卡氏肺孢子虫病的实验诊断研究现状.pdf

《卡氏肺孢子虫病的实验诊断研究现状.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《卡氏肺孢子虫病的实验诊断研究现状.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、镇江医学院学报J O U R N A L O F Z H E N J I A N G M E D I C A L C O L L E G E 2 0 0 1 , 1 1 ( 6 ). 8 71 卡氏肺抱子虫病的实验诊断研究现状 陈盛霞， 唐学恒 ， 仇锦波 ( 镇江医学院寄生虫学教研室， 江苏 镇江 2 1 2 0 0 1 ) 关键词 卡氏肺饱子虫病; 实验诊断 【 中图分类号I R - 3 3 2 文献标识码I B 文章编号 1 0 0 6 - 7 6 5 5 ( 2 0 0 1 ) 0 6 - 0 8 7 1 - 0 3 卡氏肺抱子虫( P n e u m o c y s ti s c a

2、 r in i i , P C ) 是一种机 会致病寄生虫， 可引起严重的卡氏肺抱子虫肺炎 ( P n e u m o c y s t i s c a r in i i p n e u m o n i a , P C P ) ， 主要发生于获得 性免疫缺陷综合征、 肿瘤化疗及器官移植术后等免疫 力低下的病人， 是此类病人的主要并发症和重要致死 病因， 因此P C P的早期诊断显得尤为重要。但目前采 用的诊断方法各有利弊， 本文就其实验诊断现状展开 综述 。 动物模型的研究 1 . 1 动物模型的建立卡氏肺抱子虫体外培养技术 已有报道， 但结果并不理想。迄今为止动物模型仍然 是人们常用的研究工具

3、。自从( 1 9 6 6 ) F re n k e l 报道以醋 酸可的松免疫抑制大鼠建立 P C动物模型至今， 动物 模型在 P C生物学、 分子生物学、 细胞生物学、 生物化 学、 免疫学、 病理学、 药理学与临床等研究方面起着举 足轻重的作用。目前国外多采用 1 m l 2 5 %醋酸可的 松每周2 次皮下注射 S D大鼠， 同时给与低蛋白( 8 %) 饮 食 来诱导建立动物模型 = 。国内除此而外， 还采用 W i s t a r 大鼠， 以普通饲料喂养或提供高蛋白饮食以提 高感染鼠的存活率， 均取得了较好的效果。 1 . 2 检查部位与检查方法大鼠感染最早、 最常见的 部位是肺， 肺

4、组织或支气管肺泡灌洗液( B A L F ) 是常用 的取材; 病原染色法、 免疫学技术和分子生物学方法是 常用的检测方法。C a s a n o v a C a r d i e l 等用甲苯胺蓝 0 ( T B O ) 、 乙醇快速染色( D if f - Q u i k , D Q ) 和六亚甲基四 胺银( G M S ) 染色检测大鼠的B A L F 2 1 ， 结果表明G M S 是 一种诊断 P C P的适用方法。R a h i m i f a r d 等比较了 1 7 种 常规、 改良 及新方法作大鼠 肺印片的 染色效果 ， 建议 选择改良T B O 、 改良亚甲基蓝( m e t

5、 h y l e n e b l u e ) 和改良 甲 苯醋紫( c r e s y l v i o l e t ) 作为快速诊断P C P 的方法。 用 聚合酶链反应( P C R ) 检测肺组织和 B A L F中的 P C D N A ， 可明显地提高敏感度， E v a n s 等通过 G i e m s a 染色 和 半 套式P C R 观 察感染鼠 的 感染进程3 ， 发现用半 套 式P C R在免疫抑制后的第2 周就能检测出P C 感染， 而用 G i e m s a 染色在 3 周后才检测到。 P C为细胞外寄生虫， 多数情况下出现于肺泡内， 但其肺外组织的感染越来越受到人们

