北京市城区鼠间汉坦病毒感染的流行病学研究.pdf

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1、中国 媒介生物学及控制杂志2 0 0 6 年4 月第1 7 卷第2 期 C h i n J V e c t o r B io 针对汉坦病毒M基因部分片段设计汉城型汉坦病毒( S E O V ) 特异性引物， 应用R T - P C R法检测宿主动物携带 H V情况， 阳性标本直接测序。利用E x c e l 和S P S S 软件分析宿主动物H V感染的动态特征。最后用D N A S T A R软件对 获得序列进行比较分析。结果共捕获啮齿动物2 2 9 只， 平均鼠密度6 . 4 1 %( 2 2 9 2 3 5 7 0 ) ， 褐家鼠和小家鼠分别为餐饮 业、 农贸市场生境的优势鼠种。褐家鼠血

2、清抗体阳性率3 . 5 1 %( 6 / 1 7 1 ) ， 带病毒率为0 . 5 8 % ( 1 / 1 7 1 ) ; 小家鼠血清抗体阳性 率为6 . 9 0 % ( 4 / 5 8 ) ， 带病毒率为1 . 7 2 % ( 1 / 5 8 ) 。病毒检出率以1 1 , 1 2 月最高， 抗体水平冬春季( 1 , 4 月) 最高， 与春季人群 肾综合征出血热( H F R S ) 流行季节基本一致。2份扩增阳性标本( 分别来源于小家鼠和褐家鼠) 均为 S E O V， 差异为 5 . 4 0 %， 系统发育分析显示他们位于2 个不同的较小分支， 但均位于Z 3 7 支系。结论北京城区2 种

3、主要的H V宿主在 一些鼠害重点行业密度仍较高， 虽然 H V基础感染率不高， 但持续存在， 为春季人群 H F R S 发病高峰的重要影响因素。 来自2 个不同宿主的H V基因有一定的差异。小家鼠的传播作用有所加强， 应予重视。 【 关键词】 汉坦病毒; 啮齿动物; 流行病学 中图分类号: R 3 7 3 . 9文献标识码: A E p i d e m i o l o g i c I n v e s t i g a t i o n o n H a n t a v i r u s e s C a r r i e d b y R o d e n t s i n U r b a n D i s t

4、 r i c t o f B e ij i n g J I A N G J i a - f u ，WU X i a o - mi n g，WA NG R i - mi n g， XU We i - c a i ，Z U O S h u - g i n g，Z H A NG J i - j u n ，L I Z h o n g - l i n，C H E N L i - q u a n，G U O T i a n - y u ， C A O W u - c h u n .“ B e ij n g I n s t i t u t e o f Mi c r o b i o l o g y a n d

5、 E p i d e m i o l o g y ， S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f P a t h o g e n a n d B i o s e c u r i t y ( A c a d e m y o f Mi l i t a r y C o r r e s p o n d i n g a u t h o r Me d i c a l S c i e n c e s ) , B e ij i n g 1 0 0 0 7 1 ， C h i n a O Wu - c h u n ， E - m a i l : c a o w c n i c

6、 .ac. en A b s t r a c t CA t i v e b mi I n o r d e r t o ma k e t r a c k s f o r i n f e ct i ousf a c t o r s o f h e m o r r h a g i c f e v e r w i t h r e n a l s y n d r o m e ( H F R S ) ， a n d t o i n v e s t i g a t e h a n t a v i r u s ( H V) i n f e c t i o n o f r o d e n t s f r o m

7、 u r b a n O b j e c t d i s t r i c t o f B e ij i n g . Me t h o d s d i f f e r e n t n i c h e s i n u r b a n d i s t r ic t m o n t h l y d u r i n g 2 0 0 3 - 2 0 0 4 ， d e t e c t e d t h e I g G r e a c t i n g s e r a t o H V a m p l i f i e d t h e p a r t i a l M s e g m e n t o f H V f

8、r o m c a p t u r e d r o d e n t l u n g s a m p l e s w i t h R T - P C R a n d t h e n We t r a p p e d t h e r o d e n t s i n a n t i g e n u s i n g E L I S A, a n d s e q u e n c e d i t d i r e c t l y . T h e a l i g n m e n t o f t h e n u c l e o t i d e a n d t h e d e d u c e d a m i n

