大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定.pdf

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1、查堕堕笪丛茎查! 墅堡! 旦蔓望鲞箜堡塑丛型堕曼堂苎苎璺坐些鱼坠地竺型堕塑! ! 尘! ! 坚! ! 垡：望! 塑! ：1 2 3 9 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养 纯化与鉴定* 卢仁荣一陈良龙 江琼 郭进建 基础研究 摘要】 目的：探讨骨髓间充质干细胞( B M S C s ) 体外获取及培养增殖的方法并鉴定。方法：用密度 梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化培养大鼠B M S C s ，测定生长曲线，流式细胞仪鉴定，免疫细胞化学 检测。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠B M S C s ，P 2 。代细胞生长曲线基本一致， 增值能力强，呈均一成纤维样细胞，P 3 代以后细

2、胞均一地表达细胞表面抗原C D 4 4 、C D 9 0 ，不表达C D 3 4 ， 弱表达C D I l b e ，细胞表达C o n n e x i n 4 3 。结论：本实验建立了一种体外稳定培养扩增大鼠B M S C s 的方法， 培养的细胞成分单一，适用于对B M S C s 进一步的应用研究。 ( 关键词】骨髓间充质干细胞；连接蛋白4 3 ；动物实验，大鼠 中图分类号】Q 8 1 3 1 文献标识码 A 文章编号】1 0 0 7 5 0 6 2 ( 2 0 0 8 ) 0 4 2 3 9 0 4 I s o l a t i o n - c u l t u r e 。p u r i

3、f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fr a tb o n em e s e n c h y m a ls t e mc e l l s L UR e w o n g ，C H E N L i a n g l o n g ，J I A N G 增，G U OJ i n j i a n D e p a r t m e n to fC a r d i o l o g y ，A f f i l i a t e dS a n m i n gF i r s tH o s p i t a lo f ，l 扣n M e d i c a lU n

4、i v e r s i t y 。S a n m i n g ，F 咖n3 6 5 0 0 0 ，C h i n a 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e ：T oe x p l o r ea ni nv i t r op r a c t i c a lm e t h o do ft h ei s o l a t i o n ，c u l t u r ea n dp u r i f i c a t i o no fb o n e m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( B M S C s ) f r o mt h eb

5、o n em a 肿wo ft h ea d u l tr a t s ，a n dt oi d e n t i f yt h e m M e t h o d ：B M S C sw e r e i s o l a t e dw i t hd e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o na n da d h e r e n tc u l t u r ef r o mt h eb o n en l a l T O wo ft h ey o u n gS Dr a t s C C K - 8 r e a g e n tW a Su s

6、e dt od e t e r m i n et h eg r o w t hc u r v e L i g h tm i c r o s c o p e sw e r eu s e dt Os t u d yt h em o r p h o l o g i cR ，a t u r 屯8 F l o w c y t o m e t r yw 曲a p p l i e dt oi d e n t i f yt h ec e l l s I m m u n o c y t o c h e m i s t r yt e c h n i q u ew a ge m p l o y e dt Oe x

7、a m i n et h ec e l la n t i g e n s o fc o n n e x i n 4 3 R e s u l t ：T h ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o nc o m b i n e da d h e r e n tc u l t u r eC a ni s o l a t ea n dp u r i f yB M S C s e f f i c i e n t l y T h es i m i l a rg r o w t hc u r v e so fp a s s a g e 2

8、 、4a n d6w e r ee x h i b i t i n gal a r g ee x p a n s i v ep o t e n t i a la n dt h et y p i c a l f i b m b l a s t - l i k em o r p h o l o g y T h eB M S C sa r eu n i f o r m l ye x p r e s s i n gC I M 4 ，C D g O ，a n dw e a H ye x p r e s s i n gC D llb c ，a n d n o te x p r e s s i n gC D

9、 3 4a f t e rp l I s s a g e3 C o n n e x i n 4 3a r ep o s i t i v ei nc e l l s C o n c l u s i o n ：A ni n v i t r om e t h o df o rt h e i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fB M S C sf r o mr a tb o n en H I n 口wh a sb e e ne s t a b l i s h e d T h ec u l t u r e dc e l l sw e r eo n