6、的关注。C h a r g R e d d y 等借助动物模型和敏感的P C R检测L4 ; ， 在卡氏 肺抱子虫感染原发鼠和治疗后复发鼠的肾上腺组织、 骨髓、 心脏、 肾脏、 肝脏、 脾脏、 淋巴结、 甲状腺组织内均 检测到P C D N A , 肺组织、 肺外组织的检查一般多是在动物死亡后 取材， 全血或血清的取材可在活体状态下进行， 但各家 报道的结果不同。C h a r g r e d 由等和L ip s c h i k 等分别在 免疫抑制大鼠的全血和血清中检测到虫体D N A 而E v a n s 等在血液中却未检测到虫体D N A 3 。 2 人体 P C 检测 2 . 1 标本取

7、材为了提高诊断准确性， 病人标本的取 材很重要。临床上一般多采用支气管镜检查， 常用方 法有支气管肺活检( T B L B ) ， 支气管侧检( B B ) 以及支气 管肺泡灌洗( B A L ) 等， 其中以B A L 检查最为实用， 且检 出率较高。不过， 这些均为创伤性手段， 检出率虽高， 但都有出血倾向， 且要求操作者掌握熟练的操作技术。 痰液检查虽是一种非创伤性手段， 但因其检出率低， 故 常用高渗盐水吸人诱导痰液法( I S ) 替代之。随着敏感 性高的P C R 方法的采用， P C检出率也有了提高， 越来 越多的人接受非损伤性方法， 外周血、 血清等是较易取 得的标本， 甚至有

8、人采用口咽部分泌物、 漱口液等操作 简便的标本进行检测。 2 . 2 病原学检查病原学检查是指将取材的标本作 涂片染色镜检， 常用染色方法有 G i e m s a , T B O及G M S 染色等传统方法。G M S已被认为是一种标准方法， 但 其操作步骤较烦琐， 染色花费时间较长。近年来采用 的D Q 和C a lc o f l u o r w h i t e ( C W ) 染色 具有较好的应用价 值。 N a im e y 等比较了D Q与G M S 检测肺内P C的效 果 (6 7 ， D Q 与G M S 结 果相同， 但D Q 具 有 试 剂 简 单、 快 速 和花费少等优点。

9、C W是一种化学荧光物质， 其在检 测大部分呼吸道分泌物样本( 咳痰除外) 和肺组织活检 来 审稿 万方数据 8 7 2镇江医学院学报J O U R N A L O F Z H E N J I A N G M E D I C A L C O L L E G E 2 0 0 1 , 1 1 ( 6 ) 标 本 中 的P C 都 具 有 快 速、 价 廉 等 特 点 x .8 7 ， 但M a y m in d 等却认为9 ; ， 因C W染色荧光背景较强， 仅C W染色检 测 P C是不够的。 2 . 3 免疫学诊断近几年来免疫学诊断使用最多的 是免疫荧光抗体试验， 包括直接免疫荧光抗体试验 (

10、 D F A ) 和间接免疫荧光抗体试验( I F A ) . R i g o l e 等比较 了 直 接 免 疫 荧 光 染 色 和G ie m s a , G M S 染 色 的 区 痢 io l 认为D F A是可以信赖的高敏感性和高特异性的方法。 C h a t te rt o n 等使用鼠源性抗原， 特别是滋养体抗原， 用 W A 检 测 血清中 的P C 够、 沙、 妙 III ， 结果表明 ， I F A 是检测血清P C I g G最有用的试验， 且I F A检测血清P C ig M和I 幼 以及采用免疫印迹试验能协助诊断。 2 . 4 P C R 等分子生物 学技术 2 .