9、o a c i d s e q u e n c e s , t o g e t h e r w i t h p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s w e r e m a d e w i t h D N A S T A R s o f t w a r e . R e s u l t s 2 s p e c i e s ( R a t t u s n o r v e g i c u s a n d Mu s m u s c u l u s ) o f 2 2 9 r o d e n t s w e r e c a p t u r e d . T h e o

10、 v e r a l l s e r o p r e v a le n c e o f H V i n f e c t io n w a s 4 . 3 7 %( 1 0 / 2 2 9 ) w i t h R. n o r v e g i c u s 3 . 5 1 %( 6 / 1 7 1 ) a n dM. m u s c u l u s 6 . 9 0 % ( 4 / 5 8 ) r e s p e c t iv e ly . R T - P C R p o s it i v e r a t e s w e r e 0 . 8 7 % ( 2 / 2 2 9 ) w it h R. n

11、 o r v e g i c u s 0 . 5 8 % ( 1 / 1 7 1 ) a n d M. m u s c u l u s 1 . 7 2 %( 1 / 5 8 ) r e s p e c t i v e l y . T h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f 3 5 6 b y r e g i o n( 1 9 5 8 - 2 3 1 3 ) o f M s e g m e n t o b t a i n e d f r o m t h e s e 2 s a m p l e s w e r e a l l i d e n t

12、i f i e d t o S E O V , w i t h 5 . 4 0 % d iv e r g e n c e . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e y a l l b e l o n g e d t o Z 3 7 s u b g e n o t y p e s f r o m Z h e j i a n g p r o v i n c e , a n d c o u l d b e b r a n c h e d i n t o 2 d i f f e r e n t s u

13、 b c l a d e s . C o n c l u s i o n I t s h o w e d S E O V w e r e t h e d o m i n a n t g e n o t y p e s i n Mu r i n a e r o d e n t s f r o m u r b a n d i s t r i c t o f B e ij i n g a n d h a d t h e v a r i a t i o n a l n a t u r e a m o n g d i f f e r e n t h o s t s . T h e H V p r e v

14、 a l e n c e o f h o s t s i n u r b a n d i s t r i c t w a s n o t h i g h . B e s i d e s R. n o r v e g z c u s ， , t h e i n c r e a s i n g p r e v a l e n c e e f f e c t o f M. M U S C U l u s s h o u l d b e n o t i c e d . ( K e y w o r d s H a n t a v i r u s ; R o d e n t s ; E p id e m

15、io lo g y 汉坦病毒( H V) 是由鼠类等动物传播的一种动物 基金项目: 北京市自 然科学基金重点资助项目( 7 0 2 1 0 0 4 , 0 6 G 0 6 6 8 ) 作者单位: 1 军事医学科学院微生物流行病研究所， 病原微生物生物安 全国家重点实验室( 北京 1 0 0 0 7 1 ) ; 2北京市东城区疾病预 防控制中心 作者简介: 江佳富( 1 9 7 2 一， 男， 博士， 从事传染病流行病学研究。 通讯作者: 曹务春， E - m a i l : c a o w c ) n i c . b m i . a c . c n 疫源性病原， 主要引起欧亚地区的肾综合征出血

16、热 ( H F R S ) 和南、 北美洲的汉坦病毒肺呼吸综合征 ( H P S ) 。中国是世界上受 H V危害最为严重的国家， 全世界 9 0 %以上的H F R S 病例发生在中国， 即使在有 疫苗的情况下， 近几年我国两型H F R S报告病例仍居 高不下， 而且疫情正有着向大城市蔓延的趋势。北京 中国 媒介生物学及控制杂志2 0 0 6 年4 月第1 7 卷第2 期 C h in J V e c t o r B io 之后1 0 0 0 0 r / m i n 离 心5 m i n ， 吸取上清作为抗原， 用0 . 0 5 m o l / L N a t C O , 溶液4 0 0