10、 l yc o m p o s e d o fu n d i f f e r e n t i a t e dB M S C s K e yw o r d s B o n em e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ；C o r m e x i n 4 3 ；A n i m a lL a b o r a t o r y ，r a t 目前在细胞性心肌成形术中，移植使用的细胞 包括骨骼肌成肌细胞，血管平滑肌细胞，造血干细胞 和骨髓间充质干细胞( b o n em e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ， B M S C s ) 五

11、J 。其中B M S C s 具有多潜能性、自体来源、 增生能力强和体外基因转染率高等优点而更适合于 临床应用。但骨髓中B M S C s 的含量非常少，必需在 基金项目：福建医科大学科研发展基金( F J G X Y 0 4 0 1 6 ) 作者单位：3 6 5 0 0 0 福建医科大学附属三明第一医院心内科( 卢仁 荣) 福建医科大学附属协和医院心内科福建省冠心病研究所( 陈良 龙江琼) 福建省人民医院心内科( 郭进建) 现工作单位：福建医科大学附属三明市第一医院心内科 通讯作者 体外分离纯化、培养扩增才能满足要求。本实验对 成体大鼠B M S C s 进行了分离、培养和免疫细胞化学 检测

12、，并对其细胞学特性、表型特征进行研究，为进 一步探讨B M S C s 在细胞性心肌成形术中的应用提 供基础。 资料与方法 S D 大鼠，体质量约1 5 0 1 8 0g ，雌雄不限，福建 医科大学实验动物中心提供。 淋巴细胞分离液( 华美) ，低糖型D M E M 干粉培 养基、新生牛血清( G I B C O ) ，胰蛋白酶( S i g m aU S A ) ， C C K - 8 试剂( D o j i n d o ) ，兔抗大鼠单抗C o n n e 【i n 4 3 万方数据 2 4 0 ：坚堕查筻塞盘查! 塑! 生! 旦箜! ! 鲞笙! 塑! 婴型堕鱼! 蔓i 型! 竺些些壁坠墅

13、! ! ! 空里i ! 垫苎! ! ! ! z ! 塑! ! ! 堂：望! 塑! ：兰 ( Z y m e d ) ，S P 免疫组化试剂盒( 北京中山) ，小鼠抗大 鼠单抗C D 4 4 P E 、C D 9 0 P E 、C D 3 4 一F I T C 和C D l l b c F I T C ，小鼠I g G l 一P E 、I g G 2 。- P E 、I g G I - F I T C 和I g G 2 。一F I T C ( B e c k m a nc o u l t e r ) 。流式细胞仪( C O U L T E RE P I C SX L 型) ，酶标仪( B i o

14、 R A D 型5 5 0 ) ，倒置生物显微镜 ( x s J D 2 ) ，C O ，恒温培养箱( 2 3 0 0 型S H E I L A B ) ，透 射电镜( 日立H u 1 2 A ) ，计算机显微成像系统 ( O l y m p u sP M I O S P ) 。 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化和扩 增取1 个月龄S D 大鼠，腹腔注射氯氨酮过度麻醉 致死，分离股骨、胫骨，用D M E M 培养基冲出骨髓， 吸管反复吹打成细胞悬液。加入等体积的1 0 7 7 g m E 淋巴细胞分离液20 0 0r p m 离心2 0m i n ，吸取中 间的白膜层，5m LD M E

15、 M 重悬浮，10 0 0r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，共2 次，用含1 2 N C S 的D M E M 调整成 2 l 驴c e l l s I I l I 洧核细胞培养液，接种于2 5m L 培养瓶 中，置于3 7 ，5 C 0 2 ，饱和湿度的培养箱中培养。 2 4h 首次换液，以后每3 。4d 换液一次，每日在倒置 显微镜下观察细胞的形态及生长情况。待细胞融合 8 0 时，用0 1 2 5 胰蛋白酶消化，1 ：2 3 传代。 细胞生长曲线取生长良好的P 2 代细胞消化 制备单细胞悬液，以1 1 0 m L 接种于1 0 块9 6 孔 培养板，每板接种3 孔，每孔0 1

