小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因SHP和 Cyp7A1的动态改变.pdf

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1、福建医科大学学报 JF ujia nMe dU垃v 2 0 0 7No v e mb e r ， Vo l 4 1No6 4 9 5 小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因s H p 和C y P7A I 的动态改变 黄雄飞 2 ，陈良万 ， 刘念3，4， 黄文栋3 摘要: 目的 探讨小鼠肝脏70%切除术后再生早期， 核受体S H P 参与调控C y p 7 A I 基因表达的机制。 方 法 应用逆转录实时定量P C R检测野生型小鼠和F X R 一 / 一 小鼠肝脏70%切除术后l h 和6 h C y p 7 A I 基因和S H P 基因的表达. 结果2 组肝脏C y p 7 A I 基因表达

2、在术后 l h 和6 h 明显降低; S H P基因表达在术后 l h 显著上 升， 术后6 h 急剧下降。 结论 小鼠 肝脏70% 切除术后再生早期， 非依赖F X R的通路参与胆酸介导的C y P7A I 基因转录的抑制。S H P 可通过非F X R介导的途径参与调节C y P7A I 基因的表达。 关键词: 肝再生; 基因表达; 胆固醇7 一 二 经化酶; 法尼醇; 疾病模型， 动物 中图分类号: R3 2 2 ; R 6 5 7 . 3文献标识码: A文章编号: 1 6 7 2 一 4 1 9 4 ( 2 0 0 7 0 6 一 0 4 9 5 一 0 3 小异二聚体伴侣( s m

3、a l l h e t e r o d i m e r p a r t n e r ， S H P ) 是一种特殊的核受体， 它没有 D N A结合域， 主要表达在肝脏。S H P通过与其他核受体家族成 员的相互作用， 抑制核受体介导的转录活性川。保 持胆酸代谢平衡是维持小鼠肝脏正常再生所必需 的重要条件z1。 C y p 7 A I 基因编码经典胆酸合成途 径中的限速酶胆固醇 7 a- 经化酶( c h o l e s t e r o l 7 a - h y d r o x y l a s e ， C y p 7 A I ) ， 其调控主要在转录水平。 当核受体法呢醇X受体( f a r n

4、 e s o i dX r e c e p t o r ， F X R ) 被胆酸激活后， F X R上调 S H P的表达， S HP 继而与核受体肝脏相关同系物( l i v e r r e l a t e dh o m o - l o g u e ， L R H) 结合， 抑制 L R H转录激活C y p 7 A I 基 因的功能闭。F X R 一 S H P 一 L R H参与的通路是胆酸 介导的反馈抑制C y p 7 A I 基因表达的重要途径。笔 者以小鼠肝脏70%切除为动物模型， 探讨肝脏再生 的急性期， S H P是否通过上述途径参与调控 c yP7 A I 基因的表达。 1

5、 材料与方法 1 . 1 动物野生型小鼠C57 B L/6 N Cr( 美国N at in nal C a n c e r l n s t i t u t e ) ， F X R基因敲除( F X R 一 / 一 ) 小鼠 ( 美国B a y l o r 医学院) 。 1 . 2 试剂T R I 试剂、 澳氯丙烷( 美国Mo l e c u l a r R e s e a r c hC e n t e r 公司) ， 异丙醇、 二乙基焦磷酞胺 ( 美国S i g m a 公司) ， M一 ML V逆转录酶( 美国 I n - 收稿日 期: 2 0 0 7 一 0 6 一 2 5修回日期: 2

6、0 0 7 一 0 9 一 2 4 作者单位: 1 . 福建医科大学 附属协和医院胸心外科研究所， 福州 3 5 0 0 0 1 2 . 福建医科矢学 基础医学院病理学系， 福州 3 5 。 。 。 4 3 . D e p a r t m e n t o f G e n eR 昭u l a t i o na n dD r u gD i s c o v e r y ， C it y o f H o p e Bec k m a n R e s e a rc h I n s t i t u t e ，C A， 9 1 0 1 0，US A 4 . 吉林大学第一医院血液肿瘤科， 长春 1 3 。 。