17、倍稀释包被聚苯乙烯微孔板， 每孔1 0 0 川， 4 过夜， B i o R a d 1 5 7 5 洗板机清洗备用。辣根过氧化 物酶标记羊抗小鼠二抗由北京鼎国生物技术公司提 供。在B i o R a d 5 5 0酶标检测仪4 5 0 n m处测定各孔吸 光度值。阳性对照血清由本室利用双价 H F R S 灭活 疫苗免疫B A L B / 。 小鼠后获取， 阴性对照血由正常 B A L B / d 1 , 鼠上获取。每板设 2 孔不同稀释度阳性对 照， 1 2 孔以上阴性对照。结果判定以阴性对照0 . 1 ( 0 . 0 5 以0 . 0 5 计) 且P / N 值)2 . 0 为阳性。 1

18、 . 3 宿主动物H V病毒R N A检测采用T r i z o l 法 提取标本肺组织总 R N A。具体步骤: 无菌剪取约 5 0 m g 组织置研磨器中， 加人0 . 5 m l T r i z o l ( I n v i t r o g e n 公司产品) 反复研磨， 将研磨悬液移至1 . 5 m l 离心管， 室温静置3 m i n ; 加人0 . 1 m l 氯仿， 振荡 1 5s ， 静置 5 m i n ， 在 冷 冻 离 心 机 上 4 C , 1 2 0 0 0 r / m i n离 心 1 5 m i n ; 移取上清加人0 . 2 5 m l 异丙醇， 轻轻混匀室温 静

19、置1 0 m i n , 4 C , 1 2 0 0 0洲 m i n 离心1 0 m i n ， 弃上清， 加人0 . 5 m l 7 5 %预冷乙醇轻轻洗涤沉淀( 可一 2 0保 存过夜) ， 然后4 C , 1 2 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ， 弃上清; 室温干燥后加入1 0 讨0 . 2 % D E P C水溶解待逆转录。 采用 R T - P C R法检测病毒核酸。在 D E P C水溶 解的 R N A中加人特异引物 P 1 4 ( T A G T A G T A G A C T C C ) 3 t 1 , 7 0 水浴5 m i n ， 冰上冷却5 m

20、i n ， 加人 A MV逆转录酶( P r o m e g a 公司产品) 9 t cm o l / L , 5 x 反 应缓冲液5 p 1 , 1 0 m m o l/ L d N T P s 2 E d , R N A酶抑制剂 1 . 5 l m o l / L ( P r o m e g a 公司产品) ， 补水至2 5 川， 简单离 心后放人4 2温水中反应lh ， 后在9 9水浴1 0 m i n 灭活逆转录酶， 一 2 0贮存备 P C R扩增。采用巢式 P C R对 c D N A进行扩增。针对汉坦病毒 MI S基因部 分片段设计合成引物， 由于M基因编码糖蛋白G , , 吼

21、是病毒的毒力位点、 中和抗原位点、 型特异性抗原位点 和血凝抗原位点所在， X i a o 等( 1 ) 利用该基因的1 9 8 3 - 2 3 1 6 片段创立了一种构建简捷、 可靠的H V基因分型 诊断方法。本研究扩增的靶序列位置为1 9 3 6 - 2 3 5 3 , 外引物和型特异引物均参照文献 2 ) 。由于 H V编码 核蛋白的S 基因变异相对较小， 我们对扩增得到的M 片段变异较大的毒株继续对其S 基因部分片段进行巢 式P C R扩增， 目标序列位置为 5 9 5 -9 9 7 ， 两套引物参 照文献 3 ) 。所用引物均由上海博亚生物工程有限公 司合成。产物检测应用1 . 2

22、%琼脂糖凝胶电泳后在凝 胶成像系统( 法国 S I M 公司) 观察。阳性标本重复多 管扩增后送上海博亚生物工程有限公司纯化测序。 中国媒介生物学及控制杂志2 0 0 6 年4 月第 1 7 卷第2 期C h in J V e c t o r B io 外省株 Z 3 7 ( A F 1 9 0 1 1 9) 、 K 2 4 - E 7 (A F 2 8 8 6 5 3) 和G O U ( A B 0 2 7 5 2 1 ) ; 国外 S E O V 株为 8 0 - 3 9 ( S 4 7 7 1 6 ) , S R ( M3 4 8 8 2 ) 和 I n d o n e s i a (

