, 吕新生, 王志明, 等.肝门阻断对远隔脏器的影响J. 中国普通外科杂志,1 9 9 6,5(5) :2 5 7 - 2 6 0. 3 B e a s l e yT C,B a r iF,T h o r eC,e t a l . C e r e b r a l i s c h e m i c/r e p e r - f u s i o n i n c r e a s e se n d o t h e l i a ln i t r i co x i d es y

35、 n t h a s el e v e l sb ya n i n d o m e t h a c i n - s e n s i t i v e m e c h a n i s mJ.C e r e B l o o d F l o w M e t a b,1 9 9 8,1 8 9 1) :8 8 - 9 6. 4 C o s t aA,T r a i n e rP,B e s s e rM,e t a l . N i t r i co x i d em o d u l a t e s t h e r e l e a s eo fc o r t i c o t r o p i n - r e

36、 l e a s i n gh o m o n ef r o mt h er a th y p o - t h a l a m u s i nv i t r oJ. B r a i nR e s,1 9 9 3,6 0 5(2) :1 8 7- 1 9 0. 5 王兴友, 钱桂生, 毛宝龄.急性肺损伤大鼠下丘脑内c - f o s基因 的表达J.第三军医大学学报,1 9 9 7,1 9(6) :2 0 1 - 2 0 4. 收稿日期:2 0 0 5 - 0 1 - 1 5 833 新疆医科大学学报 J OUR NA LO FX I N J I ANG ME D I C A LUN I V E R S I T Y 2 0 0 5A p r ., 2 8(4)