7、2 1 作者简介: 黄雄飞( 1 9 70一) ， 女， 讲师， 福建医科大学2 。 。 4 级博士研 究生 通讯作者: 黄文栋， 陈良 万 vi tr ogen公司) ， 重组核糖核酸酶抑制剂( 美国Pr。 - me g a 公司) ， S Y B R G r e e nP C RMa s t e rMi x ( 美国 A p p l i e dBio s y s t e ms 公司) 。 1 . 3 仪器匀浆器( P T 一 MR 2 1 o o ， 美国L y o p h i l e r / p o l y t r o n 公司) ， 低温离心机( C S6 R ， 美国B e c k

8、ma n 公司) ， 分光光度计( 6 4 0 B ， 美国B e c k ma n公司) ， 实 时定量 P C R系统( 7 3 0 o S Y B R G r e e n ， 美国A p p l i e d B i o s y s t e m s 公司) 。 1 . 4 方法 1 . 4 . 1 模型制备野生型小鼠和 F X R基因敲除 ( F X R 一 / 一 ) 小鼠均以 C 5 7 B L / 6N C r 为杂交背景。 以1 2 ， 1 2 h 昼夜交替作息。 标准鼠类食物喂养， 饮 水不限。选择 8 一10周雄性小鼠， 每组 12 只。行 7 。 肠肝脏切除术小鼠肝脏左外叶、

9、 尾叶和中叶完全 切除， 保持胆囊完整。术后 l h 、 6h 分别处死小鼠， 收取肝脏， 液氮速冻后保存在一80 冰箱。 1 . 4 . 2 肝脏总 R N A抽提和 c D N A合成取肝组 织10o m g ， 在T R I 试剂中匀浆， 根据试剂盒方法抽 提R N A 。 取R N A3 拜 9 ， 以O l i g o d T为引物， 在反 应体系2 0 拜 L6 5预变性1 0 m i n 后， 加人S X F S 缓冲液， 0 . l m o l / LD T T ， 2 5m m o l / Ld N T P ， R n a - s i n 和MML V至反应体系3 om i

10、n ， 4 2，C l h 。 1 . 4 . 3 实时定量 P C R 应用快速实时定量 P C R 系统定量检测肝脏中C Y P 7 A I 和 S H Pm R N A表 达。使用的正向引物( F ) 和反向引物( R ) 包括: C Y P 7 AI ( F ) : C A A GAA C C T G T A C AT G A G G G A C C Y P 7 AI ( R ) : C AC T T C T T C A GA G G C T G C T T T C S HP ( F ) : G T C T T T C T G GA G C C T T GA G C T G S HP

11、( R ) : G T A G A G G C C A I ， G A GG A G GA T T C 任 acti n 作为内对照。 1 . 5 统计学处理使用t w o 一 t a i l e d s t u d e n f s t t e s t 进行统计学分析。 2 结果 2 . 1 小鼠肝脏 70%切除术后 lh 和6h ， 野生型小 万方数据 4 9 6 福建医科大学学报2 0 0 7 年11月 第41卷第6 期 鼠和F X R / 一 小鼠肝脏C yP7 A I 基因表达均明显降低 恻禽霉丈2巴日国H的 恻衡奥咬之“日一产d己 划贫军VN配日益卜d己 ( 图 1 ) 。 图 1

12、Figl l 0 5 t/(h ) 0: 野生型小鼠; F X R 一 / 一 小鼠， 图3 7 0 %肝脏切除术后 lh和 6h野生型小鼠和 F X R 一 / 一 小鼠肝脏S H P基因表达 F i g3 S H Pg e ne e x p r e s s i o ni nt h e l i v e r o f w i l dt y 伴a n d F X R 一 / 一mi c e a t o n e hou r a n ds i xh o u r a f t e r 7 0 % h e P a t e c t o my A: 野生型小鼠; B : F X R 了 一 小鼠. 7 。 %肝

13、脏切除术后再生早期野生型小鼠和 F x R 一 2 一 小鼠肝脏C y P7A I 基因表达 C y p 7 Al g e n e e x p r e s ， i o ni nt h el i v e r o f w i l dt y p e a n d F X R 一 ， 一m i c e d u r i n ge a r l ys t a g e o f l i v e r r e - g e ner a t i o n a f t e r 7 o 写h e p a t e c t o m y 2 . 2肝脏 70%切除术后 lh ， 野生型小 鼠和 F X R 一 / 一 小鼠肝脏 S