23、J a k a r t a l 3 7 A J 6 2 0 5 8 3 ) 。 二 雄性 雌性 00，了6114。、2llnU 0.0.0.0.住0.0.仓 享侧票壤级 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 月份 图2褐家鼠繁殖强度逐月变化情况 2结果 2 . 1宿主动物的种类和分布共捕获鼠类 2 2 9只， 平均鼠密度6 . 4 1 % ( 2 2 9 / 3 5 7 0 ) ， 均为褐家鼠( R a t t u s n o r v e g i c u s ) 和小家鼠( Mu s m u s c u l u s ) ， 且分别为餐饮 业和农贸市场生境的优势种( 表 1

24、 ) ， 说明2种宿主不 同的生态适应性。 表1 不同生境宿主动物构成( %) 鼠种 餐饮业农贸市场合计 只%只%只% 褐家鼠 小家鼠 合计 1 4 9 9 8 . 6 8 2 2 2 1 . 3 2 5 6 1 5 1 1 0 0 . 0 0 7 8 2 8. 2 1 7 1. 7 9 1 0 0. 0 0 1 71 5 吕 7 4. 6 7 2 5. 3 3 1 0 0. 0 0 2 . 2宿主动物种群密度和繁殖强度动态变化宿主 种群平均密度变化不大， 餐饮业为单一鼠种( 褐家鼠) 的种群密度， 两者季节性变化均不明显( 图 1 ) a 平均值餐饮业 2 . 3宿主动物 H V感染情况与抗

25、体动态变化对 2 2 9 份血清进行检测， 其抗体平均阳性率为4 . 3 7 % ( 1 0 / 2 2 9 ) ， 其中褐家鼠抗体阳性率为3 . 5 1 % ( 6 / 1 7 1 ) , 小 家鼠 为 6 . 9 0 % ( 4 / 5 8 ) ， 两 者 差异 无统 计学 意 义( 丫= 1 . 0 1 3 , P= 0 . 3 1 4 ) 。抗体阳性率最高峰在冬春季( 1 , 4 月) ， 带病毒指数变化与抗体阳性率变化一致。通过 S p e a r m a n 相关系数分析， H V抗体变化与鼠密度变化 之间无显著相关性( r = 0 . 4 1 , P= 0 . 2 5 8 ) 。

26、通过对 2 2 9 份肺组织标本进行 R T - P C R检测， 分别在 2 0 0 3年 1 2 月检测到褐家鼠( 采集于某饭店) 阳性肺标本 1 份， 2 0 0 4 年1 1 月检测到小家鼠( 采集于某集贸市场) 阳性 肺标本 1 份， 阳性率分别为0 . 5 8 % ( 1 / 1 7 1 ) 和1 . 7 2 % ( 1 / 5 8 ) 。 2 . 4 病毒 M， 基因片段序列测定与比较分析对 2 份阳性标本进行序列测定， 与 G e n B a n k其他参考 S E O V毒株比较， 结果表明: 两者对应位置核昔酸序列 之间的差异为5 . 4 %， 位于 2个不同小分支上， 其

27、中 D C 1 2 0 8 来自某中档饭店 1只褐家鼠( 已向 G e n B a n k 提交注册， 序列号为 A Y 7 2 5 9 9 5 ) ， 与昌平株 C H P 3 0 2 亲缘关系较近。D C 1 1 0 5 ( 序列号D Q 2 4 6 4 4 0 ) 则来源于 某菜市场小家鼠， 系统发生树显示其与海淀褐家鼠分 离 株B j H D 0 1 14 1 位于一个分支。 但两者均位于浙江株 Z 3 7 所在的支系， 与北京丰台株B i F T 0 1 亲缘关系相对 较远( 图3 ) 0 CP 川 ( , . S F :Q C P 2 7 r . S F Q R j l l l )