11、4 . 1 引物的设计P C R技术的关键是引物， 引物不 同， 同一标本的检测结果完全不同， 也就决定了方法的 优劣， 常用的引物主要来 自于 P C内转录间隙( m ) R N A , 1 8 S r R N A 、 线粒体( m t ) r R N A , 5 S r R N A 、 胸腺峪陡 核甘酸合成酶( T S ) 、 二轻叶酸合成酶( D H F R ) 等6 种基 因， 其中前两种基因P C R属于套式P C R .切 等比较了 这6 种引 物P C R 检测5 0 份B A L F 的 结 果12 1 ， 表明P C - I T S - P C R是套式P C R中最敏感最特

12、异的方法， m t r R N A 基因P C R是最敏感最特异的一步法P C R ， 应用D H F R 基因作为引物的P C R是非特异的， 排除了其在诊断P C 的作用。 S a n d h u 等用基于 5 S r R N A和 2 8 S r R N A基因的 P C R 检测B A L F s l ， 两者具有相同的结果， 认为2 8 S r R N A基因是实验室诊断 P C的又一靶基因。用分子生 物学方法， 人们还对P C 的主要表面糖蛋白( M S G ) 基因 进 行了 研究 14 1 , M S G重组片段可能是进行人体P C 感 染流行病学调查研究的有用成分。 2 .

13、4 . 2 方法学评价P C R与其它方法的比较存在两 种观点。一种观点认为P C R优于其它病原学和免疫 学诊断方法; 许多研究报道 P C R敏感性和特异性高于 D F A 法和I F A 法 15 , 16 ， 也高于细胞化学染色法 17 。而 另 一 种 观 点 却 相 反 15 1 , A r m b lu s te r 等 认 为D Q 染 色 的 敏 感性和特异性都高于P C R , 近年来， P C R已进行了多方面的改良。套式 P C R 比 单一引物 P C R具有更高的敏感性和特异性， 在 B A L F 中 检 测到P C 的时间更长 16 ， 快速p N A 提取法

14、套 式P C R 可 用于临 床常规检测B A L F 以 诊断P C P 18 1 , H e lw e g L a r s e n 等研究降落P C R ( T o u c h - d o w n P C R , T D - P C R ) 检 测 漱口 液中 的P C 19 , T D - P C R 比 标准P C R 所 需 时间少， 敏感性和特异性较高， 是一种有潜力的非损伤 性方法， 可用于实验室常规诊断。 2 . 4 . 3 P C R产物的检测常规 P C R扩增的产物需进 行放射性检测 射性检测方法 ， 当今非放射性检测方法在逐步替代放 。C a r tw r ig h t

15、 等用酶免疫法( e n z y m e im - m u n o a s s a y , E I A ) 检测P C R产物( P C R - E I A ) “ ， 并与琼 脂糖凝胶电泳进行了比较， 前者的敏感度高于后者。 O r to n a 等用P C R - S H E L A M R - s o l u t i o n h y b r i d iz a t i o n e n z - y m e - l in k e d im m u n o a s s a y ) 检测B A L F 和I S 标本Le i 7 ， 其敏 感性高于免疫荧光法或单一引物P C R 法， 比 套式P

16、C R 特异性高， 特别适用于呼吸道样本的检测。 2 . 4 . 4 其它分子生物学方法借助于 P C R方法的其 它分子生物学方法也有很好的应用价值。K o b a y a s h i 等用地高辛标记经 P C R扩增产物制备的双链 D N A作 为探针2 2 1 ， 使用原位杂交( I S H ) 检测经福尔马林固定、 石蜡包埋的肺组织切片标本中的P C ， 其具有高反应性 和高特异性。G r a v e ， 用 S B ( S l o t b l o t ) 杂交检测 i s中的 pC2 3 1 ， 结果表明， 用S B 杂交可以检测出低负荷的虫 体， 本法是当今临床细胞学染色方法的重要

17、补充。 人体感染的P C 存在种株的不同， 用T S O肠p in g - s p e c i f ic o li g o n u c l e o t i d e ) 杂交和单链多态性( s i n g l e - s t r a n d c o n f o r m a t io n p o l y m o r p h i s m , S S C P ) 技术可以检测出B A L F 及 血液中的P C 存在不同的虫株U .2 5 1 ， 从而将来可以 适用于流行病学研究。 参考文献 edof 1 R a h im if a r d N , A h i M , K a h n a m u i