16、m L ，置于培养箱中 培养。另准备几个孔接种已知数量的活细胞进行标 定。从次日起每日随机选取1 个培养板，每孔加入 1 0 止的C C K 8 后放人培养箱培养1 4h ，用酶标仪 在4 5 0n m 波长处测定吸光度，参比波长6 3 0n m ，用 接种在孔中已知数量活细胞所测得的吸光度制备一 个表达曲线。取各时相点吸光度的平均值，以时间 ( d ) 为横坐标，吸光度( 表示细胞相对数量) 为纵坐 标，绘制生长曲线。同法培养并绘制P 4 、P 6 代 B M S C s 的生长曲线。计算群体倍增时间T D ，根据对 数生长期生长曲线始末两点之间A 值的变化，按照 以下公式计算细胞相对A 值

17、的倍增时间：D T = t 1 9 2 ( 1 9 N t l g N o ) ，其中t 代表细胞培养时间，N t 代 表培养后的吸光度，N o 代表培养前吸光度。 细胞表面标记物的检测取达到8 0 9 0 融合后的P 3 代细胞，用0 1 2 5 胰蛋白酶消化，P B S 洗涤1 2 遍，用P B S 制成2 l O 个细胞m L 的悬 液，经3 0 0 目的尼龙网滤过。将细胞悬液分装至8 只1 5m L 的E P 管中，分别加入C D 9 0 P E 、C D 3 4 F I T C 、C D 4 4 P E 、C D l l b c F I T C 及其同型对照各1 0 m ，3 7 下

18、避光反应1 5m i n ，P B S 冲洗2 遍后进行流 式细胞仪检测。每种抗体标记3 份细胞标本，取3 次测定的平均值。 透射电子显微镜观察取对数生长期的细胞， 用细胞刮刮下细胞，10 0 0r p m 离心1 0r a i n ，弃上清。 经前固定、漂洗、后固定、漂洗、脱水、浸透、包埋及聚 合等步骤，最后超薄切片机切7 0 8 0a m 的超薄切 片；经醋酸铀、柠檬酸铅分别染色5r a i n ，并蒸馏水水 洗，在日立H u 1 2 A 型透射电镜下观察并摄片。 B M S C s 的c o n n e x i n 4 3 抗原表达和图像分析将 P 2 和P 6 代细胞接种于预置盖玻片的

19、1 2 孔板，待细 胞长满后取出盖玻片，P B S 冲洗，4 多聚甲醛固定， 4 。C 过夜。参照试剂盒使用说明，进行免疫反应，一 抗为兔抗大鼠c o n n e x i n 4 3 ，1 ：1 0 0 ，P B S 反蓝后封片， 同时以P B S 作为一抗设置阴性对照。用计算机图 像分析系统，对P 2 、P 6 代2 组细胞爬片各随机抽取 l O 个不重叠视野进行观察、照相，采用I m a g i np l u s 4 5 软件分析各个免疫组化片的平均光密度值，比 较各组C o n n e x i n 4 3 蛋白的相对表达量。 统计学处理实验数据以均数土标准差( 牙 s ) 表示，用S P

20、 S S1 1 5 统计软件进行分析处理，组间 资料比较用t 检验，以P 0 0 5 ) 。 讨论 骨髓基质细胞是指许多种未经鉴定的细胞所组 B M S C s 含量很低，大约l O 万个单核细胞中含有1 个 B M S C s ，因此，建立成熟的B M S C s 体外分离、培养、纯 化和扩增的方法是利用B M S C s 进行广泛深入的研 究和临床应用的基础。作为移植用的种子细胞，细 胞的纯度越高越好。我们的实验采用联合运用密度 梯度离心和贴壁筛选法，获得的第三代细胞纯度达 到9 7 以上，体外仍有很强的增值能力，达到移植 要求。 在本实验的体外培养条件下B M S C s 经历了生 长缓

21、滞期、对数生长期和平台期，传代后细胞生长速 万方数据 2 4 2 ：垒堕查笪塑盘查! 塑! 笙! 旦笙! ! 鲞笙兰塑! ! 型煎垦! 型i 竺! 墼坐! ! 壁堕! 竺! 毁望i 篓! 塑! ! 趔z ! 塑! ! ! ! ! ：盈! 塑! ：! 度明显增快，在对数生长期，倍增时间为5 0h 。原代 培养需要9 1 4d 而传代后细胞仅需要3 6d 便能 再次传代，传5 代后B M S C s 细胞数可增加至1xl O s 以上。P i t t e n g e r 等H 1 分析了经过3 0 个世代的第1 2 代人B M S C s 核型，并没有发现染色体的畸变，所以 实现体外大量扩增B M