14、H P基因表达均明显上升( 图 l 0 5 招蔺霉式之配日公口5测勺备司之召日已工的 OL ee se es 蕊 任 留 乏 乏 么 盗 曰we. we ra ee ee ee J 铭召 洽 乏 汪 留 翔 es es 一 - 0l t/(助 A: 野生型小鼠; B : F X R一 / 一 小鼠. 7 0 %肝脏切除术后 l h ， 野生型小鼠和 F X R 一 / 一 小 鼠肝脏 S HP 基因表达 S HPg ene e x P res s i o ni nt he l i v e r o f w i l dt y P e a nd F X R 一 ， 一mi ce a t o ne h

15、 o u r a f t e r 7 0 %h e 钾t e c tomy 通路参与抑制胆酸介导C y p 7 A I 基因转录肝脏再 生过程由许多有机结合的阶段构成， 在这个过程中 许多信号通路被激活川。胆酸主要在肝脏内由胆固 醇转变而来， 除了促进脂类食物的吸收， 胆酸还是 信号分子， 其功能类似于激素阂。最近有研究显示 小鼠肝脏的正常再生必需有胆酸信号的存在。 70%肝脏切除术后所致胆酸堆积不仅促使肝脏通 过再生来减轻胆酸的负荷， 而且通过抑制C yP7 A I 基因 表达减少胆酸的合成2j。 胆酸可通过多种机制反馈抑制C y p 7 A I 基因表 达困。胆酸介导的F X R 一 S

16、H P 一 L R H 一 1 级联反应是 C y p 7 A I 基因转录抑制的重要方式阁。笔者对野生 型小鼠和F X R 一 一 小鼠行70%肝脏切除术， 发现术 后 l h 和6 h ， 两组小鼠肝脏C yP7 A I 基因表达均明 显降低， 提示在肝脏再生早期， 非依赖 F X R通路参 与抑制胆酸介导的C y p 7 A I 基因表达。 3 . 2 小鼠肝脏 70肠切除术后再生急性期 S H P可 通过非F X R介导途径参与调节 C y p 7 A I 基因表达 S H P是核受体超家族的非典型成员， 没有 D N A 结合区域， 它可介导许多核受体包括L R H 一 1 功能的

17、失活lj。本研究显示， 在7 0 %肝脏切除术后 l h ， 野 生型和F X R 一 / 一 小鼠的肝脏 S HPm R N A水平都显 著性升高， 提示在肝脏再生急性期， S H P可通过非 F X R介导通路参与调节 C y p 7 A I 基因表达。c-Ju n N端激酶(J N K ) 的激活是部分肝脏切除术后肝脏再 生的早期事件川。在小鼠S H P 启动子上存在相邻 近的两个反应元件I R-1 和A P 一 1 ， 胆酸信号激 活F X R和J N K通路的成员c-ju n 后， 分别通过与 I R-1 和A P 一 1 结合促进 S H P转录s3。因此在肝脏 再生急性期， S

18、H P可能通过J N K介导的通路抑制 C y p 7 A I 基因转录， 以使肝脏快速适应突然增高的 卜， ，r尸 。g )口口F 少曰 2 . 3 肝脏70%切除术后l h和6h ， 野生型小鼠和 F X R 一 / 一 小鼠肝脏中S H P基因的表达均显著下降 ( 图 3 ) 。 3 讨论 3 . 1 小鼠肝脏70 %切除术后再生早期非依赖F X R 万方数据 黄雄飞等: 小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因S H P 和C yP7 A I 的动态改变4 9 7 胆酸水平。 3 . 3 S H P 可通过自 我负反馈机制抑制自 身的表达 笔者发现， 术后 6h 野生型和 F X R 一 /

19、一 小鼠肝脏 S H Pm R N A水平均明显下降， 可能的原因是之前 大量诱导的S HPmR N A表达导致了S H P自身的 负反馈抑制。因为s H P的启动子上具有L R H 一 1 结 合位点， S H P通过与 L R H 一 1 相互作用抑制自身表 达。由于S H P是许多核受体的抑制物， S H P自我 负反馈调节机制可以防止因胆酸信号诱导的S H P 过量表达所致的S HP 靶基因的不当抑制3. 幻 。 在肝脏 70%切除术后正常再生过程的不同阶 段， 胆酸信号可能通过不 同的分子机制抑制 C yP7 A I 基因转录。在再生急性期， 胆酸水平显著 升高， S HP 可通过非