18、i A . A c o m p a r is o n r # m o d ifi c y to l 哈c a l a n d h is to l o g ic a l s t a in i n g m e t h o d s f o r th e d ia g n o s is P n e u m o c y s ti s c a r in i i p n e u m o n i a J . A P M I S , 1 9 9 7 , 1 0 5 ( 1 2 ) : 9 0 4 9 0 8. 2 C a s a n o v a C a r d i e l I J , C e d ill o R

19、 iv e r a R , G a r d u n o R o d r ig u e z G , e t a l . C o m 画s o n o f 2 d y e s i n t h e d e t e c t i o n o f P n e u m o c y s t i s c a r i n i i J . R e v I n v e s t C li n , 1 9 9 6 , 4 8 ( 6 ) : 4 4 3 一 4 4 7 . 3 E v a n s R , J o s s A W L , P e n n i n g to n T H , e t a l . P r o g

20、r e s s io n o f P n e u - m o c y s t i s c a r i n i i i n f e c t io n i n a n a n i m a l m o d e l J . J M e d M i c r o - b i o l , 1 9 9 8 . 4 7 ( 6 ) : 5 4 3 一 5 4 6 . 4 1 C h a r g R e d d y S . G r a v e s D C . I d e n t ifi c a t io n o f e x tr a p u lm o n a ry P n e u m o c y s ti s c

21、 a r in i i i n i m m u n o c o m p r o m i s e d r a t s 娇P C R J . J C li n M i c r o b i o l , 1 9 9 6 , 3 4 ( 7 ) : 1 6 6 ( ) 一 1 6 6 5 . 阁 L ip s c h ik G Y , G ill V J , L u n d g re n J D , e t a l . Im p ro v e d d ia gn o s is P n e u m o c y s ti s c a r i n i i i n f e c t i o n勿 p o l y

22、m e r a s e c h a i n re a c t i o n o n i n d u ce d s p u t u m a n d b l o o d J 1 . L a n c e t , 1 9 9 2 , 3 4 0 : 2 0 3 一 2 0 6 . 6 N a im e y G L , W u e r k e r R B . C o m p a r is o n o f h is to lo g ic s ta in s in th e d ia g n o s is o f P n e u m o c y s ti s c a r in ii J . A c ts, C

23、 y to l , 1 9 9 5 , 3 9 ( 6 ) : 1 1 2 41 1 2 7 . 7 A s la n z a d e h J , S te h n a c h P S . D e te c tio n o f P n e u m o c y s ti s c a ri n ii w it h d i r e c t fl u o re s c e n ce a n ti b o d y a n d c a l c o fl u o r w h it e s t a i n J . I n f e c t io n , 1 9 9 6 , 2 4 ( 3 ) : 2 4 8 一

24、 2 5 0 . 8 F r a ire A E , K e m p B , G r e e n b e r g S D , e t a l . C a lc o llu o r w h i te s ta in f o r t h e d e t e c tio n o f P n e u m o c y s ti s c a ri n i i i n t r a n s b r o n c h ia l l u n g 万方数据 镇江医学院学报 O U R N A L O F Z H E N J I A N G M E D I C A L C O L L E G E 2 0 0 1 , 1

25、 1 ( 6 ). 8 7 3 b io p s y s p e c i m e n s : a s t u d y o f 6 8 c a s e J . M o d P a t h o l , 1 9 9 6 , 9 1 7 ( 8 ) : 8 6 1 一 8 6 4 . 沙 M a y m i n d M , T h o m a s J G , A b ro n s H L , e t a l . L a b o r a t o ry im p l e - m e n t a t i o n o f a r a p i d t h re e - s t a i n t e c h n i

26、 q u e f o r d e t e c t i o n o f m i c r o - o r g a n is m s fr o m lo w e r r e s p ir a t o ry s p e c i m e n s J . J C li n l a b A n a l , 1 9 9 6 , 1 0 ( 2 ) : 1 0 4 一 1 0 9 . 1 8 1 0 j R i g o l e R P , B a s s e t D , D e d e t J P . B io lo g i c a l d ia g n o s i s o f p n e u m o - c