22、 S C s 并能保持它们的分化能 力是可能的，为今后体外大量扩增和临床应用奠定 了基础。研究发现外植的B M S C s 胞吸附于培养基 表面并形成集落的速度很慢，也即缓滞期，产生这种 情况的原因可能有以下几点：在外植初始时期细胞 正处于静息期；细胞需要克服外植应激；或细胞需经 过自身调节以适应体外培养条件。外植培养的骨髓 基质包含初始为休眠状态的小的细胞群，但随后就 会开始快速的增殖【5o 。因此，可能会有B M S C s 生成 的自分泌或旁分泌因子或在基质原位的基质组成成 分能够提供使细胞存活的信号1 。 目前，还没有用于鉴定的理想标志性分子或方 法可以识别B M S C s 。P i

23、 t t e n g e r 1 研究小组曾经对5 0 0 多个标本用7 0 多种抗体，也没有找到一特异性的标 记物( p e r s o n a lc o m m u n i c a t i o n ) 。一般是用多个表面标 记物联合鉴定，缺失相应的表面分子也有助于对 B M S C s 的鉴定。我们所培养的第三代细胞稳定、均 一地表达细胞表面抗原C D 4 4 、C D 9 0 ，不表达C D 3 4 ， 弱表达C D l l b c 。C D 4 4 、C D 9 0 是造血干细胞表面没 有的，加之表达阳性细胞率几乎是百分之百，说明所 分离培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞。 细胞连接通讯

24、是动物体内细胞通讯的主要方式 之一。其发挥细胞之间信息传递功能的结构基础是 细胞缝隙连接，而其主要结构成分是连接蛋白 ( c o n n e x i n ) 。缝隙连接蛋白是构成细胞膜上的蛋白 通道的基本结构，有利于细胞间信息传递，与细胞分 泌、增殖、分化相关o 。已有确切的证据表明， C o n n e x i n 4 3 是细胞间缝隙连接的蛋白通道o ，我们 的实验证实B M S C s 有c o n n e x i n 4 3 的表达，揭示 B M S C s 有分泌生长调节因子的能力，增殖能力强，分 化程度很低。P 2 、P 6 代B M S C s 的c o n n e x i n

25、4 3 蛋白的 表达无改变，细胞核浆比例大，核仁有多个，表明我 们所分离培养的细胞在有限的传代数内，细胞性状 稳定，是心肌细胞成形术中理想的种子细胞，有良好 的应用前景。 参考文献 K o hG Y ，l ( 1 u gM G ，S o o n p a aM H ，e ta 1 D i f f e r e n t i a t i o na n d l o n g - t e r ms u r v i v a lo fC 2 C 1 2m y o b l n s ts , f t si nh e a r t JC l i n I n v e s t ，1 9 9 3 ，9 2 ：1 5 4 8

26、- 1 5 5 4 N y 伊e nJ M ，J o v i n g eS ，B r e i t b a c hM ，e ta 1 B o n em a l T O W - d e r i v e dh e m a t o p o i e t i cc e l l sg e n e r a t ec a r d i o m y o c y t e sa tal o w f r e q u e n c yt h r o u g hc e l lf u s i o n ，b u tn o tt r a n s d i f f e r e n t i a t i o n N a tM e d ，2

27、0 0 4 ，1 0 ：4 9 4 5 0 1 H a k u n oD ，F u k u d aK ，M a k i n oS ，e ta 1 B o n em a r r o w d e r i v e dr e g e n e r a t e de a r d i o m y o c y t e s ( C M GC e l l s ) e x p r e s s f u n c t i o n a la d r e n e r g i ca n dm u s c a r i n i er e c e p t o r s C i r c u l a t i o n ， 2 0 0 2 。

28、1 0 5 ：3 8 0 3 8 6 P i t t e n g e rM F ，M a c k a yA M ，B e c kS C ，e ta 1 M u h i l i n e a g e p o t e n t i a lo fa d u l th u m a nm e s e n c h y m a lit e mc e l l s S c i e n c e ， 1 9 9 9 ，2 8 4 ：1 4 3 1 4 7 F f i e d e n s t e i nA J P r e c u r s o rc e H so fm e c h a n o c y t e s I n t