28、 U I .S F Q U ( 、 日( I S , S F Q C I I P 3 0 2 . S I . Q I K - 1 2 I I S . S F -:Q 1 Q - K 2 . S I :Q Z 3 TS I Q I n d u n c s i a . S l Q S I ) 一 ; 9 . S F Q S R . S F Q K 2 4 - H 7 . S 1 Q S c o u I k 2 - t - , 2 . S F : Q B I F I l l I . S I Q G( ) l . S I ( ) Zn0八Zn42 (%)侧知髓禽州鳃 1 2 1 图1 2 3 4 5

29、6 7 8 9 1 0 1 1 月份 宿主动物密度逐月变化情况 针对褐家鼠的优势种地位， 根据褐家鼠雄性精巢 的位置、 雌性孕哺和生殖孔状态判定雌雄繁殖状况， 计 算其繁殖强度变化( 图2 ) ， 两者繁殖强度波动一致， 呈 现间歇性的波动， 季节性变化亦不明显。 - - - - - r - -一 一- - - - - 门 -一- - - ， - - - - - - 一一气一- -， H6- L2 ) 图3 基于M片段部分序列构建的2 株 S E O V与其他已知 H V参考株系统树 中国媒介生物学及控制杂志2 0 0 6 年4 月第 1 7 卷第 2 期C h in J V e c t o

30、r B io 间接免疫荧光法; 检测 中图分类号: R 3 7 3 . 3 3文献标识码: A D e t e c t i o n o f I m p o r t e d D e n g u e F e v e r E p i d e m i c s b y I n d i r e c t I m m u n o f l u o r e s cen t A s s a y i n Z h e j i a n g P r o v i n ce J I A N G L i - p i n g ， L I N J u n - f e n ， G O N G Z h e n - y u ， X I E

31、 S h u - y u n ， L U Q u n - y i n g ， ME N G Z h e n .C e n t e r f o r D i s e a s e P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l ， Z h e j i a n g P r o v i n c e , H a n g z h o u 3 1 0 0 0 9 , C h i n a A b s t r a c t I O b j e c t i v e T h e r a p i d la b o r a t o r y d e t e c t io n t e c h n

32、 o lo g y o f D e n g u e f e v e r w a s a p p l ie d t o p r o v id e im p o r t a n t e v id e n c e i n e f f i c i e n t d i a g n o s i s a n d e p i d e m i c s c o n t r o l o f D e n g u e . Me t h o d s I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n t a s s a y ( I F A) w a s d e v e l o

33、p e d t o d e t e c t t h e s e r a f r o m s u s p i c io u s D e n g u e p a t i e n t s i n 2 0 0 3 - 2 0 0 4 . R e s u l t s B y t h e I F A a s s a y , t h r e e D e n g u e f e v e r e p i d e m i c s w a s c o n f i r m e d i n c l u d i n g o n e o u t b r e a k . C o n c l u s i o n T h e i

34、m p o r t e d D e n g u e e p i d e m i c s o c c u r r e d i n Z h e j i a n g i n 2 0 0 3 - 2 0 0 4. K e y w o r d s I D e n g u e f e v e r ; I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n t a s s a y ; D e t e c t io n 登革热( D e n g u e f e v e r , D F ) 是一种全球性急性虫 作者单位: 浙江省疾病预防控制中心病原所( 杭州 3 1 0

35、0 0 9 ) 作者简介: 姜理平( 1 9 6 4 - ) ， 男， 副主任技师， 从事自然疫源性疾病实验 诊断方法研究。 媒传染病， 由 登革病毒( D e n g u e v i r u s , D V ) 引起经伊蚊 传播急性传染病， 其病毒保存在人和伊蚊中循环。登 革热流行于热带和亚热带 6 0 个国家及地区， 以东南亚 国家最为严重。我国自1 9 7 8年以来共发生 1 3次流 行。浙江省以前也时有临床诊断的登革热病例， 但尚 所以更值得注意。 参考文献 : ( 1 ) X i a o S Y , L e d u c J W, C h u Y K , e t a l . P h y