27、y s t i s i n f e c t i o n . 。 伍i o r e s c e n t t e c E v a l u a t i o n a n d v a l u e o f a n e w d i r e c t i mm u n - h n iq u e J . P a t h o l B i o l P a r is , 1 9 9 7 , 4 5 0) : 1 9 2 3. C h a tt e rt o n J M, J o s s A W, P e n n i n g to n T H , e t a l . U s e fi il n e s s o f 1 9

28、 叫 r a t - d e r i v e d a n t i g e n i n t h e s e r o d i a g n o s i s o f P n e u m o c y s t i s i n f e c t i o n J . J M e d M i c ro b i o l , 1 9 9 9 , 4 8 ( 7 ) : 6 8 1 一 6 8 7 . 2 0 1 2 L u J J , C h e n C H , B a r t l e tt M S , e t a l . C o m p a r i s o n o f s i x d i ff e re n t P

29、 C R m e t h o d s f o r d e te c t io n o f P n ne u m o c y s t i s c a ri n i i J . J C li n M o c ro b i o l , 1 9 9 5 , 3 3 ( 1 0 ) : 2 7 8 5 、 2 7 8 8 . 1 3 S a n d h u G S , K li n e B C , E s p y M L e t a l . L a b o r a to ry d i a gn o s i s o f P n e u m o c y s ti s c a r in ii i n f e

30、c t i o n s 场P C R d ire c t e d t o g e n e s e n c o d - i n g f o r m it o c h o n d r i a l 5 S a n d 2 8 S r i b o s o m a l R N A J . D ia g n M i c ro b i o l I n f e c t D i s , 1 9 9 9 , 3 3 ( 3 ) : 1 5 7 一1 6 2 . 【 1 4 M e i Q , T u rn e r R E , S o ri a l V , e t a l . C h a r a c t e r i

31、z a t i o n o f m a j o r s u r f a c e g l y c o p ro t e m g e n e s o f h u m a n P n e u m o c y s t is c a r in i a n d h ig h - le v e l e x p r e s s i o n o f 。 c o n s e r v e d r e g io n J . I n f e c t I m m u n , 1 9 9 8 , 6 6 ( 9 ) : 4 2 6 8 4 2 7 3 . 1 5 A r m b r u s te r C , P o k i

32、e s e r L , H a s s l A , e t a l . D ia g n o s i s o f P n e u m o - c y s t i s c a r i n i i p n e u m o n i a 场b ro n c h o a l v e o l a r l a v a g e i n A I D S p a - t i e n t s . C o m p a r i s o n o f D i ff W k , f u n g i fl u o r s t a i n , d i re c t i m m u n - o f l u o re s c e n

33、 c e t e s t a n d p o l y m e r i s e c h a i n r e a c ti o n J . A c t s , C y - t o 1 , 1 9 9 5 , 3 9 ( 6 ) : 1 0 8 9 一1 0 9 3 . 【 1 6 M o o n e n s F , L ie s n a r d C , B r a n c a rt F , e t a l . R a p i d s i m p l e a n d n e s t e d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n f o r t h

34、 e d i a g n o s i s o f P n e u m o - c y s t is c a r i n ii p n e u m o n i a . S c a n d J I n f e c t D is J ， 1 9 9 5 , 2 7 ( 4 ) : 3 5 83 6 2. 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 l e i b o v i t z E , P o l l a c k H , M o o r e T , e t a l . C o m p a r i s o n o f P C R a n d s t a n d a r d c y to l 哈c a

35、l s ta in i n g f o r d e te c tio n o f P n e u m o c y s t i s c a ri - n ii fr o m re s p ir a t o ry s p e c i m e n s fr o m p a t i e n t s w i t h o r a t h i g h r i s k f o r in f e c t i o n b y h u m a n i m m u n o d e fi c ie n c y v ir u s J . J C li n M i - c r o b i o l , 1 9 9 5 , 3