29、R e v C y t o l ，1 9 7 6 ，4 7 ：3 2 7 3 5 9 v a nd e nB o sC ，S i l v e r s t e t t e rS ，M u r p h yM ，e ta 1 p 2 1 ( c i p l ) r e s c u e 8h u m a nm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sf r o m a p o p t o s i si n d u c e db yl o w d e n s i t yc u l t u r e C e l lT h s u eR e s ， 1 9 9 8 ，2 9 3

30、：4 6 3 4 7 0 路艳蒙，傅文玉，朴英杰。等人骨髓间充质干细胞 的超微结构电子显微学报，2 0 0 2 ：1 8 2 1 B e y e rE C ，K i s f l e rJ ，P a u lD L ，e ta 1 A n t i s e r ad i r e c t e d a g a i n s tc o n n e x i n 4 3p o p t i d e sr e a c tw i t ha4 3 一k Dp r o t e i n l o c a l i z e dt og a pj u n c t i o n si nm y o c a r d i u ma n d

31、o t h e rt i s s u e s J C e l lB i o l ，1 9 8 9 ，1 0 8 ：5 9 5 6 0 5 ( 本文图1 ，2 ，5 ，6 ，7 见封三页) ( 2 0 0 7 1 1 2 0 收稿) 致作者 文后参考文献的著录规定 参考文献按G B T 7 7 1 4 - - 2 0 0 5 ( 文后参考文献著录规则 采用顺序编码制著录，依照其在正文中出现的先后顺序，用阿拉伯 数字连续编码，并将序号置于方括号内，在正文中用上角码标出，文献表中的序号与正文中的要一一对应。参考文献请选用 与文稿内容密切相关并经作者亲自阅读过的正式出版物，非正式出版物不在参考文献中列

32、出。避免引用摘要作为参考文献。 确需引用个人通讯时，可将通讯者姓名和通讯时间写在括号内插入正文相应处。参考文献中的作者，1 3 名全部列出，3 名以 上只列前3 名，后加“等”或其他与之相应的文字。外文期刊名称用缩写，以( I n d e xM e d i c u s ) 中的格式为准；中文期刊用全名。 参考文献须著录起止页码。 本刊编辑部 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 1 J 1 2 3 4 5 6 7 8 r L r L r L r L r L r L r L r L 万方数据 一i0 、叠- j 4 l I 、! 0 ，： 。 ： 、 j 。，j 。” ：r |

33、 。3j 。J _ ；、： 。 ， j j “一u 。! 。j ，- + ，以、 ! ，。 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定 f 正文见2 3 9 页1 。坠?1 堕?1 二二竺 “ u 、 1 图1 原代B M S C s 培养8 一l 相邻集蒋H 相融舟成H ，细胞呈纺锤形、梭肜、多角彤还打一种冉更强的折光忭的小嗣形细胞 图2 第 代B M S C s 培养4d 细胞形态早均的成纤堆状，小而侧的细胞盟# 减少。图68 M S C s 的C x 4 3 免疫细胞化学染 色( A E CH 色) ，棕红色阳h 物质主要在细胞浆表逃囤7 阴性对艇组免蛙细胞化学豪色( P B S 代替C

34、x 4 3 ) 细胞浆中无m 性物 质 灞鄹 阐鬻 图5 体外培养日髓舸充质千细胞的趟微结构 1 胞浆内的糖原颗粒( 白色箭头) 和相邻细胞问缝隙连接( 黑色箭卫) ，B a l - 2 0 0 n m 2 处于棚对活跃期的人鼠B M S C s 核* 小规 州，棱质t M ，胞质内细胞器中富( h 色箭头处为浒酶体) ，B a r - 2 1 x m ：3 处丁相对静止期的大鼠B M S C s 枝椭圆形，棱鹰 匕上胞 质内细胞器较少。H a 一2 “岬4 细胞装山的粗m 内质阿( 黑色柑箭头) 、缓粒体( 白也箭头) 梭相邻细胞问的紧崭连接( 黑也细箭 头) 。B a r = 2 0 0 n m 万方数据