20、 F X R介导途径参与快速抑制 C yP7 A I 基因表达。在肝脏再生晚期， 随着肝脏体 积增大， 肝脏功能逐渐恢复， 胆酸负荷减轻， C y p 7 A I 基因表达的调控可能主要通过依赖F X R和S HP途 径实现。F X R 一 S H P 一 L R H 一 1通路对胆酸介导的 C y P7A I 基因转录的抑制呈现起效慢、 持续久的特 征困。在肝脏再生的不同阶段， 胆酸信号通过激活 不同通路反馈抑制C y p 7 A I 基因转录， 这些通路协 调合作组成一个精密的调控网络， 对胆酸信号的改 变做出及时反应。 参考文献: 1 K a l a a n yNY， Ma n g el

21、 s d o r f DJ .L X R S a n dF X R: T h e y i na n d 2 3 一!一，月JFesJ 左口勺一0 -.Lr.LlesL 7 8 9 Y a n go fc h o l e s t e r o la n d fatm e t a bol i s m J .A 刀 n “R 。 尸 几 夕 浮 f o l ， 2 0 0 6 ， 6 8 : 1 5 9 一 1 9 1 . Hu a n gW， MaK， Z h a n gJ ， 时a l .N u c l ear rec e p to卜 d e P e n d e n t b i l e a c i

22、dsi g n a l i n g i s r e q u i r edfo r n o rma l l i v e r r e g e n e ra t io n J . Sci enc e ，2 0 0 6 ， 3 1 2 ( 5 7 7 1 ) : 2 3 3 一 2 3 6 . G o odw i nB ， J o n e s SA， P r i c e RR， e t a l .Ar 馏u l a t o r ycasca d e o f t h en u c l earr ece p t o r sF X R ， S HRI ， a n dL R H 一 lr e p r e s

23、s e s b i l e a c idb i o s y n t h e s i s J . Mo I Ql l ， 2 0 0 0 ， 6 ( 5 ) : 5 1 7 一 5 2 6 . F a u s t oN， C a m b e l l JS ， R i e h l eKJ .Liv e r r 邝e n era t i o n J . He P a t o l og夕 ， 2 0 0 6 ， 4 3 ( Z S u P P l l ) : 4 5 一 5 3 - Ho u t e nSM， Wa t a n a b eM， Au we r xJ .E n d ocr i n efu

24、n c t i o n so f b i l e a c id s J . E MB OJ ， 2 0 0 6 ， 5 ( 7 ) : 1 4 1 9 一 1 4 2 5 . C h i a n g J Y. R e g u l a t i o n o f b i l e a c i d s y n t h e s i s : P a t h w a y s ， n u cle- a r r e c e p t o r : ， a n dm e c h a n i sm: J ，JHeP a t o l o g 夕 ，2 0 0 4 ， 4 0 ( 3 ) : 5 3 9 一 5 5 1 .

25、We s t wi c kJK， We i t z e l C ， L e ft e r t H L ， e t a l .A c t i v a t i o no f j u n k i n a s e i ， a n。 a r l yeve n t i nh e 那t i 。re g e n e ra t io n J .JCI n 1 ” 优 t ，1 9 9 5 ， 9 5 ( 2 ) : 8 0 3 一 8 1 0 . G u p taS ， S t r a v i tzRT ， D e n t P ， e t a l . D o w 介 r 昭u l a t i o no f cb

26、o - l e s t e rol 7 a l P h 含 h y d r o x y l a s e ( C Y P 7 A I ) g e n e e XPr e s s i o nb yb i l e a c id s i nP r im a r yrat h e P a toc y t e s i sm e d i a t ed b yt h eC-Ju nN - t e rmi n a l k i n a s e 卯t h way J .JB o l Chem ， 2 0 0 1 ， 2 7 6 ( 1 9 ) : 1 5 8 1 6 一 1 5 8 2 2 . D e Fab i