36、 3 ( 1 1 ) : 3 0 0 4 一 3 0 0 7 . S a v o i a D , M i ll e s i m o M, C a s s e t t a 1 , e t a l . D e t e c t i o n o f P n e u m o - o y s t i s c a r i n i i 场D N A a m p l ifi c a t io n i n h u m a n im m u n o d e f c i e n c y v ir u s - p o s itiv e p a t ie n ts J ， D ia g n M ic r o b io l

37、 I n fe c t D is , 1 9 9 7 , 2 9 ( 2 ) : 6 1 一 6 5 . H e l w e g I .a r s e n J , J e n s e n J S , B e n fi e ld T , e t a l . D i a g n o s ti c u s e o f P C R f o r d e t e c t io n o f P n e u m o c y s t is c a r in i i i n o r a l w a s h s a m p l e s J . J C li n M i c r o b i o l , 1 9 9 8

38、 , 3 6 ( 7 ) : 2 0 6 8 一 2 0 7 2 . C a n w r i g h t C P , N e l s o n N A , G i ll V J 一 D e v e l e p m e n t a n d e v a l u a t i o n o f a r a p i d a n d s i m p l e p r o c e d u re f o r d e t e c t i o n o f P n e u m o c y s t i s c a r i n ii 场P C R J . J O li n M i c r o b i o l , 1 9 9

39、4 , 3 2 : 1 6 3 4 一 1 6 3 8 . O rt o n a E , M a r g u t t i P , T a m b u r ri n i E , e t a l . D e t e c t i o n o f P n e u - m o c y s t i s c a r i n i i i n re s p i r a t o ry s p e c i m e n s b y P C R - s o l u t i o n b y - b r i d i z a t io n e n z y m e - li n k e d im m u n o a s s a

40、 y J . J C li n M ic ro b io l , 1 9 9 7 , 3 5 ( 6 ) : 1 5 8 9 一1 5 9 1 . K o b a y a s h i M , U r a t a T , I k e z o e T , e t a l . S im p l e d e t e c ti o n o f th e S S r i b o s o m a l R N A o f P n e u m o c y s t i s c a r i n i i u s i n g i n s i t u b y b ri d i - s a t io n J . J c l

41、i n P a t h o l , 1 9 9 6 , 4 9 ( 9 ) : 7 1 2 、 7 1 6 . G r a v e s D C , C h a ry R e d d y S , B e c k e r H a p a k M . D e t e c ti o n o f P n e u m o c y s t i s c a r i n i i i n i n d u c e d s p u t a f r o m i m m u n o c o m p r o m i s e d p a t ie n t s u s i n g a re p e t i ti v e D N

42、 A p r o b e j . M o l C e ll P ro b e s , 1 9 9 7 , 1 1 ( 1 ) : 1 、 9 . A tz o r i C , A n g e li E , A g o s to n i F , e t a l . Ms g e n o t y p e s a n d b l o o d d is s e m in a t io n d u ri n g a c u t e P C P J . J E u k a r y o t M ic r o b io l , 1 9 9 7 , 4 4 ( 6 ) : 2 9 S . H a u s e r

43、 P M, B l a n c D S , B i ll e J , e t a l . D e v e l o p m e n t o f a m o l e c - u l a r t y p i n g m e th o d f o r P n e u m o c y s ti s c a r i n i i s p . f . h o m i n is J I ， A P M I S S u p p l , 1 9 9 7 , 7 7 : 7 一 1 0 . 收稿日 期2 0 0 1 - 0 6 - 1 3 启事 因 镇江医学院与江苏理工大学、 镇江师范专科学校合并成立江苏大学， 本刊刊名将相应地更改 为 江苏大学学 报 ( 医学版) 。同时， 原编辑部也将迁入江苏大学校本部办公。我们将一如既往地 热诚欢迎广大新老读者、 作者朋友积极投稿。 地址 邮编 江苏省镇江市丹徒路江苏大学学报医学版编辑部 2 1 2 0 1 3 万方数据