36、 lo g e n e t i c a n a ly s e s o f v ir u s is o l a t e s in t h e g e n u s H a n t a v i r u s , f a m i l y B u n y u v i ri d a e J . V i r o lo g y , 1 9 9 4 , 1 9 8 : 2 0 5 一1 7 . ( 幻 王世文， 杭长寿， 王华， 等.我国汉坦病毒基因型和基因亚型的分 布研究 I . 病毒学报， 2 0 0 2 , 1 8 : 2 1 1 - 2 1 6 . ( 3 ) 潘曹， 白雪帆， 黄长形， 等. H F R

37、 S 患者血清中H V - R N A的P C R检 测及扩增产物的测序分析【 J l . 第四军医大学学报， 2 0 0 0 , 2 1 : 8 5 6 - 8 6 0. ( 4 左曙青， 张淬河， 曹务春， 等. 北京市褐家鼠中汉坦病毒的分离和 初步鉴定 J . 中华微生物学和免疫学杂志， 2 0 0 5 , 2 5 : 3 6 7 - 3 6 8 . ( 5 ) F e u e r R , J o h n D B , N e t s k i D , e t a l . T e m p o r a l a n d s p a t i a l a n a l y s i s o f s in

38、 n o m b r e v i r u s q u a s i s p e c i e s in n a t u r a l l y in f e c t e d r o d e n t s J . J Vi r o l , 1 9 9 9 , 7 3 : 9 5 4 4 - 9 5 5 4 . ( 6 ) E s c u t e n a i r e S , C h a lo n P , V e r h a g e n R , e t a l . S p a t i a l a n d t e m p o r a l d y n a m i c s o f p u u m a l a h a

39、 n t a v i r u s i n f e c t i o n i n r e d b a n k v o l e ( C l e t h r i o n o m y s g l a r e o l u s )p o p u l a t io n s i n b e l g iu m J .V i r u s R e s e a r c h , 2 0 0 0 , 6 7 : 9 1 - 1 0 7 . ( 7 左曙青， 吴晓明， 孙培源， 等. 北京北郊地区宿主动物感染汉坦病 毒分子流行病学调查研究【 J 中华流行病学杂志， 2 0 0 4 , 2 5 : 4 2 1 - 4 2 4.

40、 ( 8 江佳富， 吴晓明， 左曙青， 等. 北京不同生境鼠类及其感染汉坦病 毒的调查【 J . 中国媒介生物学及控制杂志， 2 0 0 4 , 1 5 : 4 2 9 - 4 3 3 . ( 9 ) A b b o t t K D , K s i a z e k T G , Mi ll s J N , e t a l . L o n g - t e r m h a n t a v ir u s p e r s i s t e n c e in r o d e n t p o p u la t io n s in c e n t r a l A r iz o n a J . E m e r g

41、 I n f e c t D i s , 1 9 9 6 , 5 : 1 1 3 - 1 1 7 . ( 1 0 ) We i g l e r B J , V a n d e n b e r g h T G , L e v i n J G , e t a l . S e r o lo g ic a l e v i d e n c e f o r z o o n o t i c h a n t a v i r u s e s i n N o r t h C a rol i n a r o d e n t s J . J Wi l d l i f e D i s , 1 9 9 6 , 3 2 :

42、 3 5 4 - 3 5 7 . ( 1 1 ) C o m p t o n S R , J a c o b y R O , P a t u r z o F X , e t a l . P e r s i s t e n t S e o u l v ir u s i n f e c t i o n i n l e w i s r a t s J . A r c h V i r o l , 2 0 0 4 , 1 4 9 : 1 3 2 5 - 1 3 3 9 . ( 1 2 ) P l y u s n i n a A , I b r a h i m I N , Win o t o 1 , e

43、t a l . I d e n t i f ic a t io n o f s e o u l h a n t a v i ru s in R a t t u s n o r v e g i c u s i n i n d o n e s ia J . S c a n d J I n f e c t D is , 2 0 0 4 , 3 6 : 3 5 6 - 3 5 9 . ( 1 3 ) V a p a l a h t i O, Mu s t o n e nJ , L u n d k v i s t A, e t a l . H a n t a v i r u s i n f e c t i o n s i n E u r o p e J . L A N C E T I n f e c D i s , 2 0 0 3 , 3 : 6 5 3 - 6 6 1 . 收稿日 期: 2 0 0 5 - 0 4 - 2 5 3