27、a n i E ， Mi t ro N， A n z 以 o vi c hAC ， eta l .T h en ega t iv e e 1 1 e c t so fb i l ea c i d sa n dt u m o rn ecro s i sfa c t o 卜 a l p h ao nt h e t ran s c r i p t i o n ofc h o l e s t e rol 7 a l p h 分 h 州ro x y l a s e g e n e ( C Y P 7 A I ) con v e r g et oh e P a t i cn u c l e a rfa c

28、 t o 卜 4 : an o v e lm ech a n i s m o f f e e d b a c kr e g ul a t i o no f b i l e a c i ds y n t h e s i s m edi a t e db yn u c l ear r e c 印t o r s J j . JB i o l Che 。， 2 0 0 1 ， 2 7 6 ( 3 3 ) : 3 0 7 0 8 一 3 0 7 1 6 . T h eE x P r e s s i o no f B i l eA c i dM e t a b o I is mR e I a t e dG

29、 e n e s C y P 7 A 1 a n dS H Pi nt h eE a r l yS t a g eo f L iv e r R e g e n e r a t j o ni nMi c e H u a n g X io n g f e i l 2 ， C h e n L ja n g w a n l ， L iu N ia n 3 4 ， H u a n g we n d o n g 3 1 . T hOr a c ic S u r g e ryI n s t it u t eofA ff i I i a t e dU n i on H o s P i t a I ， F u

30、】 i a n M e d i c a l U n i v e r s ity， F u z h o u 3 5 0 0 0 1 ， C h in a 2 . D i v is i on ofP a t h o lo g y ， F u 】 i a nM e d ic a l U n i v e r s it y ， F u z h ou 3 5 0 0 0 4 ， C h in a 3 . D e P a r t m e n t ofG e ne R e gUla t i on andD r u gD i s c o ver y ， C i t y ofH o P eB e c k m an

31、 R e s e a r c hl n s t it u te， C A ， 9 1 0 1 0 ， U S A 4D e Par 七 们 e n t ofB Icodo n c o l o g y ， T 触 F ir s t H osP i te l ofj j l jnU n j vers i t y ， C 加n g c hUn1 3 0 0 2 1 ， O h in a A B S T R A C T : O b 】 e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f n u c l e a r r e c e p t o

32、r s m a l l h e t e r o d i m e r p a r t n e r ( S H P ) i n t h e r e g u l a t io n o f C y p 7 A 1 g e n e e x p r e s s i o nd u r in g t h e e a r l y s t a g e o f m i c e l i v e r r e g e n e ra t i o n a f t e r 7 o 写 h e p a t e c t o m y . M e t h o d s T h e g e n e e x p r e s s i o n

33、o f C y p 7 A l a n d S H Pi n w i l d t y p e m i c e ( WT ) a n d f a r n a s o l X r e c e p t o r ( F X R ) 一 / 一m i c e a t o n eh o u r a n ds i xh o u r s o f p o s t- h e p a t e c t o m yw e r ec h e c k e dw i t hR T 一 r e a l t i m e P c R . R e s u l t s l n wTa n d F X R 一 1 一 m i c e ，

34、 C y p 7 A l m R N Al e v e l w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d a t o n e h o u r a n d s i x h o u r s a f t e r 7 o % h e p a t e c t o m y . S H Pg e n e e x p r e s s i o nw a s d r a m a t i c a l l yi n c r e a s e da t o n e h o u r o f p o s t o p e r a t i o n ， b u t w a ss t

35、 a t i s t i c a l l yd e c r e a s e da t s i xh o u r s . C o n c Iu s io n I nt h ee a r l ys t a g eo f m i c el i v e r r e g e n e r a t i o n ， t h e e x p r e s s i o no f C y p 7 A lg e n e w e r es u p p r e s s e d ， w h i l et h eS H Pg e n ee x p r e s s i o nw a si n - c r e a s e d .

36、S H pm i g h t p a r t i c i p a t e i nt h e i n h i b i t i o n o f C y p 7 A l e x p r e s s i o nv i a a F X R-i n d e p e n d e n t p a t h w a y . K E YWQ R D S :l i v e rr e g e n e r a t i o n ;g e n ee x p r e s s i o n ;c h o l e s t e r o l7 一 a l p h a 一 h y d r o x y l a s e ;f a r n e s o l ; d i s e a s em o d e l s ， a n i ma l ( 编挥: 张慈茹) 万方数据